一种CTL细胞激活的试剂盒及其激活方法与流程

一种ctl细胞激活的试剂盒及其激活方法
技术领域
1.本发明涉及生物细胞培养领域，特别是一种ctl细胞激活的试剂盒及其激活方法。


背景技术：

2.细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，是白细胞的亚部，为一种特异t细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。
3.现有方法制备ctl细胞，产量偏低，纯度不高；本司在之前申报的专利虽然克服了产量低纯度高的问题，但是操作繁琐，操作人员容易混淆操作失误，经常性遗漏的是lymacin
‑
t抗cd3单克隆抗体要先静置培养2小时，市场需要一种说明书简单，操作简单的ctl细胞激活的试剂盒及其激活方法，本发明解决这样的问题。


技术实现要素：

4.为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种ctl细胞激活的试剂盒及其激活方法，使用本发明只需要按照顺序按压注射器，刺破液包即可完成加液，操作简单，可以全面解决误操作的问题。
5.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
6.一种ctl细胞激活的试剂盒，包括：注射器，设置于注射器内的第一液包，设置于注射器内并位于第一液包上的第二液包，设置于注射器内并位于第二液包上的第三液包，设置于注射器内并位于第三液包上的第四液包，设置于注射器内并位于第四液包上的第五液包，设置于注射器内底部的突刺部。
7.前述的一种ctl细胞激活的试剂盒，第一液包、第二液包、第三液包、第四液包为pe橡胶膜。
8.前述的一种ctl细胞激活的试剂盒，突刺部为锯齿圈。
9.前述的一种ctl细胞激活的试剂盒，第一液包内容纳有pbmcs培养液，第二液包容纳有10
‑
15ml 5ug/ml lymacin
‑
t抗cd3单克隆抗体，第三液包容纳有1
‑
2ml的alys505n
‑
0和60
‑
80ul的5x105iu/ml il
‑
2，第四液包容纳有1
‑
2ml的alys505n
‑
0和10
‑
20ul的5x105iu/ml il
‑
6，第五液包容纳有1
‑
2ml的alys505n
‑
0和10
‑
20ul的5x105iu/ml il
‑
12。
10.前述的一种ctl细胞激活的试剂盒，pbmcs培养液包括：10ml
‑
20ml alys505n
‑
0；
11.前述的一种ctl细胞激活的试剂盒，pbmcs培养液还包括：30
‑
60ul的200mm氨基酸。
12.前述的一种ctl细胞激活的试剂盒，氨基酸包括：l
‑
谷氨酰胺、l
‑
精氨酸、l
‑
门冬氨酸或l
‑
苯丙氨酸中的一种或多种的组合。
13.前述的一种ctl细胞激活的试剂盒，5ug/ml lymacin
‑
t抗cd3单克隆抗体为通过把50ul的1mg/ml lymacin
‑
t加入10ml hanks缓冲液制成。
14.前述的一种ctl细胞激活的试剂盒的激活方法，包括如下步骤：
15.步骤一，处理血浆，收集白细胞；
16.步骤二，按压注射器，释放第一液包的pbmcs培养液，将白细胞用pbmcs培养液培养2小时，经过洗涤得到细胞悬浮；
17.步骤三，在细胞悬浮液中加入3
‑
5ml自体血清后，继续按压注射器，依次刺破第二液包、第三液包、第四液包、第五液包，把细胞悬浊液转移到ctl培养瓶内，放置在37℃，5％co2环境下培养7天
‑
13天后收获ctl细胞收获并冷冻。
18.本发明的有益之处在于：
19.使用本发明只需要按照顺序按压注射器，刺破液包即可完成加液，操作简单；
20.lymacin
‑
t抗cd3单克隆抗体无需事先静置培养，在液包内已经完成静养的过程，可以直接进入培养；
21.本发明可以全面解决误操作的问题。
附图说明
22.图1是本发明的一种实施例的结构示意图；
23.图中附图标记的含义：
24.1注射器，2第一液包，3第二液包，4第三液包，5第四液包，6第五液包，7突刺部。
具体实施方式
25.以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
26.一种ctl细胞激活的试剂盒，包括：注射器1，设置于注射器1内的第一液包2，设置于注射器1内并位于第一液包2上的第二液包3，设置于注射器1内并位于第二液包3上的第三液包4，设置于注射器1内并位于第三液包4上的第四液包5，设置于注射器1内并位于第四液包5上的第五液包6，设置于注射器1内底部的突刺部7，作为一种优选，第一液包2、第二液包3、第三液包4、第四液包5为pe橡胶膜，突刺部7为锯齿圈。
27.第一液包2内容纳有pbmcs培养液，第二液包3容纳有10
‑
15ml 5ug/ml lymacin
‑
t抗cd3单克隆抗体，第三液包4容纳有1
‑
2ml的alys505n
‑
0和60
‑
80ul的5x105iu/ml il
‑
2，第四液包5容纳有1
‑
2ml的alys505n
‑
0和10
‑
20ul的5x105iu/ml il
‑
6，第五液包6容纳有1
‑
2ml的alys505n
‑
0和10
‑
20ul的5x105iu/ml il
‑
12。
28.pbmcs培养液包括：10ml
‑
20ml alys505n
‑
0；作为一种优选，pbmcs培养液还包括：30
‑
60ul的200mm氨基酸；氨基酸包括：l
‑
谷氨酰胺、l
‑
精氨酸、l
‑
门冬氨酸或l
‑
苯丙氨酸中的一种或多种的组合。
29.5ug/ml lymacin
‑
t抗cd3单克隆抗体为通过把50ul的1mg/ml lymacin
‑
t加入10ml hanks缓冲液制成。
30.一种ctl细胞激活的试剂盒的激活方法，包括如下步骤：
31.步骤一，处理血浆，收集白细胞；
32.步骤二，按压注射器1，释放第一液包2的pbmcs培养液，将白细胞用pbmcs培养液培养2小时，经过洗涤得到细胞悬浮；
33.步骤三，在细胞悬浮液中加入3
‑
5ml自体血清后，继续按压注射器1，依次刺破第二液包3、第三液包4、第四液包5、第五液包6，把细胞悬浊液转移到ctl培养瓶内，放置在37℃，5％co 2
环境下培养7天
‑
13天后收获ctl细胞收获并冷冻。
34.以下通过实验验证本发明的激活效果和常规操作一致：
35.步骤一：处理血浆，收集白细胞；
36.1.确认血浆袋的吸取管密封。用两张不同的浸泡在70％乙醇的无菌室专用清洁纸擦拭吸取管和剪刀。
37.2.用镊子夹住吸取管，剪开管道前端并用镊子控制流速以转移血浆到50ml试管内。记录转移的血浆容量。
38.3.离心试管(400g，4℃)30分钟以移除血小板。
39.4.把上层液体倒入一个新的50ml试管。
40.5.把试管放入恒温水槽内(56℃)，培养30分钟。
41.6.离心式管(400g，4℃)60分钟以移除沉淀的纤维蛋白。
42.7.把上层液体(自体血清)倒入一个新的50ml试管。在试管上标记病人名字，制备日期，并冷藏(4℃)。
43.8.确认pbmc袋的吸取管密封。悬挂好pbmc袋。用两张不同的侵泡在70％乙醇的无菌室专用清洁纸擦拭吸取管和剪刀。
44.9.转移细胞到50ml试管中。记录转移的容量。
45.10.计算所需的50ml试管的数量，向所有试管中加入15ml淋巴细胞分离液1077。
46.11.准备足够的新50ml试管用以2倍稀释样本。向准备的所有50ml试管中倒入25mlhanks缓冲液。用10ml移液器转移25ml细胞悬浊液到各个试管中。向第11步的所有试管中各移入30ml稀释过的细胞悬液。
47.12.离心所有试管(400g，室温)40分钟。
48.13.吸取，弃用上层液体直到液面到底层白细胞的距离为1cm。
49.14.准备新的50ml试管。小心翼翼地用10ml移液器收集白细胞。
50.步骤二，将白细胞用pbmcs培养液培养2小时，经过洗涤得到细胞悬浮；
51.1.将每两个试管中的白细胞收集，移入一个新的50ml试管中。
52.2.准备t75细胞培养瓶。标注日期；按压注射器1，将第一液包2戳破，使得pbmcs培养液到每个培养瓶中。
53.3.向每个t75细胞培养瓶里转移5ml细胞悬浊液。
54.4.扣上培养瓶盖子。慢慢的摇晃瓶子以使细胞悬液均匀。放进培养箱培养2小时(37℃，5％co 2)。
55.步骤三，将细胞悬浮用at培养液培养7天，37℃，5％co 2收获at细胞后，冰冻保存；
56.1.准备t225细胞培养瓶。
57.2.按压注射器1，将第二液包3戳破，向t225细胞培养瓶里加入lymacin
‑
t，扣上盖子。
58.前后温柔的摇晃t225细胞培养瓶直到液体覆盖整个底部，放在室温静置培养2小时。
59.3.在pbmcs的两个小时培养结束后，用显微镜确保细胞黏附在培养瓶的底部。
60.4.温柔的前后摇晃t75培养瓶10次使非黏附的细胞悬浮，转移细胞悬液到50ml试管中备用。
61.5.使用以下方法洗涤细胞培养瓶：
62.a.吸取，弃用培养瓶里的溶液。
63.b.向每个培养瓶里加入25ml生理盐水并前后摇晃。
64.c.将生理盐水倒入一个无菌容器内，弃用。
65.d.重复b和c两次。
66.e.吸取清理培养瓶内和瓶嘴处剩余的溶液。
67.7.用移液器重新使50ml试管中的细胞悬浮。平均的把细胞悬液转移到每个细胞培养瓶中。
68.8.再继续按压注射器1，戳破第三液包4、第四液包5、第五液包6，再加入4ml自体血清混合后转移到培养瓶中。
69.9.扣上培养瓶的盖子，温柔的摇匀。把培养瓶放入培养箱培养7天(37℃，5％co 2)。
70.ctl细胞的收获
71.1.确认要收获的ctl细胞培养瓶。
72.2.确保内毒素检测为阴性。
73.3.准备新的50ml试管。制备培养液a：向试管中加入45ml alys505n
‑
0培养液(室温)。向试管中加入50ul的2ug/ml离子霉素和50ul的200ng/ml pma。
74.4.准备新的250ml试管。
75.5.用显微镜观察检测所有的ctl细胞培养瓶。再次确认内毒素检测结果为阴性。将所有培养液倒入250ml试管中。
76.6.转移大约25ml的培养液a到空的培养瓶中，放倒培养瓶。
77.7.离心试管250ml试管5分钟(1500rpm，室温)
78.8.离心过后，弃用上层液体到一个干净的容器内在室温下。
79.9.将第6步的25ml培养液a转移到试管中，重新使细胞悬浮，转移ctl细胞培养瓶内。
80.10.将ctl细胞培养瓶放入培养机培养3小时(37℃，5％co 2)。
81.11.3小时后，使用移液器上下转移液体几次使细胞悬浮。转移细胞悬液到一个新的250ml试管中。加入10ml左右alys505n
‑
0到培养瓶中，用移液器使细胞悬浮。转移细胞悬液到250ml试管中。用肉眼和显微镜观察试管底部的黏附细胞。
82.12.离心试管5分钟(1500rpm，4℃)
83.13.离心过后，吸取弃用上层液体。用少量的alys505n
‑
0使细胞重新悬浮。转移所有的细胞悬液到其中一个试管内。加入alys505n
‑
0直到50ml。
84.14.用trypan blue stain计测细胞数量，计算存活率。
85.15.离心式管5分钟(1500rpm，4℃)
86.16.吸取弃用上册液体，加入50ml alys505n
‑
0使细胞悬浮。
87.17.离心式管5分钟(1500rpm，4℃)取样用于facs检测。
88.18.准备细胞冷冻液(aim
‑
v，20％自体血清，10％dmso)，暂存在冰上。
89.19.执行无菌检测
90.20.将细胞暂存在冰上。
91.21.向细胞试管中加入冷冻液，用移液器混匀。
92.22.冷冻保存。
93.试验一：将以上用两袋不同病人血浆检测的细胞数量，分别采用a血浆、b血浆表示，见表1。
94.表1细胞数量检测表
[0095] a血浆细胞数b血浆细胞数样品1.51x10^7/ml1.48x10^7/ml
[0096]
由表1的结果可知，采用本发明所述方法可以与同样的试剂配方采用常规激活方法相比血浆细胞数一样，甚至更高。
[0097]
试验二：细胞表面cd鉴定结果，分别采用实施例n
‑
a、实施例n
‑
b血浆表示，见表2。
[0098]
表2细胞表面cd鉴定结果
[0099][0100]
由表2的结果可知：本发明激活t淋巴细胞效果与本司之前的专利cn110229789a相比类似，甚至有的数值要更好。
[0101]
本发明相比本司之前的专利只需要按照顺序按压注射器1，刺破液包即可完成加液，操作简单；lymacin
‑
t抗cd3单克隆抗体无需事先静置培养，在液包内已经完成静养的过程，可以直接进入培养；本发明可以全面解决误操作的问题。
[0102]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。