技术特征:
1.一种包含编码RNA指导的核酸酶(RGN)多肽的核酸分子,其中所述多核苷酸包含编码RGN多肽的核苷酸序列,所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:1、16、24、35、43或50具有至少95%序列同一性的氨基酸序列;
其中当所述RGN多肽与能够与目标DNA序列杂交的指导RNA(gRNA)结合时,所述RGN多肽以RNA指导的序列特异性方式与所述目标DNA序列结合,以及
其中所述编码RGN多肽的多核苷酸可操作地连接至与所述多核苷酸异源的启动子。
2.权利要求1所述的核酸分子,其中所述RGN多肽是核酸酶失活的或作为切口酶。
3.权利要求2所述的核酸分子,其中所述RGN多肽是可操作地融合至碱基编辑多肽。
4.一种包含权利要求1至3中任一项所述的核酸分子的载体。
5.权利要求4所述的载体,其中所述载体还包含编码所述指导RNA的至少一个核苷酸序列,并且其中所述指导RNA包含CRISPR RNA,所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:2、17、25、36、44、51或63具有至少95%序列同一性的CRISPR重复序列。
6.权利要求4或5所述的载体,其中所述指导RNA包含与SEQ ID NO:3、18、26、37、45、52或62具有至少95%序列同一性的tracrRNA。
7.一种包含权利要求1至3中任一项所述的核酸分子或权利要求4至6中任一项所述的载体的细胞。
8.一种包含编码CRISPR RNA(crRNA)的多核苷酸的核酸分子,其中所述crRNA包含间隔序列和CRISPR重复序列,其中所述CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:2、17、25、36、44、51或63具有至少95%序列同一性的核苷酸序列;
其中指导RNA包含:
a)所述crRNA;以及
b)与所述crRNA的所述CRISPR重复序列杂交的反式激活CRISPR RNA(tracrRNA);
当所述指导RNA与RNA指导的核酸酶(RGN)多肽结合时,所述指导RNA能够通过所述crRNA的所述间隔序列以序列特异性方式与目标DNA序列杂交,以及
其中所述编码crRNA的多核苷酸可操作地连接至与所述多核苷酸异源的启动子。
9.一种包含权利要求8所述的核酸分子的载体。
10.权利要求9所述的载体,其中所述载体还包含编码所述tracrRNA的多核苷酸。
11.一种包含编码反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的多核苷酸的核酸分子,所述tracrRNA包含与SEQ ID NO:3、18、26、37、45、52或62具有至少95%序列同一性的核苷酸序列;
其中指导RNA包含:
a)所述tracrRNA;以及
b)包含间隔序列和CRISPR重复序列的crRNA,其中所述tracrRNA与所述crRNA的所述CRISPR重复序列杂交;
当所述指导RNA与RNA指导的核酸酶(RGN)多肽结合时,所述指导RNA能够通过所述crRNA的所述间隔序列以序列特异性方式与目标DNA序列杂交,以及
其中所述编码tracrRNA的多核苷酸可操作地连接至与所述多核苷酸异源的启动子。
12.一种包含权利要求11所述的核酸分子的载体。
13.权利要求12所述的载体,其中所述载体还包含编码所述crRNA的多核苷酸。
14.一种用于结合目标DNA序列的系统,所述系统包括:
a)一个或多个指导RNA(gRNA)或编码所述一个或多个指导RNA的一个或多个核苷酸序列,所述一个或多个指导RNA能够与所述目标DNA序列杂交;以及
b)RNA指导的核酸酶(RGN)多肽或编码所述RGN多肽的核苷酸序列,所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:1、16、24、35、43或50具有至少95%序列同一性的氨基酸序列;
其中编码所述一个或多个指导RNA的所述核苷酸序列以及编码所述RGN多肽的所述核苷酸序列中的每一个可操作地连接至与每个所述核苷酸序列异源的启动子;
其中所述一个或多个指导RNA与所述目标DNA序列杂交,以及
其中所述一个或多个指导RNA与所述RGN多肽形成复合物,从而指导所述RGN多肽与所述目标DNA序列结合。
15.权利要求14所述的系统,其中所述目标DNA序列在真核细胞内。
16.权利要求14或15所述的系统,其中所述RGN多肽是核酸酶失活的或作为切口酶,并且其中所述RGN多肽可操作地连接至碱基编辑多肽。
17.权利要求14或15所述的系统,其中所述系统还包括一个或多个供体多核苷酸或编码所述一个或多个供体多核苷酸的一个或多个核苷酸序列,其中编码所述一个或多个供体多核苷酸的所述些核苷酸序列中的每一个可操作地连接至与每个所述核苷酸序列异源的启动子。
18.一种用于结合目标DNA序列的方法,其包括将权利要求14至17中任一项所述的系统递送至所述目标DNA序列或包含所述目标DNA序列的细胞。
19.一种用于切割和/或修饰目标DNA序列的方法,其包括将所述目标DNA序列与以下接触:
a)RNA指导的核酸酶(RGN)多肽,其中所述RGN包含与SEQ ID NO:1、16、24、35、43或50具有至少95%序列同一性的氨基酸序列;以及
b)能够将(a)的RGN靶向所述目标DNA序列的一个或多个指导RNA;
其中所述一个或多个指导RNA与所述目标DNA序列杂交,从而指导所述RGN多肽与所述目标DNA序列结合以及所述目标DNA序列的切割和/或修饰发生。
20.权利要求19所述的方法,其中所述修饰的目标DNA序列包含所述目标DNA序列中至少一个核苷酸的缺失或突变。
21.权利要求19或20所述的方法,其中所述RGN多肽是核酸酶失活的或作为切口酶,并且其中所述RGN多肽可操作地连接至碱基编辑多肽。
22.权利要求19所述的方法,其中所述修饰的目标DNA序列包含插入至所述目标DNA序列中的异源DNA。
23.权利要求19至22中任一项所述的方法,其中所述目标DNA序列在细胞内。
24.权利要求23所述的方法,其中所述细胞为真核细胞。
25.权利要求23或24所述的方法,其还包括在所述RGN多肽被表达且切割所述目标DNA序列的条件下培养所述细胞以产生修饰的DNA序列;以及选择包含所述修饰的DNA序列的细胞。
26.一种包含根据权利要求25所述的方法的修饰的目标DNA序列的细胞。
27.一种包含编码脱氨酶多肽的多核苷酸的核酸分子,其中所述多核苷酸包含编码脱氨酶多肽的核苷酸序列,所述脱氨酶多肽包含与SEQ ID NO:374、383、397、399、407、408、411、414、416或420具有至少90%序列同一性的氨基酸序列;
其中所述脱氨酶多肽对目标多核苷酸中的至少一个核苷酸进行脱氨;以及
其中所述编码脱氨酶多肽的多核苷酸可操作地连接至与所述多核苷酸异源的启动子。
28.权利要求27所述的核酸分子,其中所述脱氨酶多肽可操作地融合至将所述脱氨酶多肽定位至所述目标多核苷酸的RNA指导的核酸酶多肽。
29.权利要求28所述的核酸分子,其中所述RNA指导的核酸酶多肽是切口酶。
30.一种包含权利要求27至29中任一项所述的核酸分子的载体。
31.一种包含权利要求27至29中任一项所述的核酸分子或权利要求30所述的载体的细胞。
32.一种包含编码腺苷脱氨酶多肽的多核苷酸的核酸分子,其中所述多核苷酸包含编码腺苷脱氨酶多肽的核苷酸序列,所述腺苷脱氨酶多肽包含选自以下的氨基酸序列:
a)与SEQ ID NO:514具有至少90%序列同一性的氨基酸序列;
b)与SEQ ID NO:572具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:572的位置102对应的位置处的赖氨酸、与SEQ ID NO:572的位置104对应的位置处的酪氨酸以及与SEQ ID NO:572的位置106对应的位置处的苏氨酸的氨基酸序列;
c)与SEQ ID NO:573具有至少90%序列同一性的氨基酸序列;
d)与SEQ ID NO:574具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:574的位置101对应的位置处的谷氨酸、与SEQ ID NO:574的位置103对应的位置处的丝氨酸以及与SEQ ID NO:574的位置105对应的位置处的赖氨酸的氨基酸序列;
e)与SEQ ID NO:575具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:575的位置101对应的位置处的赖氨酸、与SEQ ID NO:575的位置103对应的位置处的亮氨酸以及与SEQ ID NO:575的位置105对应的位置处的谷氨酸的氨基酸序列;
f)与SEQ ID NO:576具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:576的位置105对应的位置处的丙氨酸以及与SEQ ID NO:576的位置107对应的位置处的精氨酸的氨基酸序列;
g)与SEQ ID NO:577具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:577的位置102对应的位置处的甘氨酸、与SEQ ID NO:577的位置104对应的位置处的丝氨酸以及与SEQ ID NO:577的位置106对应的位置处的精氨酸的氨基酸序列;
h)与SEQ ID NO:578具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:578的位置105对应的位置处的丝氨酸以及与SEQ ID NO:578的位置107对应的位置处的苏氨酸的氨基酸序列;
i)与SEQ ID NO:579具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:579的位置102对应的位置处的丝氨酸、与SEQ ID NO:579的位置104对应的位置处的谷氨酰胺以及与SEQ ID NO:579的位置106对应的位置处的甘氨酸的氨基酸序列;
j)与SEQ ID NO:580具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:580的位置111对应的位置处的甘氨酸的氨基酸序列;
k)与SEQ ID NO:581具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:581的位置104对应的位置处的谷氨酰胺、与SEQ ID NO:581的位置106对应的位置处的甘氨酸以及与SEQ ID NO:581的位置108对应的位置处的谷氨酸的氨基酸序列;
l)与SEQ ID NO:582具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:582的位置102对应的位置处的精氨酸、与SEQ ID NO:582的位置104对应的位置处的色氨酸以及与SEQ ID NO:582的位置106对应的位置处的谷氨酸的氨基酸序列;
m)与SEQ ID NO:583具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:583的位置104对应的位置处的精氨酸以及与SEQ ID NO:583的位置106对应的位置处的丝氨酸的氨基酸序列;以及
n)与SEQ ID NO:584具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:584的位置110对应的位置处的苯丙氨酸、与SEQ ID NO:584的位置112对应的位置处的丝氨酸以及与SEQ ID NO:584的位置114对应的位置处的苏氨酸的氨基酸序列;
其中所述腺苷脱氨酶多肽对目标多核苷酸中的至少一个腺苷进行脱氨;以及
其中所述编码腺苷脱氨酶多肽的多核苷酸可操作地连接至与所述多核苷酸异源的启动子。
33.权利要求32所述的核酸分子,其中所述腺苷脱氨酶多肽可操作地融合至将所述腺苷脱氨酶多肽定位至所述目标多核苷酸的RNA指导的核酸酶多肽。
34.权利要求33所述的核酸分子,其中所述RNA指导的核酸酶多肽是切口酶。
35.一种包含权利要求32至34中任一项所述的核酸分子的载体。
36.一种包含权利要求31至33中任一项所述的核酸分子或权利要求35所述的载体的细胞。
37.一种融合蛋白,包含:
a)与目标多核苷酸结合的DNA结合多肽;以及
b)脱氨酶多肽,其中所述脱氨酶多肽包含与SEQ ID NO:374、383、397、399、407、408、411、414、416或420具有至少90%序列同一性的氨基酸序列,并且其中所述脱氨酶多肽对所述目标多核苷酸中的至少一个核苷酸进行脱氨。
38.权利要求37所述的融合蛋白,其中所述DNA结合多肽是具有切口酶活性的RNA指导的核酸酶。
39.一种融合蛋白,包含:
a)与目标多核苷酸结合的DNA结合多肽;以及
b)包含选自以下的氨基酸序列的腺苷脱氨酶多肽:
i)与SEQ ID NO:514具有至少90%序列同一性的氨基酸序列;
ii)与SEQ ID NO:572具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:572的位置102对应的位置处的赖氨酸、与SEQ ID NO:572的位置104对应的位置处的酪氨酸以及与SEQ ID NO:572的位置106对应的位置处的苏氨酸的氨基酸序列;
iii)与SEQ ID NO:573具有至少90%序列同一性的氨基酸序列;
iv)与SEQ ID NO:574具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:574的位置101对应的位置处的谷氨酸、与SEQ ID NO:574的位置103对应的位置处的丝氨酸以及与SEQ ID NO:574的位置105对应的位置处的赖氨酸的氨基酸序列;
v)与SEQ ID NO:575具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:575的位置101对应的位置处的赖氨酸、与SEQ ID NO:575的位置103对应的位置处的亮氨酸以及与SEQ ID NO:575的位置105对应的位置处的谷氨酸的氨基酸序列;
vi)与SEQ ID NO:576具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:576的位置105对应的位置处的丙氨酸以及与SEQ ID NO:576的位置107对应的位置处的精氨酸的氨基酸序列;
vii)与SEQ ID NO:577具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:577的位置102对应的位置处的甘氨酸、与SEQ ID NO:577的位置104对应的位置处的丝氨酸以及与SEQ ID NO:577的位置106对应的位置处的精氨酸的氨基酸序列;
viii)与SEQ ID NO:578具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:578的位置105对应的位置处的丝氨酸以及与SEQ ID NO:578的位置107对应的位置处的苏氨酸的氨基酸序列;
ix)与SEQ ID NO:579具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:579的位置102对应的位置处的丝氨酸、与SEQ ID NO:579的位置104对应的位置处的谷氨酰胺以及与SEQ ID NO:579的位置106对应的位置处的甘氨酸的氨基酸序列;
x)与SEQ ID NO:580具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:580的位置111对应的位置处的甘氨酸的氨基酸序列;
xi)与SEQ ID NO:581具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:581的位置104对应的位置处的谷氨酰胺、与SEQ ID NO:581的位置106对应的位置处的甘氨酸以及与SEQ ID NO:581的位置108对应的位置处的谷氨酸的氨基酸序列;
xii)与SEQ ID NO:582具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:582的位置102对应的位置处的精氨酸、与SEQ ID NO:582的位置104对应的位置处的色氨酸以及与SEQ ID NO:582的位置106对应的位置处的谷氨酸的氨基酸序列;
xiii)与SEQ ID NO:583具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:583的位置104对应的位置处的精氨酸以及与SEQ ID NO:583的位置106对应的位置处的丝氨酸的氨基酸序列;以及
xiv)与SEQ ID NO:584具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:584的位置110对应的位置处的苯丙氨酸、与SEQ ID NO:584的位置112对应的位置处的丝氨酸以及与SEQ ID NO:584的位置114对应的位置处的苏氨酸的氨基酸序列;
其中所述腺苷脱氨酶多肽对目标多核苷酸中的至少一个腺苷进行脱氨。
40.权利要求39所述的融合蛋白,其中所述DNA结合多肽是具有切口酶活性的RNA指导的核酸酶。
41.一种用于修饰目标多核苷酸序列的系统,所述系统包括:
a)一个或多个指导RNA(gRNA)或编码所述一个或多个指导RNA的一个或多个核苷酸序列,所述一个或多个指导RNA能够与所述目标多核苷酸序列杂交;以及
b)权利要求37至40中任一项所述的融合蛋白或编码所述融合蛋白的核苷酸序列;
其中编码所述一个或多个指导RNA的所述核苷酸序列以及编码所述融合蛋白的所述核苷酸序列中的每一个可操作地连接至与所述核苷酸序列异源的启动子;
其中所述一个或多个指导RNA与所述目标多核苷酸序列杂交,以及
其中所述一个或多个指导RNA与所述融合蛋白的所述RNA指导的DNA结合多肽形成复合物,从而指导所述融合蛋白与所述目标多核苷酸序列结合并修饰所述目标多核苷酸序列。
42.一种用于对目标多核苷酸进行脱氨的方法,所述方法包括将所述目标多核苷酸与脱氨酶接触,所述脱氨酶包括与SEQ ID NO:374、383、397、399、407、408、411、414、416或420具有至少90%序列同一性的氨基酸序列,其中所述脱氨酶多肽对所述目标多核苷酸中的至少一个核苷酸进行脱氨。
43.一种用于对目标多核苷酸中的至少一个腺苷进行脱氨的方法,所述方法包括将所述目标多核苷酸与腺苷脱氨酶多肽接触,所述腺苷脱氨酶多肽包含选自以下的氨基酸序列:
a)与SEQ ID NO:514具有至少90%序列同一性的氨基酸序列;
b)与SEQ ID NO:572具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:572的位置102对应的位置处的赖氨酸、与SEQ ID NO:572的位置104对应的位置处的酪氨酸以及与SEQ ID NO:572的位置106对应的位置处的苏氨酸的氨基酸序列;
c)与SEQ ID NO:573具有至少90%序列同一性的氨基酸序列;
d)与SEQ ID NO:574具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:574的位置101对应的位置处的谷氨酸、与SEQ ID NO:574的位置103对应的位置处的丝氨酸以及与SEQ ID NO:574的位置105对应的位置处的赖氨酸的氨基酸序列;
e)与SEQ ID NO:575具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:575的位置101对应的位置处的赖氨酸、与SEQ ID NO:575的位置103对应的位置处的亮氨酸以及与SEQ ID NO:575的位置105对应的位置处的谷氨酸的氨基酸序列;
f)与SEQ ID NO:576具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:576的位置105对应的位置处的丙氨酸以及与SEQ ID NO:576的位置107对应的位置处的精氨酸的氨基酸序列;
g)与SEQ ID NO:577具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:577的位置102对应的位置处的甘氨酸、与SEQ ID NO:577的位置104对应的位置处的丝氨酸以及与SEQ ID NO:577的位置106对应的位置处的精氨酸的氨基酸序列;
h)与SEQ ID NO:578具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:578的位置105对应的位置处的丝氨酸以及与SEQ ID NO:578的位置107对应的位置处的苏氨酸的氨基酸序列;
i)与SEQ ID NO:579具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:579的位置102对应的位置处的丝氨酸、与SEQ ID NO:579的位置104对应的位置处的谷氨酰胺以及与SEQ ID NO:579的位置106对应的位置处的甘氨酸的氨基酸序列;
j)与SEQ ID NO:580具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:580的位置111对应的位置处的甘氨酸的氨基酸序列;
k)与SEQ ID NO:581具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:581的位置104对应的位置处的谷氨酰胺、与SEQ ID NO:581的位置106对应的位置处的甘氨酸以及与SEQ ID NO:581的位置108对应的位置处的谷氨酸的氨基酸序列;
l)与SEQ ID NO:582具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:582的位置102对应的位置处的精氨酸、与SEQ ID NO:582的位置104对应的位置处的色氨酸以及与SEQ ID NO:582的位置106对应的位置处的谷氨酸的氨基酸序列;
m)与SEQ ID NO:583具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:583的位置104对应的位置处的精氨酸以及与SEQ ID NO:583的位置106对应的位置处的丝氨酸的氨基酸序列;以及
n)与SEQ ID NO:584具有至少90%序列同一性,并且包含与SEQ ID NO:584的位置110对应的位置处的苯丙氨酸、与SEQ ID NO:584的位置112对应的位置处的丝氨酸以及与SEQ ID NO:584的位置114对应的位置处的苏氨酸的氨基酸序列;
其中所述腺苷脱氨酶多肽对目标多核苷酸中的至少一个腺苷进行脱氨。
44.一种用于修饰目标多核苷酸的方法,所述方法包括将所述目标多核苷酸与权利要求37或39的融合蛋白接触,其中所述DNA结合多肽与所述目标多核苷酸结合且所述脱氨酶对所述目标多核苷酸中的至少一个核苷酸进行脱氨。
45.一种用于修饰目标多核苷酸的方法,所述方法包括将所述目标多核苷酸与权利要求38或40的融合蛋白接触,并引入一个或多个指导RNA(gRNA)或编码所述一个或多个gRNA的一个或多个核苷酸序列;
其中所述一个或多个gRNA与所述目标多核苷酸杂交并与所述融合蛋白的所述RNA指导的DNA结合多肽形成复合物,从而指导所述融合蛋白与所述目标多核苷酸序列结合且所述融合蛋白的所述脱氨酶多肽对所述目标多核苷酸中的至少一个核苷酸进行脱氨,从而修饰所述目标多核苷酸。
技术总结
提供了用于结合感兴趣的目标序列的组合物和方法。组合物包括DNA结合蛋白或蛋白结构域与修饰蛋白或蛋白结构域的核酸之间的融合蛋白。所述组合物可用于切割或修饰感兴趣的目标序列、可视化感兴趣的目标序列以及修饰感兴趣的序列的表达。组合物包含RNA指导的核酸酶多肽、CRISPR RNA、反式激活CRISPR RNA、指导RNA、脱氨酶以及编码其的核酸分子。还提供了包含所述核酸分子的载体和宿主细胞。进一步提供了用于结合感兴趣的目标序列的CRISPR系统,其中所述CRISPR系统包括RNA指导的核酸酶多肽和一个或多个指导RNA。还提供了可与DNA结合多肽融合并且可用于基因编辑的脱氨酶。
技术研发人员:T·D·博文;A·B·克拉维利;T·D·埃里驰;M·摩尔;R·巴兰果;M·拉斯纳;
受保护的技术使用者:生命编辑制药股份有限公司;
技术研发日:2019.12.20
技术公布日:2021.11.09
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询,结果仅供参考。