一种磁性MOF@适配体以及利用其检测食源性致病菌的方法与流程

一种磁性mof@适配体以及利用其检测食源性致病菌的方法
技术领域
1.本发明属于食品安全技术领域，涉及纳米技术和生物技术。具体地，尤其涉及一种磁性mof@适配体（即fe3o4@zif
‑
8@aptamer）以及利用其检测食源性致病菌的方法，其利用磁性mof的双识别荧光增强效应原理来高灵敏度检测食源性致病菌。


背景技术：

2.随着现代经济的飞速发展，人民群众对高质量食品的需求日益增长，食源性致病菌引发的食品安全问题也越来越备受关注。因此，食品中致病菌的检测具有重要意义，是社会、经济和公共卫生的一项重要任务。纳米材料近年来发展迅速，被广泛应用于生物学、医学等领域。纳米材料具有更大的比表面积和特殊的性质，fe3o4颗粒具有超顺磁性，可用于材料的回收等领域；金属有机骨架材料(mofs)是一类新型的高孔隙度材料，由含无机金属的节点和有机配体的自组装协调。凭借mofs的高比表面、可修饰的孔道结构、多样的功能部位等使得其在吸附及传感器领域得到广泛应用。
3.荧光探针技术广泛的应用于生物检测中，可以针对性的进行定性和定量的研究和表征，大多数生物分子本身荧光较弱或基本无荧光，检测灵敏度差，使得荧光探针检测技术的应用成为客观可能。识别作用可以标记含有特定基因的生物大分子如蛋白质、抗原抗体、核酸、酶以及聚合物。当其应用于食源性致病菌检测的时候具有较高的检测灵敏度且可以实现定量检测。由鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种磁性mof@适配体（fe3o4@zif
‑
8@aptamer）以及利用其检测食源性致病菌的方法，该检测方法具有检测灵敏度高，特异性强等特点。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种磁性mof@适配体的制备方法，其包括如下步骤：1）在fe3o4的无水甲醇分散液中，加入六水硝酸锌和2
‑
甲基咪唑，混合均匀，然后于65
‑
75 ℃水浴中加热15
‑
30 min，冷却至室温，洗涤、干燥，得到fe3o4@zif
‑
8粉末；2）将fe3o4@zif
‑
8用pbs洗涤并重悬于pbs中，加入适配体后于室温下震荡20
‑
30 min，然后加入脱脂奶粉封闭，再用pbs洗涤后重悬于pbs中，即得。
6.具体的，步骤1）中，在含25 mg fe3o4的无水甲醇分散液中，加入0.10
‑
0.20g六水硝酸锌和0.20
‑
0.30g 2
‑
甲基咪唑。
7.进一步的，可以重复步骤1）2
‑
4次使zif
‑
8的外壳逐层生长在fe3o4表面。
8.进一步的，步骤1）中，所述fe3o4经下述处理获得
：
将乙二醇与六水三氯化铁、乙酸钠、柠檬酸钠混合均匀，然后在180
‑
220 ℃下加热反应8
‑
12 h，冷却至室温，经洗涤、干燥，即得。该方法制备获得的fe3o4表面带有羧基基团，更利于步骤2）中与锌离子的结合以及有机配体在其表面的生长。
9.具体的，在制备fe3o4时，可以在60
‑
100 ml乙二醇中加入4
‑
5 g六水三氯化铁、7
‑
9g乙酸钠和0.5
‑
1.0 g柠檬酸钠。
10.进一步的，步骤2）中fe3o4@zif
‑
8和适配体结合时的终浓度分别为2 mg/ml和2.4 μm，封闭所加入的脱脂奶粉终浓度为2%（w/v）。
11.本发明还提供了采用上述制备方法制备得到的磁性mof@适配体。
12.本发明还提供了一种利用上述磁性mof@适配体检测食源性致病菌的方法，具体包括如下步骤：a）将fitc标记的链霉亲和素和生物素标记的抗体作为fitc
‑
抗体识剂在室温下孵育，于4 ℃保存；b）将不同浓度梯度的目标食源性致病菌、与磁性mof@适配体置于37 ℃下反应20
‑
40 min后，pbs洗涤并重悬于pbs中，再加入等体积步骤a）制备所得fitc
‑
抗体识别剂，37 ℃下偶联20
‑
40min，磁分离并检测上清液的荧光强度；以荧光强度为纵坐标，以目标食源性致病菌浓度为横坐标，绘制标准曲线；c）将待测样品、与磁性mof@适配体置于37 ℃下反应20
‑
40 min后，用pbs洗涤并重悬于pbs中，再加入等体积步骤a）制备所得fitc
‑
抗体识别剂，37 ℃下偶联20
‑
40min，磁分离并检测上清液的荧光强度；代入标准曲线，计算得出待测样品中的菌浓度。
13.进一步的，步骤b）中，所述食源性致病菌为单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌o157:h7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌或铜绿假单胞菌等。
14.具体的，步骤a）中fitc标记的链霉亲和素和生物素标记的抗体结合时的终浓度分别为25 μg/ml和10 μg/ml。步骤c）中的待测样品可以是纯培养的菌液或者含菌的食品样品，检测时其与磁性mof@适配体（5mg/ml）的体积比为3：2。
15.本发明中，实验所用pbs指浓度0.01 m、ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液，并需提前灭菌。
16.本发明先是合成制备了磁性mof@适配体（fe3o4@zif
‑
8@aptamer），再利用荧光分子受体与金属供体间发生的荧光共振能量转移以增强荧光强度的原理，提供一种高灵敏食源性致病菌检测的方法。主要包括：先通过溶剂热法合成制备fe3o4，再在其上逐层生长zif
‑
8从而制得fe3o4@zif
‑
8，然后将适配体通过吸附作用接合于其表面制得fe3o4@zif
‑
8@aptamer；同时将fitc荧光标记的链霉亲和素与生物素标记的抗体特异性结合，一方面增加抗体的空间结位点从而提高对致病菌的捕获，另一方面提供荧光信号而给本方法以定量分析。该方法是通过fe3o4@zif
‑
8@aptamer和fitc
‑
抗体对目标菌的双识别，利用目标菌存在时fitc与fe3o4@zif
‑
8表面金属基团的距离，发生荧光分子与金属基团表面的荧光共振能量转移，从而导致荧光增强实现检测。
17.本发明检测方法是通过加入靶菌后拉近了荧光分子和金属基团之间的距离，使得两者之间发生荧光共振能量转移从而导致荧光增强，随着靶菌浓度的升高更多的能量被转移，荧光强度也随之增大，这使得检测结果可以在一定范围内具有良好的线性关系，为定量分析提供了依据。该检测方法检测灵敏度高，对纯培养菌的检测在1.4
×
10
1 cfu/ml
‑
1.4
×
10
7 cfu/ml之间有良好的线性关系；对含菌食品样品的检测在6.6
×
10
1 cfu/ml
‑
6.6
×
10
6 cfu/ml之间有良好的线性关系；同时具有检测灵敏度高，特异性强等特点。
18.与其它现有的传统检测方法相比，本发明具有如下显著特征和有益效果：1）检测所用材料与试剂稳定、简单且操作方便快捷；
2）本发明通过适配体和抗体的双重识别效果对检测结果具有良好的特异性；3）本发明通过荧光增强效应进行检测，荧光信号具有较好的线性关系可实现定量检测；4）本发明检测快速、灵敏度高，检测时间在2h内，对纯培养菌和含菌食品样品菌的检测限均低于10 cfu/ml。
附图说明
19.图1为本发明制备的fe3o
4 (a)和fe3o4@zif
‑
8 (b)在不同放大倍数下的fe
‑
tem图；图2为本发明制备的fe3o4和fe3o4@zif
‑
8的xrd图；图3为本发明制备的fe3o4和fe3o4@zif
‑
8的ft
‑
ir光谱图；图4为本发明制备的fe3o4和fe3o4@zif
‑
8的vsm磁滞曲线图；图5为本发明制备的fe3o4@zif
‑
8（a）、zn 2p（b）、n 1s（c）、c 1s（d）、o 1s（e）的xps测量谱图；图6为本发明制备的fe3o4@zif
‑
8和fe3o4@zif
‑
8@aptamer的ζ电势图；图7为本发明中检测不同浓度纯培养的单核细胞增生李斯特菌的荧光光谱图（a）和荧光强度与单核细胞增生李斯特菌浓度的标准曲线图（b）；图8为本发明中检测含不同浓度单核细胞增生李斯特菌猪肉样品的荧光光谱图（a）和荧光强度与含单核细胞增生李斯特菌浓度的标准曲线图（b）；图9为本发明中检测单核细胞增生李斯特菌时的检测特异性图。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
21.实施例1一种磁性mof@适配体（即fe3o4@zif
‑
8@aptamer）的制备方法，具体包括如下步骤：1）在80 ml乙二醇中加入4.32 g六水三氯化铁，磁力搅拌10 min；再加入7.94 g乙酸钠，磁力搅拌15 min；再加入0.80 g柠檬酸钠，搅拌5 min。超声处理30 min后，将得到的溶液转移到100 ml内衬四氟乙烯的不锈钢高压釜中，在200 ℃下加热反应10 h后冷却至室温。用无水甲醇洗涤4次，室温干燥6 h后得到fe3o4粉末；2）取25 mg上述步骤1）制备所得fe3o4粉末，加入到30 ml无水甲醇中，超声处理5 min以分散均匀，再加入0.15 g六水硝酸锌同时玻璃棒搅拌2 min，再加入0.25 g 2
‑
甲基咪唑快速搅拌1 min。水浴70 ℃加热20 min后冷却至室温，用无水甲醇洗涤3次后，重复该步骤2）的操作3次以使zif
‑
8的外壳逐层生长在fe3o4表面，最后室温干燥6 h，得到fe3o4@zif
‑
8粉末；3）取4.8 mg上述步骤2）中制备所得fe3o4@zif
‑
8粉末用pbs（0.01 m ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液）洗涤2次后重悬于242.4 μl的pbs中，加入57.6 μl 100 μm单核细胞增生李斯特菌适配体（序列为5'
‑
tactatcgcggagacagcgcgggaggcaccgggga
‑
3'，此产品定制于华大基因，向10 od适配体粉末中加入290 μl超纯水制得浓度为100 μm的适配体溶液）。于室温下
cfu/ml、1.4
×
10
6 cfu/ml和1.4
×
10
7 cfu/ml，无菌pbs缓冲液作为对照。将已经稀释好的不同浓度的菌液与步骤3）制备所得fe3o4@zif
‑
8@aptamer（每个浓度做3组平行）以3:2的体积比置于37 ℃下反应30 min进行捕获。用外置磁铁进行分离，弃上清后用pbs洗涤1次并重悬于50 μl pbs中，再加入等体积步骤4）制备所得fitc
‑
抗体识别剂，于37℃偶联30 min。最终磁分离并检测上清液的荧光强度，其中激发波长为495nm，发射波长为520nm。以荧光强度为纵坐标，以菌浓度为横坐标，绘制标准曲线（见图7中b）；c）将单核细胞增生李斯特菌菌液作为待测样品与步骤3）制备所得fe3o4@zif
‑
8@aptamer（5mg/ml）以3：2的体积比添加并混合，置于37 ℃下反应30 min，磁分离弃去上清，用pbs洗涤1次并重悬于50 μl pbs中，再加入等体积步骤4）中制备所得fitc
‑
抗体识别剂，37 ℃下偶联30 min，磁分离并检测上清液的荧光强度；代入标准曲线，计算得出待测样品中的菌浓度。
29.检测结果分析：通过拟合在520 nm处各个浓度的荧光强度与不同浓度单核细胞增生李斯特菌菌液的关系点得到检测单增李斯特菌的标准曲线（见图7中b），其公式为y=1030.680 35.439x，r2=0.99043，检测限低至0.76 cfu/ml，且每个浓度梯度检测结果的相对标准偏差不超过2%，检测特异性良好且各种类致病菌检测结果的相对标准偏差不超过1.5%，说明本发明检测方法具有良好的重复性和可信度。
30.对单核细胞增生李斯特菌纯菌液进行检测，荧光强度为1233，菌量为1.4
×
10
5 cfu/ml。与本方法相比，传统的平板计数法耗时长，需要1
‑
2天，并且无法对不可培养状态的菌进行检测。
31.图7为本发明中检测不同浓度纯培养的单核细胞增生李斯特菌的荧光光谱图（a）和荧光强度与单增李斯特菌浓度的标准曲线图（b）；通过拟合在520 nm处各个浓度的荧光强度与不同菌液浓度的关系点得到检测单增李斯特菌的标准曲线。图7显示：标准曲线方程式为y=1030.680 35.439x，r2=0.99043，检测限低至0.76 cfu/ml，且每个浓度梯度检测结果的相对标准偏差不超过2%。
32.图8为本发明中检测不同浓度含单核细胞增生李斯特菌的猪肉样品的荧光光谱图（a）和荧光强度与含菌浓度的标准曲线图（b）。猪肉样品的处理参考gb 4789.30
‑
2016，具体为：取25 g猪肉加入盛有225 ml pbs的均质袋中，在拍击式均质器中连续均质1min~2min得均质液。向均质液分别加入不同浓度的单核细胞增生李斯特菌，制得含终浓度为6.6
×
10
1 cfu/ml，6.6
×
10
2 cfu/ml，6.6
×
10
3 cfu/ml，6.6
×
10
4 cfu/ml，6.6
×
10
5 cfu/ml和6.6
×
10
6 cfu/ml的单核细胞增生李斯特菌猪肉样品液。通过拟合在520 nm处各个浓度的荧光强度与不同样品浓度的关系点得到检测人工污染猪肉样品的标准曲线。图8显示：标准曲线方程式为y=859.429 52.987x，r2=0.99953，检测限低至2.99 cfu/ml，且每个浓度梯度检测结果的相对标准偏差不超过2%。
33.特异性检测：取浓度为10
7 cfu/ml的单核细胞增生李斯特菌（l. monocytogenes）、大肠杆菌o157:h7（e. coli o157:h7）、鼠伤寒沙门氏菌（s. typhimurium）、金黄色葡萄球菌（s. aureus）、铜绿假单胞菌（p. aeruginosa）和副溶血性弧菌（v. parahemolyticus），参照上述步骤6）进行检测，对比各样品的荧光强度以评价本发明方法的检测特异性。
34.图9为本发明检测纯培养菌液的检测特异性图。图9的结果显示：与空白对照blank相比，单核细胞增生李斯特菌（l. monocytogenes）的荧光强度明显高于空白对照，而其它
五种致病菌的荧光强度均没有增加。说明本发明方法检测特异性良好且各种类致病菌检测结果的相对标准偏差不超过1.5%。
35.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。