一种快速筛查生鲜乳中乳清掺假的方法与流程

1.本发明涉及一种拉曼光谱结合化学计量学快速筛查生鲜乳中乳清的方法，属于生鲜乳掺假检测技术领域。


背景技术：

2.牛奶存在于世界各地不同国家和文化的人们的日常食物中，是一种营养丰富的农产品。根据联合国粮食及农业组织(fao)公布的数据，2019年世界牛奶产量约为1.74亿吨，其中、巴西、印度、美国、德国和俄罗斯是世界六大牛奶生产国，这些国家的平均年产量都在3万吨以上。然而，牛奶(生鲜乳)往往是不同类型掺假的目标，目的是增加产品体积从而增加产品的经济效益，或是增加产品的蛋白质、脂肪含量，甚至掩盖使其不适合食用的因素，从而将不合格的产品出售给消费者。常见的掺假物质有水、碳酸钠、麦芽糊精、淀粉、过氧化氢、尿素、三聚氰胺和许多其他物质，如奶酪制作过程中产生的乳清。添加乳清是一种有效的掺假方式，可以在不显著改变生鲜乳本身感官特性的情况下增加脂肪含量及提高产量，而且不被乳成分分析仪检测出。
3.生鲜乳中掺假乳清的检测通常是通过高效液相色谱(hplc)分析酪蛋白巨肽(cmp)来实现的，cmp是凝乳酶在奶酪生产过程中释放的一种肽。此外，紫外光谱、毛细管电泳、液相色谱串联质谱、中红外光谱和拉曼光谱也被用于乳清掺假的检测。然而，除了拉曼光谱以外的其他方法通常都需要复杂的样品制备，包括使用有机溶剂沉淀蛋白质、离心、浓缩和过滤等步骤。同时，生鲜乳和乳清在物理和化学性质上有很大的相似之处，因此在生鲜乳中掺入乳清很难检测。因此，亟需开发一种无需样品制备即可快速测定生鲜乳中乳清添加量的方法，从而降低检测成本以及实现户外快速筛查分析。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是：如何快速检测生鲜乳中乳清掺假。
5.为了解决上述问题，本发明提供了一种快速筛查生鲜乳中乳清的方法，包括以下步骤：
6.步骤s1：取待测样品于液体测样板上，对焦后于50
‑
3500cm
‑1范围内获取拉曼光谱，选择不同位置的n个点采集，每个点采集m次拉曼信号取平均光谱为样品的拉曼图谱；
7.步骤s2：对采集步骤s2中的拉曼光谱进行平滑降噪处理；
8.步骤s3：用主成分分析(pca)进行离群点检测，离群点即为未掺假生鲜乳样品；
9.步骤s4：基于回归系数的阈值对全拉曼光谱数据进行筛选，最终得到最佳波长点用于预测乳清含量模型的建立；
10.步骤s5：利用步骤s4中的模型生成残差图，判断鲜乳中的乳清含量。
11.优选地，所述步骤s1中拉曼光谱的获取条件为：激光功率10
‑
50mw，激光扩束器直径5
‑
10mm，拉曼采集时间3
‑
5s/次。
12.优选地，所述步骤s1中获取拉曼光谱时，待测样品的温度为25
±
5℃。
13.优选地，所述步骤s2中的平滑降噪处理采用窗口平均化对光谱进行预处理。
14.优选地，所述步骤s4中回归系数的阈值的计算公式为：
[0015][0016]
式中，n为输入的样本数量，c为波长个数，s
ij
为第i个样本的第j个波长处的回归系数；将回归系数低于所述阈值的点去掉，即为最佳波长点。该步骤利用偏最小二乘学习到各个波长点对校正模型的回归系数，并将回归系数均值作为阈值，去除系数低于阈值的波长点，以达到波长选择的目的。
[0017]
优选地，所述步骤s4中的预测乳清含量模型为采用pls回归分析建立预测乳清含量的模型。在拉曼光谱中，光谱信息和预测成分之间在某些波段不存在特定的相关关系，除此之外，各个波长点之间也存在严重的多重共线性。如果采用全光谱数据进行建模，不仅会增加校正模型的复杂性，而且其中一些噪声变量还会降低模型的预测能力。利用选定的波长点或波长区间而不是全光谱数据进行建模可以有效的提高校正模型的性能。
[0018]
更优选地，所述预测乳清含量模型使用simca 14.1软件和matlab 2019b进行多元统计分析后建立。
[0019]
本发明提供的快速筛查生鲜乳中乳清掺假的方法测定快速、操作简单、高效准确。此外利用手持式拉曼光谱仪，采用本发明的方法可以方便的实现现场、户外生鲜乳中乳清含量的实时、快速、准确测定。
[0020]
本发明与现有技术相比，有益效果在于：
[0021]
1)本发明提出了基于偏最小二乘的拉曼光谱波长选择方法，利用拉曼光谱和偏最小二乘建立回归模型定量生鲜乳中乳清的存在。该方法利用偏最小二乘学习到各个波长点对校正模型的回归系数，并将回归系数均值作为阈值，去除系数低于阈值的波长点，以达到波长选择的目的，对于简化校正模型和提高校正模型的性能具有重要的实际意义；
[0022]
2)利用该方法得到的光谱建立的校正模型，相比于全光谱数据，降低了模型的复杂性和提高了模型的稳定性；不需要样品制备的任何步骤，测定过程简单、快速，是一种快速且经济有效的方法，具有很好的实际应用价值。
附图说明
[0023]
图1为添加12种乳清浓度的生鲜乳样品的拉曼光谱；
[0024]
图2为不同掺假浓度的pca得分图；
[0025]
图3为所有变量在pls分析时的vip得分图；
[0026]
图4为乳清含量预测模型(pls)的相关图；
[0027]
图5为乳清含量预测模型(pls)的残差图；
[0028]
图6为光谱点对乳清预测模型(pls)的系数图；
[0029]
图7为采用乳清预测模型(pls)检测盲样时预测值与真实值之间的残差图。
具体实施方式
[0030]
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
[0031]
实施例1：不同浓度掺假乳清样品的制备
[0032]
生鲜乳样品采集自上海乳品四厂，出厂时生鲜乳的蛋白质、脂肪及碳水化合物等指标均符合标准。
[0033]
在1.5l的混合生乳中加入2ml液体凝乳剂，在40℃下孵育40min，然后缓慢而持续地搅拌30min。然后，把凝乳切成方块，搅拌，用手轻轻按压。将奶酪块缓慢而持续地移动30min，用筛子过滤并收集乳清。最后，将乳清在100℃下孵育5min，然后将其用于制备掺假样品。在生鲜乳中添加不同比例的乳清制备了12种浓度的掺假样品：乳清的质量分数0.00％、1.79％、4.42％、7.14％、11.36％、14.40％、16.53％和20.51％作为校准集，2.55％、9.18％、12.04％和16.53％作为验证集。
[0034]
实施例2：不同浓度乳清掺假样品的拉曼光谱采集
[0035]
使用dxr激光显微拉曼光谱仪进行奶样检测，取适量样品于液体测样板上，对焦后于50
‑
3500cm
‑1范围内获取拉曼光谱，采集时间5s/次，激光器为532nm dpss激光器，功率为10mw，激光扩束器直径为5mm，选择不同位置的3个点采集，每个点采集6次所得平均谱图，即得到添加不同浓度的乳清样品拉曼光谱图(见图1)。图1显示了12种浓度、36个样品拉曼光谱的集合。由于生鲜乳和乳清的化学成分相似，两者的拉曼光谱没有明显的差异。观察光谱图并不能清楚地区分纯乳和添加乳清的生鲜乳之间的区别，因此需要结合化学计量学方法处理光谱之间微小的变化。
[0036]
实施例3：光谱预处理及变量筛选
[0037]
光谱预处理包括除去原始数据50
‑
3500cm
‑1之间没有峰出现的区域，将光谱的范围缩小到1000
‑
3000cm
‑1，并去除噪声和背景的干扰；在使用simca14.1进行统计分析之前，首先对拉曼光谱进行平滑处理，比较了窗口平均化、高斯平滑、中值滤波和savitzky
‑
golay几种平滑处理对pls预测模型的影响，最终得出窗口平均化处理后预测模型性能最好。
[0038]
使用主成分分析(pca)对数据进行分析，图2是不同掺假浓度的pca得分图，从图可知36个掺假样品没有出现异常值。主成分分析表明，乳清含量沿t[1]轴从左向右有递增的趋势，因此pca结合偏最小二乘法(pls)可以用于生鲜乳中乳清掺假的定量分析。
[0039]
在进行pls分析时，以拉曼光谱信号强度为自变量x，乳清浓度为因变量y组成的数据矩阵进行回归分析。原始光谱在100～1000cm
‑1波段无明显的波峰，所以实验选择了1000
‑
3000cm
‑1波段进行分析。图3展示了拉曼光谱位移在1000
‑
3000cm
‑1之间每个变量的vip得分，vip得分是变量在pls模型中重要性的度量，它代表一个变量对pls模型的贡献，小于0.8的vip值通常被认为是较小的。因此，从数据矩阵中删除vip得分小于0.8的变量，最终筛选出对模型贡献最大的180个光谱点作为自变量进行建模。贡献最大的光谱点对乳清定量模型的回归系数如图6所示，利用式ⅰ计算出回归系数的阈值，将系数低于阈值的点去掉，最终选择了90个波长点用于建模。
[0040][0041]
实施例4pls建模结果
[0042]
图4所示为pls预测值与真实值之间的关联图，校正和验证集的r2均大于0.9。残差表示真实值和从预测模型获得的预测值之间的差异，图5的残差图显示了数据的随机分布，残差没有随着浓度的变化而增加或减少趋势，这符合统计学中对残差随机分布的要求，可
知这个模型调整得很好。
[0043]
表1给出了用于评估回归的可靠性和模型性能的一些统计参数，对比了分别用筛选的90个光谱点与全拉曼光谱所建立的模型性能，总结了偏最小二乘法的优化情况。90个波长点建立的模型的均方根误差(rmse)和预测均方根误差(rmsep)均小于全拉曼光谱数据建立的模型，证明90个波长点建立的模型优于全拉曼光谱数据所建立的模型。在95％的置信区间下，durbin
‑
watson检验的p值大于0.05，表明在残差分布上pls
‑
raman方法的预测值与真实值之间没有相关性，该模型得到了很好的调整。此外，在95％置信区间下，对验证样本集进行的配对t检验p值大于0.05，pls模型的预测值与真实值之间没有统计学上的差异。相对分析误差(rpd)值表明，所建立的pls
‑
raman预测模型的性能是优异的。
[0044]
表1用于评估回归的可靠性和模型性能的统计参数
[0045][0046][0047]
实施例5：乳清掺假预测模型的应用
[0048]
制备21个含不同浓度乳清的生鲜乳样品作为盲样，使用dxr激光显微拉曼光谱仪进行奶样检测，取适量样品于液体测样板上，对焦后于50
‑
3500cm
‑1范围内获取拉曼光谱，采集时间5s/次，激光器为532nm dpss激光器，功率为10mw，激光扩束器直径为5mm，选择不同位置的3个点采集，每个点采集6次所得平均谱图，即得到添加不同浓度的乳清样品拉曼光谱图。将采集到的拉曼光谱数据从excel数据格式导入到matlab r2019b统计分析软件，编写相应代码程序，结合优化好的pls模型进行乳清含量预测，用于定量生鲜乳中乳清含量，预测结果的残差图如图7所示，乳清含量等于横坐标是真实值，加上残差就是盲样的预测值。