一种基于Au/CdS/CdIn2S4的光电化学适配体传感器检测沙门氏菌的方法与流程

一种基于au/cds/cdin2s4的光电化学适配体传感器检测沙门氏菌的方法
技术领域
1.本发明属于食品安全检测领域，尤其是涉及一种检测食源性致病菌的半导体纳米生物传感器及其制备方法。


背景技术：

2.在世界范围内，随着人们对加工食品依赖程度的不断提高，致使全球食源性疾病的数量逐年增加。据统计，全世界每年有数亿人因食物污染而致病。其中，由微生物污染而引起的患者人数居于首位，是目前世界上最突出的健康卫生问题。近年来，我国食源性疾病的比例呈上升趋势，约有六分之一的人口患有食源性疾病。因此，食源性致病菌引起的食物中毒和食源性疾病已成为中国食品安全面临的首要问题。
3.食源性致病菌有几十种，其中沙门氏菌是最常见的食源性致病菌，沙门氏菌所引起的疾病，主要由食用遭受污染的食物导致，是许多国家食物中毒的重要病源。鉴于沙门氏菌造成的问题，亟需快速检测方法的开发。生物传感器作为新型的检测手段，具有方便、省时、精度高、设备简单、价廉，易于微型化等优点，并且数据的收集与处理也很简便，亦不会造成污染，可实现现场大通量样品的检测。有专利及文献报道，用电化学免疫传感、光纤生物传感器、荧光传感器、dna传感器等检测沙门氏菌，但目前由于检测环境的多样性和检测标准的不一致性，导致各类传感器的检测灵敏度和特异性产生了较大波动，并且没有合适的检测值确定方法和标准。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明结合传感器的快速性，以及适配体的特异性，建立了一种用于快速检测食源性致病菌的半导体纳米生物传感器方法。提出基于纳米金修饰cds复合 cdin2s4纳米材料修饰的生物传感器，利用光电转换材料的作用将光信号转换为电信号，通过检测致病菌尤其是沙门氏菌所引起的电流变化，用于高敏感性、高特异性的快速检测致病菌。本发明集合了电化学和光电化学二者的优点，采用不同形式的激发和检测信号，背景信号较低，灵敏度较高，有望在沙门氏菌快速检测领域得到良好的应用。
5.本发明完整的技术方案包括：
6.一种基于au/cds/cdin2s4的光电化学适配体传感器检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.步骤1、制备cds/cdin2s4纳米粒子；
8.a.在50ml乙二醇中制备四水合硝酸镉(cd(no3)2·
4h2o)和硫代乙酰胺的前驱体溶液，并以1:1的摩尔比例混合，然后使用磁力搅拌器剧烈搅拌40分钟。将获得的均相溶液转移到100ml反应釜中，保持在160℃反应12小时，自然冷却至室温。通过离心收集产物，用去离子水和乙醇洗涤2次以除去残留的有机溶剂和无机盐，然后在70℃下在空气中干燥8小时，研磨后得到cds粉体。
9.b.在70ml乙二醇中制备cd(no3)2·
4h2o，incl3.4h2o和硫代乙酰胺的前驱体溶液，并以1:2:4的摩尔比例混合，然后加入一定量步骤1a制备的cds粉末，使用磁力搅拌器剧烈搅拌40分钟。将获得的均相溶液转移到100ml反应釜中，保持在160℃反应12小时，然后自然冷却至室温。通过离心收集产物，用去离子水和乙醇洗涤2次以除去残留的有机溶剂和无机盐，然后在70℃下在空气中干燥8小时，研磨后置于300℃的马弗炉中煅烧2h，随炉自然冷却至室温后再次研磨所得到的产物为cds/cdin2s4粉体。
10.步骤2、制备纳米金溶液
11.将98ml去离子水加入双颈烧瓶中，再加入2ml浓度为50mmol/l的haucl4溶液使最终haucl4溶液的浓度为1mmol/l；将冷凝器、玻璃塞分别连接到双颈烧瓶的两个颈上，在 120℃的油浴锅中边搅拌边回流；当溶液开始回流时，取下玻璃塞迅速加入10ml浓度为 38.8mmol/l的柠檬酸钠溶液，使溶液颜色在1min内由浅黄色变为酒红色，随后继续回流20min，最后关闭加热源使其在搅拌中冷却至室温，存放4℃冰箱中以备待用；
12.步骤3、制备辣根过氧化物酶(hrp)
‑
cdna复合物
13.取5μl 100μmol/l的cdna，然后将其加入到1ml的5mmol/l pbs缓冲液。继续往该pbs中加入50μl 1mg/ml的hrp，孵育1h，于12000rpm离心分离，去除未结合的hrp，用5mmol/l pbs清洗沉淀，并将清洗过的沉淀重新分散在含有0.1％牛血清白蛋白(bsa) 的5mmol/l pbs中，4℃保存，备用。
14.步骤4、构建传感器工作电极
15.a.称取一定量的步骤1b制备的cds/cdin2s4样品，加入2ml去离子水配置成一定浓度的cds/cdin2s4溶液，常温下磁力搅拌30min，在40℃条件下超声溶解30min，之后在研钵中研磨30min使cds/cdin2s4粉体形成均匀的悬浮液，无细小颗粒感；取25μl所述的均匀悬浮液滴涂于fto电极上，在常温无风处自然干燥，然后300℃条件下煅烧2h，煅烧完毕后样品随炉自然冷却，得到cds/cdin2s4/fto电极；
16.b.将20μl制备好的纳米au溶液滴涂到cds/cdin2s4/fto电极表面，然后用玻璃棒涂匀，干燥后得到au/cds/cdin2s4/fto电极；随后将20μl一定浓度的沙门氏菌适配体溶液滴涂到得到的au/cds/cdin2s4/fto电极表面，在4℃下孵化过夜；适配体与au nps通过au
‑
s 键的强相互作用力牢牢固定在了au nps的表面，用tris
‑
hcl缓冲液冲洗电极表面去除未被固定的适配体分子，得到aptamer/au/cds/cdin2s4/fto电极。之后取20μl步骤3制备的hrp
‑
cdna复合物溶液滴涂到aptamer/au/cds/cdin2s4/fto电极表面，在4℃下孵化过夜； hrp
‑
cdna复合物与aunps通过au
‑
s键的强相互作用力牢牢固定在了au nps的表面，用 tris
‑
hcl缓冲液冲洗电极表面，去除未被固定的适配体分子，得到hrp
‑
cdna/aptamer/au/ cds/cdin2s4/fto电极。
17.步骤5、构建光电化学适配体传感器用于沙门氏菌的检测
18.将步骤4b制备的hrp
‑
cdna/aptamer/au/cds/cdin2s4/fto电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为辅助电极，分别置于pbs溶液中构建三电极体系，aa(抗坏血酸)作为电子供体，氙灯作为光源，构建基于au/cds/cdin2s4的的光电化学适配体传感器，用于沙门氏菌的检测。
19.步骤1b中，cds纳米颗粒复合在cdin2s4纳米片上，cds与cdin2s4最适配比为1:1。
20.步骤4a中，cds/cdin2s4浓度为20～40mg/ml(指“称取一定量的步骤1b制备的 cds/
cdin2s4样品，加入2ml去离子水配置成一定浓度的cds/cdin2s4溶液”的浓度)；步骤4b 中，沙门氏菌适配体溶液浓度为1～5μmol/l。
21.步骤5中，检测的食源性致病菌为沙门氏菌，但不局限于沙门氏菌。
22.有益效果：本发明制备了纳米金修饰cds复合cdin2s4纳米材料修饰到fto，构建出半导体纳米生物传感器用于检测食源性致病菌，其优点以及特色如下：
23.(1)一定比例的cds复合cdin2s4，复合效应拓宽了光谱范围，提高了光电流响应能力。
24.(2)通过食源性致病菌与其适配体的特异性结合，大大提高了实验的准确性以及特异性。
25.(3)提出的检测标准方法能够迅速灵敏且低成本确定沙门氏菌的浓度含量，相对现有技术检测快、具有良好的线性响应特征以及良好的特异性。
26.(4)通过纳米材料、适配体及hrp修饰的信号放大策略，大大提高了光电流响应信号。
27.(5)基于半导体纳米材料的光电化学适配体传感器，集合了电化学和光电化学二者的优点，采用不同形式的激发和检测信号，背景信号较低，灵敏度较高。
28.(6)半导体纳米生物传感器具有检测速度快、成本低廉、潜在的便携性等优点，该检测技术有望在食源性致病菌快速检测领域得到良好的应用。
附图说明
29.图1为本发明传感器工作电极构建过程示意图。
30.图2为修饰不同物质的工作电极光电流图，图中a：cdin2s4/fto，b： cds/cdin2s4/fto，c：au/cds/cdin2s4/fto，d：aptamer/au/cds/cdin2s4/fto，e：hrp
‑ꢀ
cdna/aptamer/au/cds/cdin2s4/fto，f：fpb/hrp
‑
cdna/aptamer/au/cds/cdin2s4/fto。
31.图3(a)为不同浓度沙门氏菌(fpb)的光电流响应图；图3(b)为检测fpb的验证结果(图中a
→
f：2.4
×
102→
2.4
×
107cfu/ml)。
32.图4为基于au/cds/cdin2s4的光电化学适配体传感器对沙门氏菌检测的特异性结果图。
具体实施方式
33.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。如图1所示，本发明光电化学适配体传感器工作电极的构建过程，包括在fto电极表面依次修饰cdin2s4、cds、au、aptamer、 cdna
‑
hrp、fpb(此具体实施例以沙门氏菌为例)，获得生物传感器工作电极，具体步骤如下：
34.步骤1、制备cds/cdin2s4纳米粒子
35.a.在50ml乙二醇中制备cd(no3)2·
4h2o和硫代乙酰胺的前驱体溶液，并以1:1的摩尔比例混合，然后使用磁力搅拌器剧烈搅拌40分钟。将获得的均相溶液转移到100ml反应釜中，在160℃反应12小时，然后自然地冷却至室温。通过离心收集产物，用去离子水和乙醇洗涤2次以除去残留的有机溶剂和无机盐，然后在70℃下在空气中干燥8小时。研磨后得到 cds粉体。
36.b.在70ml乙二醇中制备cd(no3)2·
4h2o，incl3.4h2o和硫代乙酰胺的前驱体溶液，并以1:2:4的摩尔比例混合，然后加入等摩尔比的cds粉末使用磁力搅拌器剧烈搅拌40分钟。将获得的均相溶液转移到100ml反应釜中，在160℃反应12小时，然后自然地冷却至室温。通过离心收集产物，用去离子水和乙醇洗涤2次以除去残留的有机溶剂和无机盐，然后在70℃下在空气中干燥8小时，研磨后置于300℃的马弗炉中煅烧2h，随炉自然冷却至室温后再次研磨所得到的产物为cds/cdi
n2
s4粉体。
37.步骤2、制备纳米金溶液
38.将98ml去离子水加入双颈烧瓶中，再加入2ml浓度为50mmol/l的haucl4溶液使最终haucl4溶液的浓度为1mmol/l；将冷凝器、玻璃塞分别连接到双颈烧瓶的两个颈上，在 120℃的油浴锅中边搅拌边回流；当溶液开始回流时，取下玻璃塞迅速加入10ml浓度为 38.8mmol/l的柠檬酸钠溶液，使溶液颜色在1min内由浅黄色变为酒红色，随后继续回流20min，最后关闭加热源使其在搅拌中冷却至室温，存放4℃冰箱中以备待用。
39.步骤3、制备hrp
‑
cdna复合物
40.取5μl 100μmol/l的cdna，然后将其加入到1ml的5mmol/l pbs。继续往该pbs 中加入50μl 1mg/ml的hrp，孵育1h，于12000rpm离心分离，去除未结合的hrp，用5 mmol/l pbs清洗沉淀，并将清洗过的沉淀重新分散在含有0.1％bsa的5mmol/l pbs中， 4℃保存，备用。
41.步骤4、构建生物传感器工作电极并用于沙门氏菌的检测
42.(1)称取0.08g的cds/cdin2s4粉末，加入2ml去离子水配置浓度为40mg/ml的 cds/cdin2s4溶液，常温下磁力搅拌30min，在40℃条件下超声溶解30min，之后在研钵中研磨30min使cds/cdin2s4粉体形成均匀的悬浮液，无细小颗粒感；取25μl所述的均匀悬浮液滴涂于fto电极上，在常温无风处自然干燥，然后300℃条件下煅烧2h，煅烧完毕后样品随炉自然冷却，得到cds/cdin2s4/fto电极；
43.(2)将20μl制备好的au nps溶液滴涂到cds/cdin2s4/fto电极表面，然后用玻璃棒涂匀，干燥后得到au/cds/cdin2s4/fto电极；
44.(3)将20μl 3μmol/l的沙门氏菌适配体溶液滴涂到得到的au/cds/cdin2s
4/
fto电极表面，在4℃下孵化过夜；适配体与aunps通过au
‑
s键的强相互作用力牢牢固定在了au nps 的表面，用tris
‑
hcl缓冲液冲洗电极表面去除未被固定的适配体分子，得到了aptamer/au/ cds/cdin2s4/fto电极；
45.(4)取20μl hrp
‑
cdna复合物溶液滴涂到得到的aptamer/au/cds/cdin2s4/fto电极表面，在4℃下孵化过夜；hrp
‑
cdna复合物与aunps通过au
‑
s键的强相互作用力牢牢固定在了au nps的表面，用tris
‑
hcl缓冲液冲洗电极表面去除未被固定的适配体分子，得到了 hrp
‑
cdna/aptamer/au/cds/cdin2s4/fto电极。
46.(5)最后在hrp
‑
cdna/aptamer/au/cds/cdin2s4/fto电极上分别滴加20μl不同浓度的沙门氏菌，在4℃的条件下孵育1小时，用pbs缓冲液冲洗后，将该工作电极插入电解池中，使电解池中aa浓度为0.13mol/l，pbs溶液ph值为7.4，进行光电流检测。
47.本发明同时公开了一种利用所制备的光电化学适配体传感器进行沙门氏菌的检测方法，在检测过程中，通过对于各种不同检测条件下的检测灵敏度和特异性结果进行大数据采集和分析，本发明人发现，检测时的菌液浓度、检测液ph值以及当时的光照条件均对检测灵敏度有不同程度的影响，通过对各个因素进行分析计算后，为了保证检测灵敏性特
异性和检测成本的平衡，本发明提出如下的沙门氏菌含量确定方法：
48.△
i＝11.31logc
‑
14.843
49.式中，
△
i为检测时的光电流变化值，单位为毫安，c为沙门氏菌浓度，单位为cfu/ml，优选范围为2.4
×
102‑
2.4
×
107cfu/ml。
50.此外，为了得到更好的检测结果，本发明还限定检测液ph值为7.2～7.8，优选为7.4，氙灯光源照射时的功率为500w。
51.光电化学适配体传感器灵敏性检测结果验证：
52.将所制备的生物传感器用于沙门氏菌的灵敏性检测，步骤如下：
53.(1)配制102‑
107cfu/ml浓度梯度的沙门氏菌菌液；
54.(2)取步骤(1)所配制的沙门氏菌菌液滴加至工作电极表面；
55.(3)所制备的电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为辅助电极，分别置于pbs溶液中构建三电极体系，ph＝7.4，加入0.13m aa，500w氙灯光源照射进行光电化学分析，i
‑
t图像为实验依据，如图3所示。当采用
△
i＝11.31logc
‑
14.843的方法对沙门氏菌含量浓度进行确定时，光电流的变化响应与沙门氏菌浓度的对数存在良好的线性依赖关系，尤其是当沙门氏菌浓度为2.4
×
102‑
2.4
×
107cfu/ml范围之间时，检测限(lod，检测最小灵敏度)为25cfu/ml，检测的准确度和灵敏度都显著高于现有技术。
56.特异性实验结果验证：
57.将所制备的光电化学适配体传感器用于特异性实验：将滴加沙门氏菌，分别改为滴加单增李斯特菌(b)、金黄色葡萄糖菌(c)、肠杆菌(d)，并以生理盐水(a)作为空白对照。如图4所示，与空白溶液相比，2.4
×
104cfu/ml沙门氏菌(e)溶液的光电流强度显著降低，而李斯特菌、金黄色葡萄糖菌和肠杆菌的光电流强度基本与空白溶液差别不大。由此可见所构建的适配体传感器用于检测fpb有着优于现有技术的选择性和特异性。
58.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。