化合物eutyscoparolH和L及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用与流程

化合物eutyscoparol h和l及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药生物技术领域，具体涉及化合物eutyscoparol h和l及其制备方法 和在制备抗菌药物中的应用。


背景技术：

2.eutypella属真菌分布广泛，次级代谢产物丰富多样。主要代谢产物包括萜类、细胞松 弛素类、甾体类、内酯类，其中萜类主要以海松烷型二萜,倍半萜为主。并且，这些次级代 谢产物显示了抗肿瘤、抗菌、抗炎以及抗增殖等多种生物活性。sesquiterpenes类化合物是 真菌中的一类代谢产物，结构特点为分子中含有15个碳原子组成的三个异戊二烯单元，具 有链状、环状等多种骨架结构。该类型分子已被报道具有多种生物活性。


技术实现要素：

3.本发明的第一个目的是提供具有抗菌活性的化合物eutyscoparol h和eutyscoparol i。
4.本发明的化合物eutyscoparol h和eutyscoparol i，其结构如式(i)中所示：
[0005][0006]
本发明的第二个目的是提供一种化合物eutyscoparol h和eutyscoparol i的制备方法，该 制备方法中所述的化合物eutyscoparol h和eutyscoparol i从植物内生真菌eutypella scoparia scbg
‑
8的发酵培养物中分离制备得到的，具体包括以下步骤：
[0007]
(1)制备内生真菌eutypella scoparia scbg
‑
8的固体发酵培养物，用乙酸乙酯萃取该 固体发酵培养物，将乙酸乙酯萃取液经浓缩后得浸膏；
[0008]
浸膏经过硅胶柱层析，用石油醚
‑
乙酸乙酯以体积比为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1， 2:1，1:1，0:1作为洗脱剂，梯度洗脱；收集正己烷
‑
乙酸乙酯体积比2:1洗脱获得的且经tlc 薄层层析以正己烷：丙酮＝5:1v/v展开得rf＝0.5
‑
0.6的组分fr.4；
[0009]
将组分fr.4经反相柱色谱，用甲醇
‑
水体积比70:30,75:25,80:20,85:15,90:10,95:5,100:0, 丙酮梯度洗脱，得到14个亚组分fr.4.1
‑
fr.4.14，收集甲醇
‑
水体积比80:20洗脱获得的且经 tlc薄层层析以正己烷：丙酮＝5:1v/v展开得rf＝0.2
‑
0.6的组分fr.4.6；
用半制备hplc 分离纯化组分fr.4.6，得到化合物eutyscoparol h和化合物eutyscoparol i。
[0010]
所述的半制备hplc分离纯化是使用ymc
‑
ods
‑
a/aq柱，流动相为体积比70:30的乙 腈/水，流速为3ml/min，收集保留时间为10min的洗脱组分，得到化合物eutyscoparol h， 收集保留时间为11.5min的洗脱组分，得到化合物eutyscoparol i。
[0011]
所述的制备内生真菌eutypella scoparia scbg
‑
8的固体发酵培养物具体步骤为：挑取内 生真菌scbg
‑
8的菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培 养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1ml/g的接种量接种于大米培养基中，28℃条件 下培养30天，制得内生真菌scbg
‑
8的固体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖液体培养基， 每升是通过以下方法配制的：用500ml的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马 铃薯汁，再加入葡萄糖20g、kh2po
4 3g、mgso
4 1.5g、维生素b
1 10mg，用水补足至1000 ml，灭菌制得；所述的大米培养基是通过以下方法配制的：按每300g大米与360ml水混 合灭菌制得。
[0012]
本发明通过实验发现，化合物eutyscoparol h和化合物eutyscoparol i对金黄色葡萄球菌、 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的ic
50
值为6.25μg/ml。阳性对照物万古霉素对以上两种革兰氏 阳性菌的ic
50
值为1.25μg/ml。此结果表明：本发明的化合物eutyscoparol h和化合物 eutyscoparol i具有比较显著的抗菌活性。
[0013]
因此，本发明的第三个目的是提供化合物eutyscoparol h或化合物eutyscoparol i，或其 药用盐在制备抗菌药物中的应用。所述的抗菌药物优选为抗金黄色葡萄球菌，抗耐甲氧西 林金黄色葡萄球菌药物。
[0014]
本发明的第四个目的是提供一种抗菌药物，该抗菌药物包含化合物eutyscoparol h或化 合物eutyscoparol i，或其药用盐作为活性成分。优选，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球 菌，抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物。
[0015]
本发明的第五个目的是提供内生真菌eutypella scoparia scbg
‑
8在制备化合物 eutyscoparol h或化合物eutyscoparol i中的应用。
[0016]
与现有技术相比，本发明的优势在于：
[0017]
本发明从内生真菌eutypella scoparia scbg
‑
8中分离制备得到化合物eutyscoparol h和 化合物eutyscoparol i，该类化合物eutyscoparol h和化合物eutyscoparol i具有比较显著的抗 菌活性，可以用于制备抗菌药物，为研究与开发新的抗菌药物提供了候选化合物，为开发 利用植物内生菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
[0018]
本发明的海洋真菌eutypella scoparia scbg
‑
8已公开于wenge zhang,miaomiao wang, sha zha,kangping xu,guishan tan,shengxiang qiu,zhenxing zou,haibo tan.eutyscoparolsa
‑
g,polyketide derivatives from endophytic fungus eutypella scoparia scbg
‑
8.fitoterapia, 2020,146,104681.该菌株本技术人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
附图说明
[0019]
图1是化合物eutyscoparol h的1h nmr谱；
[0020]
图2是化合物eutyscoparol h的
13
c nmr谱；
[0021]
图3是化合物eutyscoparol h的1h
‑1h cosy谱；
[0022]
图4是化合物eutyscoparol h的hsqc谱；
[0023]
图5是化合物eutyscoparol h的hmbc谱；
[0024]
图6是化合物eutyscoparol h的noesy谱；
[0025]
图7是化合物eutyscoparol h的hresims谱；
[0026]
图8是化合物eutyscoparol h的uv谱；
[0027]
图9是化合物eutyscoparol h的cd谱；
[0028]
图10是化合物eutyscoparol h的ir谱；
[0029]
图11是化合物eutyscoparol i的1h nmr谱；
[0030]
图12是化合物eutyscoparol i的
13
c nmr谱；
[0031]
图13是化合物eutyscoparol i的1h
‑1h cosy谱；
[0032]
图14是化合物eutyscoparol i的hsqc谱；
[0033]
图15是化合物eutyscoparol i的hmbc谱；
[0034]
图16是化合物eutyscoparol i的noesy谱；
[0035]
图17是化合物eutyscoparol i的hresims谱；
[0036]
图18是化合物eutyscoparol i的uv谱；
[0037]
图19是化合物eutyscoparol i的cd谱；
[0038]
图20是化合物eutyscoparol i的ir谱；
具体实施方式
[0039]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0040]
实施例1
[0041]
1、内生真菌eutypella scoparia scbg
‑
8的分离纯化和鉴定
[0042]
本发明的内生真菌eutypella scoparia scbg
‑
8是2016年9月，从中国科学院华南植物 园(scbg)澳洲植物园美丽薄子木(leptospermum brachyandrum)叶片中分离得到的，通过 its序列分析进一步鉴定该内生菌株，genbank登录号为:mn788605，经blast比对，同源 分析，鉴定该菌株属于eutypella属真菌，命名为eutypella scoparia scbg
‑
8。
[0043]
2、eutypella scoparia scbg
‑
8的固体发酵
[0044]
将活化的内生真菌eutypella scoparia scbg
‑
8菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基 (每升培养基是通过以下方法配制的：用500ml的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min， 过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、kh2po
4 3g、mgso
4 1.5g、维生素b
1 10mg，用水 补足至1000ml，灭菌制得)中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后 将种子液按0.1ml/g大米培养基的接种量接种于大米培养基(该培养基是通过以下方法配 制的：将每300g大米与360ml水混合灭菌混合，121℃高压灭菌20min，冷却，制得) 中，28℃条件下培养30天，制得scbg的固体发酵培养物。
[0045]
3、化合物eutyscoparol h和化合物eutyscoparol i的制备
[0046]
(1)往scbg的固体发酵培养物中加入乙酸乙酯，浸泡提取24小时，重复提取3次， 提取液合并后经浓缩得浸膏(45g)。
[0047]
浸膏经过硅胶柱层析，用石油醚
‑
乙酸乙酯以体积比为100:1，50:1，20:1，10:1，5:
1， 2:1，1:1，0:1作为洗脱剂，梯度洗脱；收集正己烷
‑
乙酸乙酯体积比2:1洗脱获得的且经tlc 薄层层析以正己烷：丙酮＝5:1v/v展开得rf＝0.5
‑
0.6的组分fr.4；
[0048]
将组分fr.4经反相柱色谱，用甲醇
‑
水体积比70:30,75:25,80:20,85:15,90:10,95:5,100:0, 丙酮梯度洗脱，得到14个亚组分fr.4.1
‑
fr.4.14，收集甲醇
‑
水体积比80:20洗脱获得的且经 tlc薄层层析以正己烷：丙酮＝5:1v/v展开得rf＝0.2
‑
0.6的组分fr.4.6；组分fr.4.6使用 ymc
‑
ods
‑
a/aq柱，流动相为体积比70:30的乙腈/水，流速为3ml/min，收集保留时间 为10min的洗脱组分，得到化合物eutyscoparol h，收集保留时间为11.5min的洗脱组分， 得到化合物eutyscoparol i。
[0049]
4、化合物eutyscoparol h和化合物eutyscoparol i的结构鉴定
[0050]1h
‑
nmr、
13
c
‑
nmr、hmbc核磁共振谱图用bruker advance
‑
600核磁共振光谱仪测定， 以四甲基硅烷(tms)为内标；esi
‑
ms数据用vg autospec
‑
3000型质谱仪测定；紫外光谱 用岛津uv
‑
2600分光光度计测定，其结构鉴定如下：
[0051]
如图1
‑
20所示，图1是化合物eutyscoparol h的1h nmr谱；图2是化合物eutyscoparol h的
13
c nmr谱；图3是化合物eutyscoparol h的1h
‑1h cosy谱；图4是化合物eutyscoparol h的hsqc谱；图5是化合物eutyscoparol h的hmbc谱；图6是化合物eutyscoparol h的 noesy谱；图7是化合物eutyscoparol h的hresims谱；图8是化合物eutyscoparol h的 uv谱；图9是化合物eutyscoparol h的cd谱；图10是化合物eutyscoparol h的ir谱；图11是化合物eutyscoparol i的1h nmr谱；图12是化合物eutyscoparol i的
13
c nmr谱；图 13是化合物eutyscoparol i的1h
‑1h cosy谱；图14是化合物eutyscoparol i的hsqc谱； 图15是化合物eutyscoparol i的hmbc谱；图16是化合物eutyscoparol i的noesy谱；图 17是化合物eutyscoparol i的hresims谱；图18是化合物eutyscoparol i的uv谱；图19 是化合物eutyscoparol i的cd谱；图20是化合物eutyscoparol i的ir谱；
[0052]
化合物eutyscoparol h为黄色晶体(其核磁数据如表1所示)；根据hresims[m h]

m/z 335.1860，c
19
h
27
o5，计算值为335.1853，确定化合物的分子式为c
19
h
26
o5，不饱和度为7； 1
h
‑
nmr谱显示一个芳香氢质子信号[δh 7.06(1h,s,h
‑
5)],一个反式双键烯氢质子信号[δh 5.31(1h,m,h
‑
10)],三个甲基信号[δh 0.94(3h,d,j＝7.0hz,h
‑
18),1.74(3h,s,h
‑
12),1.72 (3h,s,h
‑
13)]。
13
c
‑
nmr谱以及hsqc谱显示化合物一共19个碳，包含8个季碳，包括一个羰 基基团(δc 132.8)、3个甲基、5个亚甲基和3个甲基。化合物eutyscoparol h的平面结构结构通 过进一步分析其cosy、hsqc以及hmbc等二维谱图得以确定(图4
‑
6)，化合物eutyscoparolh的绝对构型是通过x单晶衍射法得以确定式(ii)。
[0053]
化合物eutyscoparol i为黄色晶体(其核磁数据如表1所示)；根据hresims[m h]
m/z 335.1849，c
19
h
27
o5，计算值为335.1853，确定化合物的分子式与化合物1相同为 c
19
h
27
o5，不饱和度为7；1h
‑
nmr谱显示一个烯烃质子信号[δ
h 5.31(s,h
‑
3)]；3个甲基信 号[δ
h 0.93(d,j＝6.9hz,h3‑
13),1.6(s,h3‑
14),0.77(s,h3‑
15)]。
13
c
‑
nmr谱以及hsqc谱显 示化合物1中有15个碳信号，包括2个季碳(包括1个烯基碳)，4个次甲基，6个亚甲 基，以及3个甲基。化合物eutyscoparins g的平面结构结构通过进一步分析其cosy、hsqc 以及hmbc等二维谱图得以确定(图13
‑
15)，化合物eutyscoparol i的绝对构型是通过通 过x单晶衍射法得以确定式(ii)。
[0054]
经过上述方法分离的目标化合物eutyscoparol h和化合物eutyscoparol i的结构式如式(i) 所示：
[0055][0056]
表1化合物eutyscoparol h和eutyscoparol i的核磁数据(500mhz/125mhz,δin ppm,j in hz)
[0057]
[0058][0059][0060]
实施例2
[0061]
采用mhb(microbroth dilution in mueller
‑
hinton broth medium)法测试化合物 eutyscoparol h和eutyscoparol i的抗菌活性。
[0062]
1、试验用试剂：将本发明制备的化合物eutyscoparol h和eutyscoparol i用二甲基亚砜 (dmso)溶解得浓度为1mg/ml的母液，再用96孔板梯度稀释。阳性对照为万古霉素。
[0063]
本实验所用菌株为s.aureus(26003)和mrsa (jcsc 3063)。
[0064]
2、实验方法：按照clsi指南，采用mhb(microbroth dilution in mueller
‑
hinton brothmedium)法测定mic值，以刃天青为可见指示剂，评估化合物的抗菌活性。取对数生长期 的s.aureus(26003)和mrsa (jcsc 3063)细菌，新鲜hb培养基稀释以uv
‑
6000分光光 度计调整至od
600
＝0.07,将上述细菌悬液与刃天青以体积比6:9混匀接种于96孔板,每孔 加入180μl的细菌悬液以及20μl 1mg/ml化合物eutyscoparol h和eutyscoparol i母液， 并设2个空白孔对照，2个阳性对照，梯度稀释后于37℃、5％co2培养箱培养，16
‑
20h 后观察颜色变化。每次试验重复3次，并计算其mic值。
[0065]
3、实验结果如表3所示：
[0066]
表3
[0067][0068]
本发明制备的化合物eutyscoparol h和eutyscoparol i对革兰氏阳性菌
s.aureus(26003) 和mrsa (jcsc 3063)的mic值为6.25μg/ml。阳性对照物万古霉素对s.aureus(26003)和 mrsa (jcsc 3063)的mic值为6.25μg/ml。此结果表明：本发明的化合物eutyscoparol h 和eutyscoparol i具有比较显著的抗菌活性，因此，本发明为研究与开发新的抗菌药物提供 了候选化合物，为开发利用植物内生菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
[0069]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发 明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进 和润饰也应视为本发明的保护范围。