一种香蕉胚挽救的方法与流程

1.本发明涉及植物育种技术领域，特别涉及一种香蕉胚挽救的方法。


背景技术：

2.胚挽救是指对由于营养或生理原因造成的难以播种成苗或在发育早期阶段就败育、退化的胚进行早期分离培养成苗的过程。该技术在培养早熟品种、无核品种、克服远缘杂交、培育三倍体及其它多倍体新种质等方面有着广泛的应用，如专利cn109479704a《一种早熟蟠桃胚挽救的方法》、专利cn101564011a《一种欧亚种无核葡萄高效育种方法》、专利cn112470920a《一种通过幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法》和专利cn111264386a《一种通过杂交和胚挽救相结合创造水稻三倍体的方法》。胚挽救技术的应用不仅克服了胚败育问题，还缩短了育种周期，在植物育种中发挥了重要作用。
3.香蕉由于遗传背景和倍性复杂，自然情况下种子生成量少、且萌发率极低，严重影响杂交育种技术在香蕉育种方面的应用。由于香蕉是典型的呼吸跃变型水果，需在成熟前摘取果实，但香蕉未成熟果实的果肉为坚硬的淀粉，难以将果肉和种子完全分离，导致种子表面灭菌不彻底，污染率高。目前香蕉种子发育过程的研究比较少，关于香蕉的胚挽救成苗技术也较少见报。
4.本文以常见的两个香蕉现代栽培种的两个重要祖先种和常见的二倍体香蕉野生型为材料，对香蕉胚胎挽救技术进行细致的探索。


技术实现要素：

5.鉴以此，本发明提出一种香蕉胚挽救的方法，解决香蕉种子育种的萌发率低、污染率高的问题。
6.本发明的技术方案是这样实现的：
7.一种香蕉胚挽救的方法，包括以下步骤：
8.s1.授粉：收集香蕉雄花花蜜，进行人工授粉；
9.s2.外植体处理：取授粉后第35～45d的香蕉果实，用乙烯利处理香蕉果实后，剥取种子，灭菌；
10.s3.胚挽救培养：去除种子表面附着的水后，剥取种子胚，将种子胚接种到胚胎挽救培养基中，避光培养3～4周，诱导成苗；所述胚挽救培养基为ms iaa 0.1～0.3mg/l 6
‑
ba 1～3mg/l da
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6 0.14～0.18mg/l，ph为5.5～6。
11.优选的，所述香蕉为基因型aa的野生香蕉、基因型bb的野生香蕉、如前所述两种野生香蕉的亚种间杂交种和种间杂交种中的一种。
12.优选的，所述收集香蕉雄花花蜜的方法为于每天上午，在香蕉雄花花梳展开后，用移液器吸取雄花花萼基部分泌的蜜腺，在无菌环境下，将收集到的花蜜过0.22μm孔径的细菌过滤器，向过滤后的花蜜加入碘盐，保存备用，用该方法获取的香蕉雄花花蜜进行授粉，可提高授粉率。
13.优选的，所述碘盐的加入量为每100g花蜜加入1～2g碘盐。
14.优选的，步骤s2中，所述香蕉果实为授粉后第40d的香蕉果实。
15.优选的，所述乙烯利处理香蕉果实为将40％乙烯利稀释400倍后涂抹在香蕉果实的果柄处或者用稀释750倍的40％乙烯利浸泡果实3～5min后，取出风干，然后静置1～2d，因香蕉种子具有表面疣点和沟回结构，容易夹带果肉，难以彻底灭菌，胚挽救培养的污染率高，使用该方法处理香蕉果实，能够让种子易与果肉分离，利于灭菌，且不影响胚活力，让香蕉果实自然成熟或用过其他浓度的乙烯利处理都会导致香蕉果实成熟时间过长，种子胚活力下降或种子坏死智组织解体等现象，不利于胚挽救培养。
16.优选的，所述剥取种子为去除香蕉果皮，挤压果肉，获得夹带果肉的种子，用60～80℃的热水浸湿布，再用布包裹夹带果肉的种子，静置1～2min，搓洗种子，将种子和果肉完全分离。
17.优选的，所述灭菌为先用体积浓度70％乙醇处理30s，再用质量浓度10％的次氯酸钠处理5～6min或质量浓度1％的升汞溶液处理2～3min，最后再用无菌水冲洗3次，每次冲洗1～1.5min。
18.优选的，所述剥取种子胚为沿种子种脐边沿切开种子，从种脐下方的空腔剥离出种子胚，用该方法可剥取出幼嫩的种子胚，可提高胚挽救成活率。
19.优选的，所述避光培养的温度为25～30℃。
20.优选的，本发明还提供了所述香蕉胚挽救的方法在香蕉杂交育种中的应用。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22.本发明的香蕉胚挽救的方法，选用授粉后第35～45天的香蕉果实进行胚挽救培养，该时期种子胚的胚活力较高，且种子内部填充物呈冻状，能够有效降低操作过程的污染，提高胚挽救成苗率，再采用乙烯利处理香蕉果实，在不影响胚活力的情况下，使种子能够与果肉完全分离，降低胚挽救培养的污染率。
23.本发明采用添加了iaa、6
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ba和da
‑
6的ms培养基进行避光培养，可减少胚褐化率，提高胚挽救成苗率。
24.本发明的方法，具有操作简单、授粉率高、胚挽救成苗率高、污染率低等特点，解决了香蕉种子育种中萌发率低、污染率高等的问题，对香蕉杂交育种技术具有重要意义。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
26.图1为本发明实施例1胚挽救不同时期的种子胚；
27.图2为本发明试验例不同杂交组合的香蕉果实的胚挽救幼苗；
具体实施方式
28.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
29.本发明以下实施例使用的香蕉材料均为itc0545(bb)野生香蕉；
30.实施例1
31.一种香蕉胚挽救方法，包括以下步骤：
32.s1.授粉：于每天上午，在香蕉雄花花梳展开后，用移液器吸取雄花花萼基部分泌的蜜腺，在无菌环境下，将收集到的花蜜过0.22μm孔径的细菌过滤器，每100g过滤后的花蜜加入1.2g的碘盐，进行人工授粉；
33.s2.外植体处理：取授粉后第40d的香蕉果实，将40％乙烯利稀释400倍后涂抹在香蕉果实的果柄处，静置1～2d后，去除香蕉果皮，挤压果肉，获得夹带果肉的种子，用75℃的热水浸湿布，再用布包裹夹带果肉的种子，静置1～2min，搓洗种子，将种子和果肉完全分离，先用体积浓度70％乙醇处理30s，再用质量浓度10％的次氯酸钠处理5～6min，最后再用无菌水冲洗3次，每次冲洗1min；
34.s3.胚挽救培养：去除种子表面附着的水后，用解剖刀沿种子种脐边沿切开种子，从种脐下方的空腔剥离出种子胚，将种子胚接种到胚胎挽救培养基中，在28℃下避光培养4周，诱导成苗；所述胚挽救培养基为ms iaa 0.3mg/l 6
‑
ba 3mg/l da
‑
6 0.14mg/l，ph为5.5。
35.实施例2
36.一种香蕉胚挽救方法，包括以下步骤：
37.s1.授粉：于每天上午，在香蕉雄花花梳展开后，用移液器吸取雄花花萼基部分泌的蜜腺，在无菌环境下，将收集到的花蜜过0.22μm孔径的细菌过滤器，每100g过滤后的花蜜加入2g的碘盐，进行人工授粉；
38.s2.外植体处理：取授粉后第45d的香蕉果实，用稀释750倍的40％乙烯利浸泡果实3～5min后，取出风干，静置1～2d后，去除香蕉果皮，挤压果肉，获得夹带果肉的种子，用60℃的热水浸湿布，再用布包裹夹带果肉的种子，静置1～2min，搓洗种子，将种子和果肉完全分离，先用体积浓度70％乙醇处理30s，再用质量浓度1％的升汞溶液处理2～3min，最后再用无菌水冲洗3次，每次冲洗1.5min；
39.s3.胚挽救培养：去除种子表面附着的水后，用解剖刀沿种子种脐边沿切开种子，从种脐下方的空腔剥离出种子胚，将种子胚接种到胚胎挽救培养基中，在30℃下避光培养3周，诱导成苗；所述胚挽救培养基为ms iaa 0.1mg/l 6
‑
ba 1mg/l da
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6 0.16mg/l，ph为5.8。
40.实施例3
41.一种香蕉胚挽救方法，包括以下步骤：
42.s1.授粉：于每天上午，在香蕉雄花花梳展开后，用移液器吸取雄花花萼基部分泌的蜜腺，收集花蜜，取收集到的花蜜进行人工授粉；
43.s2.外植体处理：取授粉后第40d的香蕉果实，将40％乙烯利稀释400倍后涂抹在香蕉果实的果柄处，静置1
‑
2d后，去除香蕉果皮，挤压果肉，获得夹带果肉的种子，用75℃的热水浸湿布，再用布包裹夹带果肉的种子，静置1～2min，搓洗种子，将种子和果肉完全分离，先用体积浓度70％乙醇处理30s，再用质量浓度10％的次氯酸钠处理5～6min，最后再用无菌水冲洗3次，每次冲洗1min；
44.s3.胚挽救培养：去除种子表面附着的水后，用解剖刀沿种子种脐边沿切开种子，从种脐下方的空腔剥离出种子胚，将种子胚接种到胚胎挽救培养基中，在28℃下避光培养4周，诱导成苗；所述胚挽救培养基为ms iaa 0.3mg/l 6
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ba 3mg/l da
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6 0.14mg/l，ph为5.5。
45.实施例4
46.一种香蕉胚挽救方法，包括以下步骤：
47.s1.授粉：于每天上午，在香蕉雄花花梳展开后，用移液器吸取雄花花萼基部分泌的蜜腺，在无菌环境下，将收集到的花蜜过0.22μm孔径的细菌过滤器，每100g过滤后的花蜜加入1.2g的碘盐，进行人工授粉；
48.s2.外植体处理：取授粉后第40d的香蕉果实，将60％乙烯利稀释400倍后涂抹在香蕉果实的果柄处，静置1～2d后，去除香蕉果皮，挤压果肉，获得夹带果肉的种子，用75℃的热水浸湿布，再用布包裹夹带果肉的种子，静置1～2min，搓洗种子，将种子和果肉完全分离，先用体积浓度70％乙醇处理30s，再用质量浓度10％的次氯酸钠处理5～6min，最后再用无菌水冲洗3次，每次冲洗1min；
49.s3.胚挽救培养：去除种子表面附着的水后，用解剖刀沿种子种脐边沿切开种子，从种脐下方的空腔剥离出种子胚，将种子胚接种到胚胎挽救培养基中，在28℃下避光培养4周，诱导成苗；所述胚挽救培养基为ms iaa 0.3mg/l 6
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ba 3mg/l da
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6 0.14mg/l，ph为5.5。
50.实施例5
51.一种香蕉胚挽救方法，包括以下步骤：
52.s1.授粉：于每天上午，在香蕉雄花花梳展开后，用移液器吸取雄花花萼基部分泌的蜜腺，在无菌环境下，将收集到的花蜜过0.22μm孔径的细菌过滤器，每100g过滤后的花蜜加入1.2g的碘盐，进行人工授粉；
53.s2.外植体处理：取授粉后第40d的香蕉果实，待香蕉果实自然成熟后，去除香蕉果皮，挤压果肉，获得夹带果肉的种子，用75℃的热水浸湿布，再用布包裹夹带果肉的种子，静置1～2min，搓洗种子，将种子和果肉完全分离，先用体积浓度70％乙醇处理30s，再用质量浓度10％的次氯酸钠处理5～6min，最后再用无菌水冲洗3次，每次冲洗1min；
54.s3.胚挽救培养：去除种子表面附着的水后，用解剖刀沿种子种脐边沿切开种子，从种脐下方的空腔剥离出种子胚，将种子胚接种到胚胎挽救培养基中，在28℃下避光培养4周，诱导成苗；所述胚挽救培养基为ms iaa 0.3mg/l 6
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ba 3mg/l da
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6 0.14mg/l，ph为5.5。
55.实施例6
56.一种香蕉胚挽救方法，包括以下步骤：
57.s1.授粉：于每天上午，在香蕉雄花花梳展开后，用移液器吸取雄花花萼基部分泌的蜜腺，在无菌环境下，将收集到的花蜜过0.22μm孔径的细菌过滤器，每100g过滤后的花蜜加入1.2g的碘盐，进行人工授粉；
58.s2.外植体处理：取授粉后第20d的香蕉果实，将40％乙烯利稀释400倍后涂抹在香蕉果实的果柄处，静置1～2d后，去除香蕉果皮，挤压果肉，获得夹带果肉的种子，用75℃的热水浸湿布，再用布包裹夹带果肉的种子，静置1～2min，搓洗种子，将种子和果肉完全分离，先用体积浓度70％乙醇处理30s，再用质量浓度10％的次氯酸钠处理5～6min，最后再用无菌水冲洗3次，每次冲洗1min；
59.s3.胚挽救培养：去除种子表面附着的水后，用解剖刀沿种子种脐边沿切开种子，从种脐下方的空腔剥离出种子胚，将种子胚接种到胚胎挽救培养基中，在28℃下避光培养4
周，诱导成苗；所述胚挽救培养基为ms iaa 0.3mg/l 6
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ba 3mg/l da
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6 0.14mg/l，ph为5.5。
60.实施例7
61.一种香蕉胚挽救方法，包括以下步骤：
62.s1.授粉：于每天上午，在香蕉雄花花梳展开后，用移液器吸取雄花花萼基部分泌的蜜腺，在无菌环境下，将收集到的花蜜过0.22μm孔径的细菌过滤器，每100g过滤后的花蜜加入1.2g的碘盐，进行人工授粉；
63.s2.外植体处理：取授粉后第60d的香蕉果实，将40％乙烯利稀释400倍后涂抹在香蕉果实的果柄处，静置1～2d后，去除香蕉果皮，挤压果肉，获得夹带果肉的种子，用75℃的热水浸湿布，再用布包裹夹带果肉的种子，静置1～2min，搓洗种子，将种子和果肉完全分离，先用体积浓度70％乙醇处理30s，再用质量浓度10％的次氯酸钠处理5～6min，最后再用无菌水冲洗3次，每次冲洗1min；
64.s3.胚挽救培养：去除种子表面附着的水后，用解剖刀沿种子种脐边沿切开种子，从种脐下方的空腔剥离出种子胚，将种子胚接种到胚胎挽救培养基中，在28℃下避光培养4周，诱导成苗；所述胚挽救培养基为ms iaa 0.3mg/l 6
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ba 3mg/l da
‑
6 0.14mg/l，ph为5.5。
65.实施例8
66.一种香蕉胚挽救方法，包括以下步骤：
67.s1.授粉：于每天上午，在香蕉雄花花梳展开后，用移液器吸取雄花花萼基部分泌的蜜腺，在无菌环境下，将收集到的花蜜过0.22μm孔径的细菌过滤器，每100g过滤后的花蜜加入1.2g的碘盐，进行人工授粉；
68.s2.外植体处理：取授粉后第40d的香蕉果实，将40％乙烯利稀释400倍后涂抹在香蕉果实的果柄处，静置1～2d后，去除香蕉果皮，挤压果肉，获得夹带果肉的种子，用75℃的热水浸湿布，再用布包裹夹带果肉的种子，静置1～2min，搓洗种子，将种子和果肉完全分离，先用体积浓度70％乙醇处理30s，再用质量浓度10％的次氯酸钠处理5～6min，最后再用无菌水冲洗3次，每次冲洗1min；
69.s3.胚挽救培养：去除种子表面附着的水后，用解剖刀沿种子种脐边沿切开种子，从种脐下方的空腔剥离出种子胚，将种子胚接种到胚胎挽救培养基中，在28℃下避光培养4周，诱导成苗；所述胚挽救培养基为ms iaa 0.3mg/l 6
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ba 3mg/l，ph为5.5。
70.实施例9
71.一种香蕉胚挽救方法，包括以下步骤：
72.s1.授粉：于每天上午，在香蕉雄花花梳展开后，用移液器吸取雄花花萼基部分泌的蜜腺，在无菌环境下，将收集到的花蜜过0.22μm孔径的细菌过滤器，每100g过滤后的花蜜加入1.2g的碘盐，进行人工授粉；
73.s2.外植体处理：取授粉后第40d的香蕉果实，将40％乙烯利稀释400倍后涂抹在香蕉果实的果柄处，静置1～2d后，去除香蕉果皮，挤压果肉，获得夹带果肉的种子，用75℃的热水浸湿布，再用布包裹夹带果肉的种子，静置1～2min，搓洗种子，将种子和果肉完全分离，先用体积浓度70％乙醇处理30s，再用质量浓度10％的次氯酸钠处理5～6min，最后再用无菌水冲洗3次，每次冲洗1min；
74.s3.胚挽救培养：去除种子表面附着的水后，用解剖刀沿种子种脐边沿切开种子，从种脐下方的空腔剥离出种子胚，将种子胚接种到胚胎挽救培养基中，在28℃下避光培养2周，然后在光照强度2000lux，光照时间16h/d，诱导成苗；所述胚挽救培养基为ms iaa 0.3mg/l 6
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ba 3mg/l da
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6 0.14mg/l，ph为5.5。
75.香蕉雌蕊授粉3天后，观察到香蕉果实是否有明显的膨大，记录授粉情况，计算授粉率，在胚挽救培养1周后记录污染数，在培养过程中，记录胚褐化数，在胚挽救培养4周后，统计胚挽救成苗数，结果见表1；
[0076][0077][0078][0079][0080]
表1
[0081][0082][0083]
结果显示，本发明胚挽救方法的授粉率高，胚褐化率和污染率低，胚挽救成苗率高；实施例1与实施例3对比可以看出，使用未经处理的雄花花蜜进行授粉的授粉率低；实施例1与实施例4
‑
5对比可以看出，让香蕉果实自然成熟或用其他浓度的乙烯利进行处理，胚挽救的污染率高，胚挽救成苗率低；实施例1与实施例6
‑
7对比可以看出，采用授粉20d或60d的香蕉果实作为培养材料，胚挽救的污染率或成苗率低；实施例1与实施例8
‑
9对比可以看出，采用不同的培养基组成或培养条件，胚挽救的胚褐化率高，胚挽救成苗率低。
[0084]
试验例不同基因型杂交组合的香蕉胚挽救效果
[0085]
按实施例1的方法，将不同基因型的香蕉杂交后，获取其香蕉果实的种子胚，进行胚挽救培养，每个基因型接种数30个种子胚，在胚挽救培养4周后统计胚胎挽救效率，结果见表2。
[0086]
表2
[0087] 胚挽救成苗率(％)itc0249(aa)86.67itc0480(aa)90itc0017(ab)40itc0545(bb)82.52itc0249(aa)
×
itc0480(aa)83.33itc0249(aa)
×
itc0017(ab)56.67itc0249(aa)
×
itc0545(bb)89.24
[0088]
结果显示，本发明的香蕉胚挽救适用于不同基因型的二倍体野生香蕉及其杂交种香蕉，且胚挽救成苗率高，对itc0480(aa)的香蕉的胚挽救效果最好，胚挽救成苗率高达90％。
[0089]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。