一种PCR检测方法与流程

一种pcr检测方法
1.本发明是2020年12月30日提交中国专利局，申请号为2020116432797、发明名称“一种pcr检测仪及其方法”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及pcr检测领域，具体涉及一种pcr检测方法。


背景技术：

3.实时荧光定量pcr技术，是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
4.在荧光定量pcr技术中，有一个很重要的概念
‑
ct值。c代表cycle，t代表threshold，ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
5.专利文献cn107923922a公开了用于在适于接收化验盒的诊断化验系统中使用的改进的子组件和控制方法。这种子组件包括：光学检测/激励装置。其中，激励块910包括led光源911，led光源911引导光通过滤光片和透镜912，然后通过棒状透镜913，从而将期望波长的光发射到反应容器33的期望位置。光学检测块920包括光电二极管检测器921，该光电二极管检测器921检测从反应容器33发射的光，在由光电二极管检测器921接收之前，发射的光穿过棒状透镜923以及滤光片和透镜922，以确保检测特定波长，特定波长可指示对应于反应容器33内目标分析物的存在的反应。同时光学激励部件910和光学检测部件920定位在适于接收平面反应容器33的光学安装件上。光学激励部件910定位成通过反应容器33的平坦表面的边缘(副面)发射激励能量，并且光学检测部件920沿着反应容器的主平坦表面定位。在一个方面，光学激励部件和光学检测部件彼此正交。其荧光采点原理为常规算法(滤光片过滤带通)。如图7所示，专利文献cn111157497a公开了一种手持式检测仪用激发光源，其包括：pcb板、发光灯组、滤光片、光纤耦合器、光纤、光纤合束器、光纤准直器、外壳、底板；其中，并联设置的多组所述发光灯组发出不同波长的光通过所述滤光片去噪后，经过所述光纤耦合器进入对应所述光纤中，并在所述光纤合束器中混合，最终通过所述光纤准直器对目标进行荧光激发；其发光灯组是具有滤光片的。
6.总之，现有技术中为了检测目标分析物，均需要使用激发光源和反射光源后均会使用滤光组件进行滤光处理，而且使用光电二极管检测器进行检测，而使用滤光处理后的发射光进入检测器检测，只能检测一种发射光，而不能同时检测多种不同的发射光。另外，在检测时，荧光检测物质分配在反应仓可能会存在不均匀甚至不能在反应仓中分布的现象。


技术实现要素：

7.为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种pcr检测仪及其方法，其激发光和发射光后均不使用滤光片，并采用光谱仪对发射光进行检测，能够同时检测不同波长的发射光。
8.本发明提供的具体技术方案如下：
9.一方面，本发明提供了一种pcr检测仪，包括激发光源模块、芯片装置和检测部；激发光源模块、芯片装置和检测部，所述激发光源模块发出预设波长的激发光至所述芯片装置，在进行扩增反应时，所述检测部设置在所述芯片装置的反应仓一侧；
10.所述芯片装置包括反应仓，反应仓内能够容纳被检测样品；其中，被检测样品为含有荧光标记的核酸片段溶液；
11.所述激发光源模块用于发射激发光，激发光源模块发射的激发光能够照射置于反应仓的所述被检测样品；
12.所述激发光源模块能够发射至少2个不同频段的激发光；
13.其中，所述反应仓设置于所述激发光模块的激发光发射方向，所述检测部设置于反应仓的一侧，所述激发光照射所述反应仓后形成的发射光能够被检测部检测；其中，激发光的发射方向位于检测部的下方，所述检测部用于检测被检测样品因受激发光的照射发出的在垂直方向上的发射光；
14.所述检测部包括光谱仪；所述光谱仪检测光谱的波长范围是340
‑
850nm；所述光谱仪能够检测到所述激发光和所述发射光。
15.优选地，所述光谱仪检测至少2个不同频段的激发光的频段和强度，所述光谱仪检测至少2个不同频段的激发光和由激发光照射检测样品引起的发射光的频段和强度。
16.优选地，所述至少2个不同频段的激发光频段至少包括激发光第一频段和激发光第二频段，2个不同频段的激发光引起的发射光的频段至少包括发射光第一频段和发射光第二频段；所述激发光第一频段、激发光第二频段、发射光第一频段和发射光第二频段的频段两两之间均无相互重合的频段范围。
17.优选地，至少2个不同频段的激发光的激发光频段之间无相互重合的频段范围，所至少2个不同频段的激发光引起的所述发射光的不同发射光频段之间无相互重合的频段范围；各个激发光频段以及因激发光引起的各个发射光频段之间无相互重合的频段范围。
18.优选地，所述激发光源模块包括多个光发射单元，所述光发射单元为发光二极管或半导体激光器。
19.优选地，所述激发光源模块包括pcb板、光纤合束器、至少一个发光二极管以及至少一根与每一个发光二极管对应的光纤；
20.发光二极管设置于pcb板一侧；在每一发光二极管的输出端设置有一光纤耦合器，每一光纤耦合器分别与一光纤耦合，通过光纤耦合器将对应波长的激发光耦合于光纤中，并通过光纤传输；
21.光纤合束器将各个光纤按预设方式排列合束为一体，在所述的光纤合束器的输出端还设置有光纤准直器，用以将光纤内的激发光转变成准直光；
22.所述至少一个发光二极管用于发射至少2个不同频段的激发光，所述至少2个不同频段的激发光的频率范围无相互重合的频率范围。
23.优选地，所述芯片装置包括加样层和管路层，所述加样层、管路层从上至下依次设置，所述加样层包括加样孔和试剂管，所述加样孔用于添加样品，所述试剂管用于输送buffer溶液，所述管路层包括反应仓，所述反应仓内预埋有冻干试剂，所述冻干试剂包含荧光标记物质，其中，加样孔内的样品和buffer溶液混合后进入反应仓，从而得到被检测样
品。
24.优选地，所述的荧光标记的物质为fam、hex、cy5、cy5.5的至少两种，其中cy5、cy5.5荧光标记的被检测样品不能被同时检测，fam、hex荧光标记的被检测样品也不能被同时检测。
25.优选地，所述激发光源模块的还包括光源旋转装置，所述光源旋转装置用于使设置有多个光发射单元pcb板旋转，即本发明的pcb板上可设置光源旋转装置，使得因激发光引起的发射光的光斑在反应仓的分布均匀，使得检测部检测更加准确。
26.优选地，光发射单元为ld光源或led光源。
27.优选地，被检测样品的荧光标记为fam,hex,cy5 cy5.5,其中，当为ld光源时，可同时检测fam和cy5.5的荧光标记的被检测样品。
28.另一方面，本发明提供了一种pcr检测方法，包括：
29.采用光谱仪采集cycle 0
‑
40荧光强度a
i
，a
i
，i∈[0，40]。
[0030]
优选地，还包括对采集的cycle 0
‑
40荧光强度a
i
作归一化处理，得到d
i
＝c
i
‑
y
i
，i∈[1，40]。
[0031]
优选地，采集的cycle 0
‑
40荧光强度a
i
归一化处理方法具体包括：
[0032]
扣除基底：a1～a
40
作为信号，减去基底a0；
[0033]
b
i
＝a
i
‑
a0,i∈[1，40]
[0034]
平滑数据：对数据进行平滑处理；
[0035][0036]
确定基线：选择c3～c
10
，根据最小二乘法拟合出直线作为基线
[0037]
y
i
＝ax
i
b，i∈[0，40]
[0038]
数据扣除baseline，得到d
i
＝c
i
‑
y
i
，i∈[1，40]。
[0039]
优选地，还包括对归一化处理后得到d
i
的作一阶差分、二阶差分和三阶差分处理，分别为：
[0040]
一阶差分
[0041][0042]
二阶差分
[0043][0044]
三阶差分
[0045]
d
″′
i
＝d
″
i 1
‑
d
″
i
，i∈[4，36]。
[0046]
优选地，还包括取二阶差分最大值，具体为：
[0047]
选出三阶差分中符合“正负负负
”→“
正负负
”→“
正负”规律的最大点，且要求对应cycle一阶差分大于0，该坐标 1即为二阶差分最大值对应坐标，另
±
1共计3点。
[0048]
优选地，还包括多项式拟合，将上述3点按
[0049]
二次函数(y＝ax2 bx c)拟合，取
[0050]
[0051]
优选地，还包括求ct值，
[0052]
过x处做d
i
拟合曲线的切线，其与baseline交点的横坐标即为ct值，进而可得threshold，
[0053][0054]
优选地，还包括阴/阳性判别：
[0055]
若ct值≥38，判断为阴性；反之，则为阳性。
[0056]
优选地，还包括绘图，
[0057]
将d
i
按cycle数绘制曲线。
[0058]
与现有技术相对比，本发明的有益效果如下：
[0059]
(1)本发明提供的检测仪采用光谱仪，不使用滤镜，简化了结构的构成，减少了零部件；
[0060]
(2)本发明提供的光谱仪可以同时检测多路不同光谱，从而实现同时检测多个荧光标记，即可以同时检测多种不同核酸；提高了检测效率，打破了使用滤光镜一次只能检测一个发射光的局限，而且本发明提供的发射光的方向与检测部的方向垂直，避免激发光太强而出现过爆的现象。
[0061]
(3)本发明提供的检测方法，如求ct值的方法保证了其方法简单，准确率高，而且使得阴性和阳性的判别的可信度高。
[0062]
(4)本发明提供的激发光模块设置有光源旋转装置，光源旋转装置带动pcb板上的光发射单元旋转，使得发射光的光斑分配的更加均匀。
附图说明
[0063]
图1为本发明检测部检测得到的荧光光谱；
[0064]
图2为本发明提供的单通道fam扩增前后荧光值
‑
发射峰对比图；
[0065]
图3为本发明提供的fam通道荧光值与温度循环示意图；
[0066]
图4为本发明提供的fam通道按cycle取发射峰荧光值的曲线；
[0067]
图5为本发明提供的光源
‑
芯片
‑
光谱仪结构图；
[0068]
图6为本发明提供的光源
‑
芯片
‑
光谱仪光路图；
[0069]
图7为现有技术提供的激发光源模块结构示意图；
[0070]
图8为本发明提供的芯片装置的结构示意图；
[0071]
图9为本发明提供的的激发光源模块整体加样层的结构示意图；
[0072]
图10为本发明实施例的激发光源模块整体加样层的管路层的结构示意图；
[0073]
图11为本发明实施例得到的ct值；
[0074]
图12为本发明提供的荧光标记物质在发射光光斑上的分布情况；
[0075]
图13为本发明提供的光源旋转装置调整后荧光标记物质在发射光光斑上的分布情况。
具体实施方式
[0076]
下面结合附图，对本发明提供的一种pcr检测仪及其方法具体说明。
[0077]
本发明提供了一种pcr检测仪，包括激发光源模块、芯片和检测部；激发光源模块、
芯片装置和检测部，所述激发光源模块发出预设波长的激发光至所述芯片装置，在进行扩增反应时，所述检测部设置在所述芯片装置的反应仓上方；
[0078]
所述芯片装置包括反应仓，反应仓内能够容纳被检测样品；其中，被检测样品为为含有荧光标记的核酸片段溶液；
[0079]
所述激发光源模块用于发射激发光，激发光源模块发射的激发光能够照射置于反应仓的所述被检测样品；
[0080]
所述激发光源模块能够发射至少2个不同频段的激发光；
[0081]
其中，所述反应仓设置于所述激发光模块的激发光发射方向，所述检测部设置于反应仓的一侧，所述激发光照射所述反应仓后形成的发射光能够被检测部检测；其中，激发光的发射方向为水平方向，其激发光的发射方向与检测部是垂直的，所述检测部用于检测被检测样品因受激发光的照射发出的在垂直方向上的发射光；
[0082]
其中，本发明提供的所述检测部包括光谱仪；所述光谱仪检测光谱的波长范围是340
‑
850nm；所述光谱仪检测激发光和发射光。
[0083]
所述光谱仪检测至少2个不同频段的激发光的频段和强度，所述光谱仪检测至少2个不同频段的激发光和引起的发射光的频段和强度。
[0084]
如图1所示，本发明通过光谱仪对荧光标记物质fam和cy5.5两个通道同时检测的结果示意图；其中，图1中的ex1为fam激发光的峰值，em1为fam发射光的峰值，ex1为cy5.5激发光的峰值，em1为cy5.5发射光的峰值；2个不同频段的激发光包括激发光第一频段和激发光第二频段，所述激发光第一频段、激发光第二频段、发射光第一频段和发射光第二频段的频段之间互相不重合或部分重合。即光谱仪可同时检测fam激发光、fam发射光和cy5.5激发光和cy5.5发射光，其中，荧光标记物质可为fam、hex、cy5、cy5.5等，如下表所示其中，光源为ld光源。当为ld光源时，可同时检测fam和cy5.5的荧光标记的被检测样品，而cy5、cy5.5的荧光标记的被检测样品不能被同时检测，fam、hex荧光标记的被检测样品也不能被同时检测。
[0085]
其中，如fam和cy5.5的荧光标记的被检测样品，fam荧光标记的激发波长为494nm，发射波长为518nm，cy5.5荧光标记的激发波长为675nm，发射波长为695nm，即该fam荧光标记的激发波长和发射波长和cy5.5荧光标记的激发波长和发射波长无完全重合的频段。
[0086]
如：激发光的第一频段范围是450
‑
480nm，而激发光的第二频段的范围是540
‑
560nm，即激发光的第一频段范围与激发光的第二频段范围是完全无重合的频段范围。
[0087]
激发光的第一频段范围是520
‑
550nm，而激发光的第二频段的范围是540
‑
560nm，即激发光的第一频段范围与激发光的第二频段范围是部分无重合的频段范围。
[0088]
其中，本发明提供的激发光光源可为ld光源的波长、荧光标记物质fam、hex、cy5、cy5.5的激发波长和发射波长的列表，如下表1所示。
[0089]
表1为ld光源的波长、荧光标记物质fam、hex、cy5、cy5.5的激发波长和发射波长的列表；
[0090]
[0091]
作为优选实施方式，所述光谱仪检测至少2个不同频段的激发光的频段和强度，所述光谱仪检测至少2个不同频段的激发光和由激发光照射检测样品引起的发射光的频段和强度。
[0092]
所述至少2个不同频段的激发光频段至少包括激发光第一频段和激发光第二频段，2个不同频段的激发光引起的发射光的频段至少包括发射光第一频段和发射光第二频段；所述激发光第一频段、激发光第二频段、发射光第一频段和发射光第二频段的频段两两之间均无相互重合的频段范围。
[0093]
至少2个不同频段的激发光的激发光频段之间无相互重合的频段范围，所至少2个不同频段的激发光引起的所述发射光的不同发射光频段之间无相互重合的频段范围；各个激发光频段以及因激发光引起的各个发射光频段之间无相互重合的频段范围。
[0094]
作为优选实施方式，本发明提供的所述芯片装置包括加样层和管路层，所述加样层、管路层从上至下依次设置，所述加样层包括加样孔和试剂管，所述加样孔用于添加样品，所述试剂管用于输送buffer溶液，所述管路层包括反应仓，所述反应仓内预埋有冻干试剂，所述冻干试剂包含荧光标记物质，其中，加样孔内的样品和buffer溶液混合后进入反应仓，从而得到被检测样品。其中buffer溶液为缓冲溶液，缓冲溶液指的是由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的ph值相对稳定。
[0095]
作为优选实施方式，本发明提供的激发光源模块的还包括光源旋转装置，所述光源旋转装置用于使设置有多个光发射单元pcb板旋转，即本发明的pcb板上可设置光源旋转装置，使得因激发光引起的发射光的光斑在反应仓的分布均匀，使得检测部检测更加准确。
[0096]
参阅图5所示，其为本发明实施例的光源
‑
芯片
‑
光谱仪光路图示意图；本实施例系统包括芯片装置30、激发光模块6、温控模块4以及检测部5，所述激发光模块6发出预设波长的激发光至所述芯片装置，发生反应后，通过荧光检测部5获取荧光信息完成检测，所述温控模块4控制所述芯片装置内的温度，以使得芯片装置内的试剂达到最佳的反应状态。在本实施例中在进行扩增反应时，所述检测部5设置在所述芯片装置的反应仓上方。
[0097]
参阅图6所示，本发明实施例提供的发射光检测方法所应用的装置包括：激发光源模块6、被检测样品21、检测部5，光发射单元照射所述被检测样品21，用以激发所述被检测样品21，以使所述检测部5检测所述被检测样品产生的发射光；所述被检测样品21包含荧光基团，用以在激发光的激发下产生发射光；所述检测部设置在所述发射光的光路上，用以捕捉并检测所述发射光；具体而言，在图6中示出了光路图，而激发光的光路和发射光的光路采用不同的箭头进行了表示，以示两种光的不同。
[0098]
具体地，本领域技术人员可以理解的是检测部6的作用是捕捉并检测发射光，在实际应用过程中，光谱仪可为荧光光谱仪，其允许同时读取多个发射光和激发光，从而可以进行检测。其中，本发明中提供的光谱仪不包括滤光片，因此，可以同时检测多个不同频段的激发光和因激发光引起的发射光。如光谱仪可为滨松的c12889ma。
[0099]
作为优选实施方式，所述激发光源模块包括多个光发射单元，所述光发射单元为发光二极管或半导体激光器。
[0100]
所述激发光源模块包括pcb板、光纤合束器、至少一个发光二极管以及至少一根与每一个发光二极管对应的光纤；
[0101]
发光二极管设置于pcb板一侧；在每一发光二极管的输出端设置有一光纤耦合器，每一光纤耦合器分别与一光纤耦合，通过光纤耦合器将对应波长的激发光耦合于光纤中，并通过光纤传输；
[0102]
光纤合束器将各个光纤按预设方式排列合束为一体，在所述的光纤合束器的输出端还设置有光纤准直器，用以将光纤内的激发光转变成准直光；
[0103]
所述至少一个发光二极管用于发射至少2个不同频段的激发光，所述至少2个不同频段的激发光的频率范围无相互重合的频率范围。
[0104]
具体地，如图7所示，本发明与现有技术的激发光源模块区别在于，本发明提供的激发光源模块不包含滤光片63，而现有技术中的激发光源模块必须包含滤光片63；具体如图7所示，本发明提供的光学激励部件包括激发光源模块，激发光模块6采用体积较小的发光模块，通过采用开关对激发源模块中的激发光源进行切换，以产生不同波长的激发光。激发光模块6包括pcb板61，用以承载激发光源，如led光源或ld光源，还可以是其他光源，led光源设置在pcb板的一侧，在实施例中，led光源包括若干设置的led灯62，在每个led灯的前端设置有一个光纤耦合器64，每一光纤耦合器64分别与一光纤65耦合，通过光纤耦合器64将对应波长的激发光耦合于光纤中，并通过光纤传输；还包括光纤合束器66，其将各个光纤按预设方式排列合束为一体，在所述光纤合束器66的输出端还设置有光纤准直器67，用以将光纤内的激发光转变成准直激发光。
[0105]
作为优选实施方式，本发明提供的所述激发光源模块的还包括光源旋转装置，所述光源旋转装置用于使设置有多个光发射单元pcb板旋转，即光源旋转装置可以使pcb板旋转，从而带动光发射单元即led光源或ld光源旋转，即本发明的pcb板上可设置光源旋转装置，使得因激发光引起的发射光的光斑在反应仓的分布均匀，使得检测部检测更加准确。
[0106]
其中如图12
‑
13所示，图12为本发明提供的激发光源模块在没有旋转的情况下，即没有调整的情况下，荧光标记物质在反应仓112上的分布情况，即分布不均匀，甚至可能不能分布在反应仓上，或荧光标记物质并没有分布在反应仓上；如图12所示，图13为本发明提供的光源旋转装置调整后的荧光标记物质在反应仓112上的分布情况，因光源旋转装置调整后，荧光标记物质在反应仓112的分布情况分布均匀，且均能分布在同一反应仓中，解决现有技术分布不均匀的技术问题，如图13所示。
[0107]
激发光源模块工作过程：启动led灯62，发出led光源，并经过光纤耦合器将对应波长的激发光源导入光纤中，多个光纤通过光纤合束器66汇聚，并将其中传递的激发光源合为一束，并最终通过光纤准直器将传输光转变成准直激发光照射至目标，进行检测；其中led灯为多个，可以同时发出不同波长的激发光，且不需要滤光片，本发明使用光谱仪可以识别不同波长的发射光，因此不需要滤光片。
[0108]
其中，参图8所示，本发明提供的反应器为芯片装置，具体地，本发明的芯片装置包括设置在最上端的加样层3、设置在加样层3下侧的垫片2、设置在垫片2下侧的管路层101，以及设置在最下侧的密封膜104，其中，所述加样层3上侧设置有加样孔302，用以向芯片内添加样品，注入芯片内的样品经过提取、纯化、扩增发生反应。其中，本实施例的加样层与管路层通过卡条304与设置在管路层101侧部的限位架106活动连接，相应的，在限位架106的内侧设置有第一卡槽107，第一卡槽通过卡条相互配合连接，以实现加样层和管路层的相对位置切换和固定。其中，密封膜粘贴在管路层101的下侧，以实现密封。
[0109]
本发明的第一卡槽107的下侧的限位架侧面上还设置有第二卡槽109，相应的，垫片2的侧壁上还设置有第二卡条(图中未示出)，通过第二卡条与第二卡槽的相互配合连接，以实现垫片2与管路层101的滑动连接，两者能够相对位置切换以及固定。本发明实施例的垫片2的下侧还设置有第一滑轨202，相应的，在管路层101的上侧面设置有第二滑槽108，第一滑轨202通过与第二滑槽108配合连接，以实现垫片与管路层101的滑动连接，两者能够相对位置切换以及固定。本实施例的第二滑槽108设置在管路层上的限位架106的内侧。所述垫片2的端部设置若干相间排列的凹口与凸起，其中，所述第一滑轨202设置在最外侧凸起的底面上。
[0110]
参阅图8所示，本发明的加样孔上设置有加样孔盖303，用以进行密封。在加样层和管路层还设置卡扣结构，在加样层的一侧设置有第一卡扣301，第一卡扣301的下侧伸出端伸出所述加样层的底端，在将加样层和管路层配合安装在一起后，通过第一卡扣卡接在管路层的侧面上，以防止加样层和管路层分离。本实施例的管路层上设置有两个第一单阀102，用以分别向管路中注入样品及反应试剂；在管路层上还设置有双阀103，用以注入试剂及样品，双阀103通过管路与反应仓112连通，结合图5所示，在所述垫片2的两侧还设置有把手201，方便对芯片装置进行提取。在本发明实施例中，所述反应仓设置在管路层的边缘，并且，反应仓为半椭圆形结构，既能够使反应试剂反应，又能够在使用时，能够通过凸出的半椭圆形结构实现方便定位及安装。
[0111]
参图8所示，本发明的管路层上设置有一排刺针105，通过在抽取垫片后，将刺针与加样层内的试剂连通，试剂中标记的荧光序列与对应位置的核酸刺针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。在所述刺针的外侧还设置有一挡板，其在加样层与管路层配合时，起到阻挡及定位作用。
[0112]
具体而言，在本发明实施例中，在加样状态时，所述加样层内设置有若干组试剂管，所述加样层3通过其上的卡条304与第一卡槽107卡接，在初始安装状态时，加样层3自上而下与管路层101配合，通过垫片2将刺针与试剂管内的试剂隔离，防止在运输过程中的振动造成刺针与试剂混合，避免刺破。在需要进行试验时，将垫片2沿第二滑槽108向外抽出，垫片2沿第二滑槽向外抽出后，向下按压加样层3，使得加样层上的卡条304与第二卡槽109卡接，此时，设置在管路层上的刺针与加样层的试剂混合，将试剂引入管路层内进行测定。
[0113]
具体而言，本发明通过设置垫片结构，使得芯片装置能够在储存试剂，运输过程中，完好保存，在使用时，只需将垫片抽出，即能够将试剂引入管路层中。
[0114]
参图9所示，其为本发明实施例的加样层的结构示意图；在本实施例的加样孔302的下方为加样仓，加样仓能够连接一装载试剂的试剂管，在加样仓的下部设置有试剂出口312，在试剂出口312与加样仓之间设置有密封结构，用以进行密封。在所述加样仓的一侧还设置有加压结构，其包括管壁305，在管壁内部设置有活塞308，活塞308向加样仓移动，推动其内的试剂向试剂出口流出；在所述活塞308的活塞杆端部设置有密封圈311，用以进行密封。
[0115]
参图9所示，本实施例的活塞杆上还设置有螺帽307，通过与螺帽307螺纹连接，实现相对旋转运动，相应的，在活塞杆的一端设置有输出结构，如气缸，油缸，也可通过转动输出结构连接活塞杆，如电机、丝杠，此时，活塞杆做旋转运动，只需能够推动试剂向试剂出口流出即可。相应的，在螺帽的外侧套设有一导向套306，管壁内侧设置有相应的轴肩，用以对
导向套306进行定位及固定；在导向套306的两端外侧还设置有卡环314，用以卡住相应的导向套306。在导向套306的外侧还设置有护套309，用以对活塞杆、螺帽、以及导向套进行保护。在对管路层进行试剂注射时，通过活塞向加样仓移动，增加其内的压力，以推动试剂向试剂出口流动，实现注入试剂，而在实际应用过程中，为了配合试剂的注入，提高试剂注入效率，还可以通过其他试剂管的向外吸，配合当前实际管的向内推，实现试剂的高效注入。本发明实施例设置若干组试剂管，在本实施例中，设置五组试剂管，向管路层施加试剂，试剂可以是裂解液、洗脱液或清洗液等，能够大大提高使用效率。
[0116]
参图9所示，在加样层下方设置第二卡扣310，第二卡扣设置在与第一卡扣相对的一侧面上，来防止加样层滑动。
[0117]
参阅图10所示，其为本发明实施例的管路层的结构示意图，本实施例的管路层设置有所述反应仓112、第一缓冲仓110、第二缓冲仓111以及对样品进行纯化的纯化仓114，其中，双阀的第一端通过第一管路118、第二管路115与纯化仓114连接；双阀的第二端与第二缓冲仓111连通，第二缓冲仓111通过管路与第一缓冲仓110连接，第一缓冲仓和第二缓冲仓之间的管路上还设置有一管路分支，该管路分支上设置有第二单阀，该管路分支另一端连接在所述纯化仓114上，第一缓冲仓通过第三管道116、第四管道117与纯化仓114连接；在管路层上还设置有若干连接孔119，以进行连接。
[0118]
具体而言，所述第一管路118包括竖向管路与横向管路，通过长距离输送洗脱后的核酸物质进入扩增仓，第二管路115包括竖向管路与横向管路，其一端与纯化仓连接，另一端与第一管路连为一体。
[0119]
具体而言，所述第三管路116，其为多向弯折管，其一端与第一缓冲仓连接，另一端与第一进液口连接；所述第四管路117的一端与第一进液口连接，另一端与纯化仓连接，在第四管路117上还设置有进样口与第一单阀。
[0120]
具体而言，进样口用以加入样品，第一进液口用以加入裂解液，然后打开第一单阀，使得样品和裂解液进行在混合反应，在混合过程中，可以利用与样品口连接的活塞杆和与第一进液口连接的活塞杆进行推吸操作，实现样品与裂解液的充分混合，生成第一反应物，第一反应物为液体，所述液体通过第四管路117进入所述纯化仓内，纯化仓内置磁珠，纯化仓是进行核酸提取和纯化的反应仓，然后关闭第一单阀，打开第二单阀，向所述第二进液口注入第二试剂，第二试剂为清洗液，所述第二试剂经过第二试剂口连接的管路进入所述纯化仓内，对纯化仓内的物质进行清洗，向第三进液口注入第三试剂，第三试剂为清洗液，所述第三试剂经过所述与其连接的管路进入所述纯化仓内，对纯化仓内的核酸物质进行再次清洗，向第四进液口注入第四试剂，第四试剂为洗脱液，所述第四试剂经过与其连接的管路进入所述纯化仓内，并将纯化仓内的核酸物质由其设置的磁珠上洗脱，得到核酸物质，将所述核酸物质经过第一管路115和第二管路118引入所述反应仓112内，以进行扩增反应。本发明在对管路层进行试剂注射时，通过活塞向加样仓移动，增加其内的压力，以推动试剂向试剂出口流动，实现试剂或样品的注入；本发明设置若干组活塞结构，定时向管路层施加样品或者试剂，能够大大提高使用效率。所述扩增仓设置在管路层的边缘，并且，反应仓112为半椭圆形结构，既能够使反应试剂反应，又能够在使用时，能够通过凸出的半椭圆形结构实现方便定位及安装，其中芯片装置是透明的。
[0121]
尤其，本发明设置垫片及相关连接结构，一方面能够使得加样层与管路层之间能
够完好的连接，避免产生震动，另一方面能够使得刺针具有较好的放置空间，垫片以及加样层滑动安装，方便拆卸。在初始安装状态时，加样层自上而下与管路层配合，通过垫片将刺针与试剂管内的试剂隔离，防止在运输过程中的振动造成刺针与试剂混合，避免刺破。在需要进行试验时，将垫片沿第二滑槽向外抽出，垫片沿第二滑槽向外抽出后，向下按压加样层，使得加样层上的卡条与第二卡槽卡接，此时，设置在管路层上的刺针与加样层的试剂混合，将试剂引入光路层内进行测定。本发明通过设置垫片结构，使得芯片装置能够在储存试剂，运输过程中，完好保存，在使用时，只需将垫片抽出，即能够将试剂引入管路层中。
[0122]
如图2所示，本发明提供的图2为单通道fam扩增前后荧光值
‑
发射峰对比图；其中，cycle 0为未扩增的荧光光谱曲线，cycle 45为扩增了45个循环后的荧光光谱曲线；如图3所示，本发明提供的图3为fam通道荧光值与温度循环示意图；其中横坐标为时间，纵坐标为fam通道发射峰处的荧光值，由其可看出荧光曲线随温度的变化趋势，f5为荧光值随时间的变化曲线，f6为温度随时间的变化曲线，图3引出图4按照cycle取荧光值的曲线，图4为本发明提供的fam通道按cycle取发射峰荧光值的曲线，采光的时间点在pcr扩增过程的延伸阶段结束前3s，得到曲线后可进行一种pcr仪检测方法的数据处理流程；
[0123]
具体为，一种pcr检测方法，包括：
[0124]
原始数据
[0125]
由滨松微型光谱仪采集的cycle 0～40荧光强度
[0126]
a
i
，i∈[0，40]
[0127]
扣除基底
[0128]
a1～a
40
作为信号，减去基底a0[0129]
b
i
＝a
i
‑
a0,i∈[1,40]
[0130]
平滑数据
[0131]
以matlab自带函数smoothdata(参数method：sgolay、winsize：9)对数据进行平滑处理，
[0132][0133]
或以savitzky
‑
golay平滑算法函数sg_smooth去除基底的数据b
i
平滑处理，其中参数为窗口大小winsize:3，阶数degree:6；
[0134]
b
i
→
c
i
[0135]
确定基线baseline
[0136]
选择c3～c
10
(索引可选)，根据最小二乘法拟合出直线作为基线baseline
[0137]
y
i
＝ax
i
b,i∈[0,40]
[0138]
归一化
[0139]
数据扣除baseline
[0140]
d
i
＝c
i
‑
y
i
，i∈[1,40]
[0141]
一阶差分
[0142][0143]
二阶差分
[0144][0145]
三阶差分
[0146]
d
″′
i
＝d
″
i 1
‑
d
″
i
，i∈[4，36]
[0147]
取二阶差分最大值(计算二阶差分的最大值，可以通过计算其三阶差分来得到)
[0148]
具体为：选出三阶差分中符合“正负负负”或“正负负”或“正负”规律的最大点(要从二阶差分中找最大点，可以比较该点的对应的三阶差分的前中后各点)，且要求对应cycle一阶差分大于0(三种规律依次筛选，前一种成功筛选则不进行下一种筛选；反之，再进行)，该坐标 1即为二阶差分最大值对应坐标，另二阶差分最大值对应坐标
±
1共计3点；
[0149]
多项式拟合
[0150]
将上述三点按二次函数(y＝ax2 bx c)拟合，取
[0151][0152]
切线求ct值
[0153]
过x处做d
i
拟合曲线的切线，其与baseline交点的横坐标即为ct值，进而可得threshold阈值
[0154][0155]
阴/阳性判别
[0156]
ct值≥38，判断为阴性；反之，则为阳性
[0157]
绘图
[0158]
将d
i
按cycle数绘制如图11中曲线。
[0159]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围之内。