一种具有SEQIDNO.2序列的多肽以及具有强ADCC效应的抗体和应用的制作方法

一种具有seq id no.2序列的多肽以及具有强adcc效应的抗体和应用
1.本发明为申请号为2019110851737，申请日为2019年11月8日，发明名称为《一种多肽以及具有强adcc效应的抗体和应用》的原申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种具有seq id no.2序列的多肽以及具有强adcc效应的抗体和应用。


背景技术：

3.艾滋病是一种危害性极大的传染病，由感染艾滋病病毒(hiv病毒)引起。hiv是一种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免疫系统中最重要的cd4t淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能。
4.因此，人体易于感染各种疾病，并可发生恶性肿瘤，病死率较高。hiv在人体内的潜伏期平均为8～9年，患艾滋病以前，可以没有任何症状地生活和工作多年。
5.目前，还没有有效hiv
‑
1疫苗。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供多肽、多肽作为抗原在诱导产生具有强adcc效应的hiv抗体中的应用、制备具有强adcc效应的hiv抗体的方法、具有强adcc效应的抗体、靶向hiv的car
‑
t细胞、检测hiv病毒的试剂或试剂盒以及用于治疗艾滋病的药物。该多肽能够作为抗原，用于诱导产生具有强adcc效应的hiv抗体。
8.本发明是这样实现的：
9.第一方面，本发明实施例提供了一种多肽，所述多肽的氨基酸序列与seq id no.1
‑
3中的任意一种序列具有至少69％的一致性。该多肽能够作为抗原，用于诱导产生具有强adcc效应的hiv抗体。
10.在可选实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如下(a)
‑
(c)中的任一项所示：
11.(a)与seq id no.1具有至少69％的一致性的序列；
12.(b)与seq id no.2具有至少80％的一致性的序列；
13.(c)与seq id no.3具有至少87.5％的一致性的序列。具有诱导作用的seq id no.1
‑
3的序列保守性具体请参照附图1(根据hiv数据库分析的结果，ncbi blast)。图1中，d1对应seq id no.1所示序列，d2对应seq id no.2所示序列，d3对应seq id no.3所示序列。
14.在可选实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如下(d)所示：
15.(d)如式1所示；
16.式1：acvptdp
‑
x1
‑
pqevvlvnv；式1中，x1为p或n；
17.优选地，x1为p。
18.在可选实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如seq id no.1
‑
3中的任意一种所示。
19.第二方面，本发明实施例提供了如上述实施方式提供的多肽作为抗原在诱导产生具有强adcc效应的hiv抗体中的应用。
20.第三方面，本发明实施例提供了一种制备具有强adcc效应的hiv抗体的方法，其包括：以上述实施方式提供的多肽作为抗原免疫动物。
21.在可选实施方式中，所述动物选自兔子，老鼠，羊驼，牛，马和大骆驼中的一种或多种。
22.第四方面，本发明实施例提供了一种具有强adcc效应的抗体，其由上述实施方式提供的方法制得，或者其抗原表位为上述实施方式提供的多肽。
23.第五方面，本发明实施例提供了一种靶向hiv的car
‑
t细胞，其细胞膜表面具有上述实施方式提供的抗体或其scfv片段。
24.第六方面，本发明实施例提供了一种检测hiv病毒的试剂或试剂盒，其含有上述实施方式提供的抗体或上述任一实施方式提供的多肽。
25.第七方面，本发明实施例提供了一种用于治疗艾滋病的药物，其包括有上述实施方式提供的抗体或上述实施方式提供的car
‑
t细胞。
26.本发明具有以下有益效果：
27.本技术提供了一种多肽，该多肽的氨基酸序列与seq id no.1
‑
3中的任意一种序列具有至少69％的一致性，该多肽能够作为抗原，用于诱导产生具有强adcc效应的hiv抗体，能够为有效预防、诊断或治疗hiv提供一种途径。
28.此外，本发明实施例还提供了上述多肽作为抗原在诱导产生具有强adcc效应的hiv抗体中的应用、制备具有强adcc效应的hiv抗体的方法、具有强adcc效应的抗体、靶向hiv的car
‑
t细胞、检测hiv病毒的试剂或试剂盒以及用于治疗艾滋病的药物。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
30.图1为本发明的发明内容中如seq id no.1～seq id no.3所示序列的保守性；
31.图2为本发明实施例4提供的酵母展示的hiv
‑
1hxb2片段文库的构建的流程图；
32.图3为本发明实施例4提供的流式细胞仪对重组酵母细胞的测定结果1；
33.图4为本发明实施例4提供的流式细胞仪对重组酵母细胞的测定结果2；
34.图5为本发明实施例4提供的流式细胞仪对重组酵母细胞的测定结果3；
35.图6为本发明实施例4提供的阳性酵母克隆的igg序列用于针对全长hiv
‑
1hxb2 gp160的表位作图；
36.图7为本发明试验例1提供的抗原表位的抗体吸收消除的实验结果；
37.图8为本发明试验例2提供的采用抗原表位筛选记忆性b细胞的结果。
具体实施方式
38.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
39.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
40.实施例1
41.一种多肽，该多肽为抗原，该抗原的抗原表位包括如seq id no.1所示的第一表位。
42.实施例2
43.一种多肽，该多肽为抗原，该抗原的抗原表位包括如seq id no.2所示的第二表位。
44.实施例3
45.一种多肽，该多肽为抗原，该抗原的抗原表位包括如seq id no.3所示的第三表位。
46.实施例4
47.(1)血清igg抗体的纯化
48.材料和方法：
49.9个来自hiv
‑
1感染者的血浆样本。pbmc样本由中国疾病预防控制中心提供。样本捐赠者的pbmc由香港红十字会提供。这项研究获香港大学机构检讨委员会以及学术伦理委员会批准。
50.将血浆样品(香港红十字会)在56℃灭菌45分钟，然后10000g离心10分钟。取上清液通过0.2μm微孔滤膜过滤，过滤后将抗体蛋白加载到g
‑
sepharose柱上，g
‑
sepharose柱在使用前已与磷酸盐缓冲液(pbs)进行平衡。使用25倍柱体积pbs洗涤后，用0.5m醋酸(ph＝3.0)洗脱igg抗体，并立即与3m tris
‑
hcl(ph＝9.0)中和，并将缓冲液换为pbs。通过进行还原和非还原sds
‑
page凝胶，确认多克隆igg抗体纯度。
51.(2)酵母展示的hiv
‑
1hxb2片段文库的构建方法
52.请参照附图2，使用含有全长hiv
‑
1hxb2 gp160基因作为模板的重组质粒和一对引物p
‑
env
‑
f和p
‑
env
‑
r，通过pcr扩增编码全长hiv
‑
1hxb2gp160 dna。该引物还用于扩增其他hiv
‑
1gp160分离株，包括89.6，92ht，92v5037，bal，gxc44
‑
2，gxe44
‑
2，jrcsf，jrfl，r2，z2z6
‑
2。
53.将pcr扩增后的hiv
‑
1hxb2 gp160 dna进行凝胶纯化，然后将纯化后的hiv
‑
1hxb2 gp160 dna(2μg)用含1单位dnase i(roche)总体积为20μl的消化缓冲液(50mm tris
‑
hcl，ph7.5，10mm mncl2)在15℃下消化15分钟。消化后，通过加入edta终止反应至终浓度为50mm。在琼脂糖凝胶上分析消化产物，从凝胶中纯化大小为100bp至500bp的片段，并用t4 dna聚合酶(new england biolabs)平端化。将平末端dna片段连接到pcomb3x载体上，纯化并电转入tg1感受态细胞中，构建细菌hiv
‑
1hxb2 gp160表位片段文库。
54.将获得的hiv
‑
1hxb2 gp160表位片段文库进行凝胶纯化，并使用高保真dna聚合酶(invitrogen)和一对引物ydrdf和ydrdr进行pcr再扩增，以添加两个突出区域，用于与线性
化酵母展示质粒pyd7的进行同源重组。具体地，pcr再扩增的pcr体系为：在95℃下变性3分钟；95℃30秒，58℃30秒和72℃30秒，共20个循环；随后72℃延伸10分钟。
55.将插入有突出区域的再扩增pcr产物和线性化的pyd7质粒dna以3：1的比例(摩尔质量比)混合，并按照乙酸锂方法电穿孔到感受态酵母eby100细胞中，获得酵母展示文库。
56.具体地，电穿孔的方法包括：10ml稳定生长期的酵母菌株eby100接种到100ml ypd培养基中，37℃250rpm下培养4
‑
5小时，直到od600 nm达到1.6
‑
1.8。将细胞在4℃下2500g离心3分钟，以无菌去离子水洗涤三次，采用20ml电穿孔缓冲液(1m sorbital＝1mm cacl2)清洗一次。随后，在20ml liac缓冲液(0.1m liac 10mm dtt)中重悬酵母细胞，在30℃下孵育30分钟，不摇菌。弃去liac缓冲液，用冷电穿孔缓冲液清洗电池。
57.使用1ml电穿孔缓冲液重悬细胞，细胞密度为1.6
‑
2.0亿/毫升。在2mm含有dna/细胞混合物的比色皿中进行电击转化，电击的参数为：电压2.5kv、电脉冲25uf、电阻200ω。在30℃的ypd培养基中恢复1小时后，在sdcaa培养中培养再悬浮细胞，并在30℃过夜摇动，以进行重组选择。扩增后，将重组酵母细胞等分并保存在
‑
80℃下补充有15％甘油的sdcaa培养基(含有20g/升葡萄糖的酵母氮基casamino acids培养基)中。每个等分试样在1ml冷冻培养基中含有1亿个重组酵母细胞。
58.(3)酵母文库的筛选
59.诱导hiv
‑
1hxb2 gp160表位片段在酵母细胞表面上的表达：将步骤(2)中获得的重组酵母细胞在sdcaa培养基中于30℃生长一天，并用新鲜培养基传代一次以消除死细胞。然后将酵母细胞重悬于sgcaa培养基中至600nm的光密度(od600)为0.5～1.0，然后在20℃诱导36～48小时。
60.针对血清纯化的igg抗体进行分选：通过在4℃温育3
‑
4小时，首先用终浓度为500nm纯化的igg抗体(步骤(1)中得到的)对诱导的重组酵母细胞(步骤(2)得到的)进行染色。
61.用冷pbs洗涤3次后，将重组酵母细胞用缀合有山羊抗人igg[f(ab')2特异性]的pe和与小鼠抗c
‑
myc抗体缀合的fitc在4℃染色1小时。用冷pbs洗涤三次后，通过使用facsaria iii流式细胞仪(bd biosciences)测定染色后的重组酵母细胞，并对双阳性酵母群体进行分类和回收。
[0062]
pe
‑
和/或fitc
‑
标记的珠子和未染色的酵母用于在分选之前设定补偿。
[0063]
测定结果请参照附图3～图5，根据测定结果依次分为high adcc组(图3)、low adcc组(图4)和健康对照组(图5)，high adcc组5个结果都比较显著，图中，q2为酵母表达抗原epitope阳性，与病人血清结合也是阳性的百分数。low adcc组的2个特异性不好，不适合作为抗原使用。
[0064]
为了分选用不同血清纯化的多克隆igg抗体染色的重组酵母文库，使用相同的门。对于每种多克隆igg样品，分选5
×
105个酵母细胞。
[0065]
(4)抗原表位的确认
[0066]
从步骤(2)的每个分选的重组酵母文库中，使用酵母细胞质粒提取试剂盒(omega bio
‑
tek)提取重组酵母质粒，并电穿孔到大肠杆菌tg1电感受态细胞中。从每个分选的文库中挑选出200多个氨苄青霉素抗性克隆用于测序。酵母细胞中的插入内容(hiv
‑
1dna序列插入片段)由网站软件翻译(http：//in silico.ehu.es/translate/)。只有具有hiv
‑
1dna序
列插入片段和正确开放阅读框的重组克隆被认为是阳性的。
[0067]
阳性酵母克隆的igg序列用于针对全长hiv
‑
1hxb2 gp160的表位作图(hiv数据库登录号b.fr.83.hxb2_lai_iiib_bru_k03455)。长度小于4aa或同一性低于75％的插入片段不在分析中考虑。对于每种血清纯化的igg样品，鉴定了约150个有效阳性克隆。
[0068]
计算阳性克隆中存在的每种氨基酸的频率，并校准每个血清纯化的igg样品中相同的总数(每个样品中总数为5000个氨基酸)，请参照附图6。图6中，y轴代表拷贝数，x轴代表hiv
‑
1hxb2 gp140蛋白的氨基酸位置(共800 )，右面的标注代表sample名称，如polyclonal iggs my05，表示病人my05的血清里面的多克隆抗体。
[0069]
variable loops表示x轴最下数个字母，如v1
‑
v5代表hiv抗原的功能结构域，v1是loop1，v2是loop2，v4是loop4，v5是loop5，mr是gp41上的两个结构域，mr1是mhc related protein1，mr1是mhc related protein2。cd4bs是cd4 binding site。
[0070]
试验例1
[0071]
验证发明提供的抗原表位的功能。
[0072]
抗体吸收实验：取实施例4得到的表达hiv
‑
1hxb2 gp160表位片段的重组酵母细胞(108)，用pbs洗涤两次，通过以2000
×
g离心5分钟，将洗涤后的重组酵母细胞与源于自愿者的血清纯化的抗体的500μg igg在4℃下在pbs中以1ml的总体积温育，过夜。
[0073]
通过以2000
×
g离心5分钟沉淀重组酵母细胞，将上清液转移至108重组酵母细胞表面，并将混合物在室温下温育1小时。通过以2000
×
g离心5分钟沉淀酵母细胞，并将上清液收集在新管中。
[0074]
通过在第二轮消耗中转换表达抗原表位的重组酵母，然后用相同的重组酵母进行另一轮消耗来进行抗体的连续消除。然后，使用nanodrop装置测量od280，来确定耗尽的igg样品中抗体浓度，结果请参照附图7。
[0075]
图7中，x轴为样本名字，第一个是18号病人，igg18
‑
d1就是用18号病人d1抗原吸收抗体后剩下的血清做adcc实验，igg7944
‑
d1d2d3就是用7944号病人d1～d3吸收抗体后剩下来的血清做adcc，余请类推。这里一共用了3个病人的血清，分别是10,7944和p10。需要说明的是，在本实施例中，d1为seq id no.1所示的多肽，d2为seq id no.2所示的多肽，d3为seq id no.3所示的多肽。
[0076]
由附图7可知，被抗原基序吸附过的血清，不再具备诱导高adcc效应的功能。即用表达该抗原的酵母，与血清混合，吸附结合该motif的抗体，然后把酵母清除，则血清剩下的都是没有motif结合能力的抗体。
[0077]
试验例2
[0078]
抗原表位在筛选用于诱导强adcc效应的抗体中的应用。
[0079]
抗原的标记：从利用293f(thermal，r79007)细胞表达含有fc片段连接的抗原表位基序的质粒(pcdna
tm
3.1( ))，抗原表位分别包括实施例1～3提供的第一表位(d1)、第二表位(d2)和第三表位(d3)。
[0080]
然后采用镍柱纯化法纯化293f上清中的蛋白，用i3bs将蛋白稀释成0.5～2mg/ml，然后利用thermal公司的生物素(ez
‑
link
tm
sulf〇
‑
nhs
‑
lc
‑
biotin，21335)按照其试剂盒流程将抗原表位蛋白标记，将标记好蛋白分子用于筛选抗原特异性的记忆性b细胞，筛选结果请参照图8。
[0081]
综上，本技术提供了一种多肽，该多肽的氨基酸序列与seq id no.1
‑
3中的任意一种序列具有至少69％的一致性，该多肽能够作为抗原，用于诱导产生具有强adcc效应的hiv抗体，能够为有效预防、诊断或治疗hiv提供一种途径。
[0082]
此外，本发明实施例还提供了上述多肽作为抗原在诱导产生具有强adcc效应的hiv抗体中的应用、制备具有强adcc效应的hiv抗体的方法、具有强adcc效应的抗体、靶向hiv的car
‑
t细胞、检测hiv病毒的试剂或试剂盒以及用于治疗艾滋病的药物。
[0083]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。