一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物、筛选方法及其应用与流程

1.本发明属于眼部衰老相关疾病检测和治疗技术领域，具体涉及一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物、试剂盒及其筛选方法和应用。


背景技术：

2.衰老是“随时间不断逐步积累的对疾病的易感性”，随着年龄增长，衰老细胞在组织中逐渐累积，进而导致组织或个体的正常和病理性老化。衰老也是多种眼部疾病的主要诱因，如年龄相关性黄斑变性（age
‑
related macular degeneration, amd）。大量研究表明，amd的发生与视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, rpe）细胞的衰老及功能降低密切相关。临床及体外研究发现，老年人rpe细胞的复制能力及对损伤应答能力在衰老过程中不断减退，吞噬功能不断下降，导致过度代谢产物堆积，尤其是脂褐素的沉积。进一步，研究发现这些代谢废物可以触发慢性炎症，进而导致drusen的沉积。年龄相关性眼部疾病研究（age
‑
related eye disease study，areds）流行病学调查显示，到2020年，amd患病人数将达约8000万，将成为严重的公共卫生问题。随着生活习惯和社会环境的改变，我国amd患病率也呈上升趋势，这将带来巨大的经济与社会负担。因此需要寻找一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种原理科学、操作方便的一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物。
4.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物，包括rnf149蛋白、rnf123蛋白、armc8蛋白、pcnp蛋白、fbxo9蛋白、fbxl18蛋白中的至少一种。
5.蛋白标志物的筛选方法，包括以下步骤：（1）不同年龄人类rpe细胞的收集；（2）不同年龄人类rpe细胞的全蛋白提取；（3）不同年龄人类rpe细胞的分泌蛋白提取；（4）生物质谱样品的制备；（5）生物质谱分析；（6）人类rpe细胞年龄相关细胞全蛋白分析；（7）不同年龄眼球捐献者hrpe细胞年龄相关分泌蛋白分析；（8）年龄相关蛋白在不同年龄眼球捐献者rpe细胞中的表达验证，最后筛选出相关蛋白标志物。
6.步骤（1）的具体操作过程为：
①
摘取捐献者的眼球（去世72小时以内）眼球，用青链霉素混合液过夜浸泡消毒；去除角膜、晶状体以及玻璃体，分离去掉视网膜神经上皮层，将眼球后段制成眼杯；
②
将眼杯置于10cm培养皿中，用毛细吸管轻轻从眼杯中吸出视网膜神经上皮层；以pbs液漂洗眼杯2次，吸干；
③
向眼杯中加入0.25%胰蛋白酶
‑
edta的消化液，于37℃恒温箱中消化20min；
④
加入有血清的培养基，中止消化，吸出眼杯内的细胞悬液，离心（1000r/min）5min，弃上清，加入有血清培养基重悬细胞，置于培养瓶中培养；
⑤
用pbs清洗眼杯后，再次消化20 min，收集细胞悬液，离心（1000r/min）5min，弃上清，加入有血清培养基重悬细胞，置于培养瓶中培养。
7.步骤（2）的具体操作过程为：
①
培养上述不同年龄人类rpe细胞，待细胞贴壁长至50%以上后，去除培养基，用pbs洗3次，加入1.5 ml的pbs用细胞刮刀将细胞刮下，2000 rpm离心3 min，去除上清，收集细胞；
②
向收集的细胞中加入500 μl含有cocatail的netn裂解液，超声裂解；将超声后的细胞裂解液20000 g离心30 min；取上清；
③
用brandford法分别测定样本浓度，并将样本浓度定量到1 μg/μl。
8.步骤（3）的具体操作过程为：
①
培养上述不同年龄人类rpe细胞，当细胞贴壁并长致70
‑
80%左右后，去除培养基；利用生理盐水润洗细胞3次，加入无血清培养基继续培养24 h。随后收集无血清培养基，并用超滤管（5 kda）将其浓缩至100 μl；随后向样品中分别加入50 μl含有cocatail的netn裂解液，超声裂解；将超声后的细胞裂解液20000 g离心30 min。取上清。
9.②
用brandford法分别测定样本浓度，并将样本浓度定量到0.5 μg/μl。
10.步骤（4）的具体操作过程为：
①
样品分组：将细胞的全蛋白样品和分泌蛋白样品分别按照捐献者年龄分为年轻组（y，＜18岁）、中年组（m，35
‑
45岁）和老年组（o，<55岁）；
②
蛋白还原：分别取50 μg rpe细胞的全蛋白及分泌蛋白，加入100 mm 的teab补足至50 μl，向样品中分别加入2.5 μl 200 mm的tcep溶液，混匀后56 ℃孵育1 h；
③
蛋白烷基化：将还原后蛋白冷却至室温，在避光条件下加入2.5 μl 、357 mm的碘乙酰胺溶液，室温避光孵育30 min；
④
蛋白沉淀：向还原烷基化蛋白中加入4倍体积甲醇，1倍体积氯仿和3倍体积水，涡旋混匀后，20000 g离心10 min，蛋白液分为两层，将上层液体吸除后，再次加入4倍体积甲醇，混匀后20000 g离心10 min，吸除上清，沉淀室温下挥干；
⑤
蛋白酶解：分别向50 μg挥干蛋白中加入50 μl 50 mm teab，斡旋后加入2 μl 1 μg/μl胰酶，斡旋混匀，37℃下孵育14 h；
⑥
多肽tmt标记；
⑦
将标记后的每批样品混匀，浓缩仪浓缩干；
⑧
c18柱脱盐，浓缩干燥后对两批tmt标记试剂分别进行hplc分级；
⑨
将分级合并后的多肽样品浓缩干，经ziptip脱盐柱除盐后进行lc/ms/ms分析。
11.步骤（5）的具体操作过程为：
①
设置液相及质谱参数：液相参数包括：流速：300 nl/min；总梯度时间：65 min；梯度分布：0
‑
3 min b相
（乙腈）0
‑
6%，3
‑
53 min b相6%
‑
26%，53
‑
59 min b相26%
‑
63%，59
‑
62 min b相63%
ꢀ‑ꢀ
95%，62
‑ꢀ
65 min b相95%；上样最大压力：250.0 bar；上样体积：12 μl （a相0.1% fa溶液）；平衡预柱压力：250.0 bar；平衡预柱体积：6 μl；平衡分析柱压力：300.0 bar；平衡分析柱体积：4 μl；液相系统自动洗针，按照标准的方式，每次取100 μl 0.1%甲酸溶液；质谱参数包括：总梯度时间：65 min；采集模式为数据依赖型（data
‑
dependent mode）；离子传输管温度：320 ℃；离子源电压：2.50 kv；s透镜无线电频率：55.0；一级扫描分辨率：70000；扫描范围：350
‑
1800 m/z；正离子模式采集；agc上限：1e5；最大注射时间：100 ms；母离子筛选窗口（isolation window）：1.6 m/z；筛选碎裂强度为前15的母离子；二级谱图最小质荷比：110.0 m/z；hcd碎裂碰撞能量：30%；二级质谱谱图信号：大于2.0 e5；筛选做二级质谱的母离子电荷：除 1、 8、> 8之外的价态；多肽自动匹配天然同位素峰且动态排除（dynamic exclude）时间是50.0 s；
②
样品制备：20 μl含4%乙腈的0.1% fa水溶液充分溶解除盐后样品，4 ℃下20000 g离心15 min，取上清加入到样品瓶中并依次放入纳升液相样品盘中：
③
在质谱程序上提交样品序列，并按照样品瓶的位置依次采样；
④
样品搜库。raw文件搜库软件为maxquant1.5.3，数据库为swiss
‑
prot下载的人源蛋白信息（09/2017更新，共含有20239个序列），母离子质量偏差 < 10 ppm，碎片离子：< 0.02 da。胰酶（trypsin），最大漏切位点：2；固定修饰：半胱氨酸的脲基甲基化（carbamidomethyl_c）；动态修饰：蛋氨酸的氧化（oxidation_m）；定量形式：二级离子定量（tmt
‑
10plex）；蛋白和多肽的错误率小于1%；
⑤
搜库后的数据首先用excel处理，对可定量的蛋白进行后续差异性和生物信息学分析。
12.一种蛋白标志物的试剂在制备用于预测视网膜衰老进程试剂盒中的应用。
13.所述试剂包括抗所述蛋白标志物的抗体；所述抗体包括抗rnf149蛋白抗体、抗rnf123蛋白抗体、抗armc8蛋白抗体、抗pcnp蛋白抗体、抗fbxo9蛋白抗体、抗fbxl18蛋白抗体中的至少一种。
14.所述试剂盒包括检测蛋白标志物的试剂。
15.采用上述技术方案，本发明为预测视网膜的衰老进程提供了新的蛋白标志物。
16.其中rnf149蛋白、rnf123蛋白、armc8蛋白、pcnp蛋白、fbxo9蛋白和fbxl18蛋白氨基酸序列分别如seq id no .1
‑
6所示，或与其具有至少95％的同源性。
17.rnf149蛋白序列(seq id no.1)如下，或与如下序列具有至少95％的同源性：mawrrreasvgargvlalallalalcvpgargralewfsavvnieyvdpqtnltvwsvsesgrfgdsspkegahglvgvpwapggdlegcapdtrffvpepggrgaapwvalvarggctfkdkvlvaarrnasavvlyneerygnitlpmshagtgnivvimisypkgreilelvqkgipvtmtigvgtrhvqefisgqsvvfvaiafitmmiislawlifyyiqrflytgsqigsqshrketkkvigqlllhtvkhgekgidvdaencavcienfkvkdiirilpckhifhricidpwlldhrtcpmckldvikalgywgepgdvqempapesppgrdpaanlslalpdddgsddssppsaspaesepqcdpsfkgdagentalleagrsdsrhggpis。
18.rnf123蛋白序列(seq id no.2)如下，或与如下序列具有至少95％的同源性：maskgagmsfsrksyrltsdaeksrvtgivqekllndylnrifsssehappaatsrkplnfqnlpehldqllqvdneeeesqgqvegrlgpstvvldhtggfeglllvdddllgvighsnfgtirsttcvykgkwlyevlissq
glmqigwctiscrfnqeegvgdthnsyaydgnrvrkwnvtttnygkawaagdivsclidlddgtlsfclngvslgtafenlsrglgmayfpaislsfkesvafnfgsrplrypvagyrplqdppsadlvraqrllgcfravlsveldpvegrlldkesskwrlrgqptvlltlahifhhfapllrkvylveavlmsfllgivekgtptqaqsvvhqvldllwlfmedyevqdclkqlmmsllrlyrfspivpdlglqihylrltiailrheksrkfllsnvlfdvlrsvvffyiksplrveeaglqelipttwwphcssregkestemkeetaeerlrrrayergcqrlrkrievveelqvqilkllldnkddnggeasryifltkfrkflqenasgrgnmpmlcppeymvcflhrlisalryywdeykasnphasfseeayippqvfyngkvdyfdlqrlggllshlrktlkddlaskanividplelqstamddldedeepapamaqrpmqalavggplplprpgwlssptlgranrflstaavslmtprrplstsekvkvrtlsveqrtrediegshwneglllgrppeepeqpltensllevldgavmmynlsvhqqlgkmvgvsddvneyamalrdtedklrrcpkrrkdilaeltksqkvfsekldhlsrrlawvhatvysqekmldiywllrvclrtiehgdrtgslfafmpefylsvainsysalknyfgpvhsmeelpgyeetltrlaailakhfadarivgtdirdslmqalasyvcyphslraveripeeqriamvrnllapyeqrpwaqtnwilvrlwrgcgfgyrytrlphllktkledanlpslqkpcpstllqqhmadllqqgpdvapsflnsvlnqlnwafsefigmiqeiqqaaerlernfvdsrqlkvcatcfdlsvsllrvlemtitlvpeifldwtrptsemllrrlaqllnqvlnrvtaernlfdrvvtlrlpglesvdhypilvavtgilvqllvrgpasereqatsvlladpcfqlrsicyllgqpeppapgtalpapdrkrfslqsyadyisadelaqveqmlahltsasaqaaaaslptseedlcpicyahpisavfqpcghksckacinqhlmnnkdcffckttivsvedwekgantsttssaa。
19.armc8蛋白序列(seq id no.3)如下，或与如下序列具有至少95％的同源性：maclletpirmsvlsevtassrhyvdrlfdpdpqkvlqgvidmknavignnkqkanlivlgavprllyllqqetsstelktecavvlgslamgtennvkslldchiipallqgllspdlkfieaclrclrtiftspvtpeellytdatviphlmallsrsrytqeyicqifshcckgpdhqtilfnhgavqniahlltslsykvrmqalkcfsvlafenpqvsmtlvnvlvdgellpqifvkmlqrdkpiemqltsakcltymcragairtddncivlktlpclvrmcskerlleervegaetlayliepdvelqriasitdhliamladyfkypssvsaitdikrldhdlkhahelrqaafklyaslgandedirkkiietenmmdrivtglsessvkvrlaavrclhslsrsvqqlrtsfqdhavwkplmkvlqnapdeilvvassmlcnlllefspskepilesgavellcgltqsenpalrvngiwalmnmafqaeqkikadilrslsteqlfrllsdsdlnvlmktlgllrnllstrphidkimsthgkqimqavtlilegehnievkeqtlcilaniadgttakdlimtnddilqkikyymghshvklqlaamfcisnliwneeegsqerqdklrdmgivdilhklsqspdsnlcdkakmalqqyla。
20.pcnp蛋白序列(seq id no.4)如下，或与如下序列具有至少95％的同源性：madgkagdekpeksqragaaggpeeeaekpvktktvsssnggesssrsaekrsaeeeaadlptkptkiskfgfaigsqttkkasaisiklgsskpketvptlapktlsvaaafnededsepeemppeakmrmknigrdtptsagpnsfnkgkhgfsdnqklwernikshlgnvhdqdn。
21.fbxo9蛋白序列(seq id no.5)如下，或与如下序列具有至少95％的同源性：mpdiiwvfppqaeaeedchsdtvradddeenespaetdlqaqlqmfraqwmfelapgvsssnlenrpcraargslqktsadtkgkqeqakeekarelflkaveeeqngalyeaikfyrramqlvpdiefkitytrspdgdgvgnsyiedndddskmadllsyfqqqltfqesvlklcqpelessqihisvlpmevlmyifrwvvssdldlrsleqlslvcrgfyicardpeiwrlaclkvwgrsciklvpytswremflerprvrfdgvyiskttyirqgeqsldgfyrawhqveyyryirffpdghvmmlttpeepqsivprlrtrntrtdaillghyrlsqdtdnqtkvfavitkkkeekpldykyryfrrvpvqeadqsfhvglqlcssghqrfnkliwihhschitykstgetavsafeidkmytplffarvrsytafserpl。
22.fbxl18蛋白序列(seq id no.6)如下，或与如下序列具有至少95％的同源性：mhavprgfgkkvrvgvqscppllgpgvppallrvlvsaeepalpgtpradwvqlllrhapqrarhpql
aptlqprtecrglgggrhrpaglpaapdartaaqrpyglragqyrpavpavavpvagqpghdgeggvharalrhvealqaaegpqagaallqrqrpvlpgaepvplaaapvpglsqrhpparcraglhgslpagchvppvhrgvprhlqepaavaspqlpgraarvkrrhlpsaprgpdrrhpgrppgapg。
23.本发明针对不同年龄阶段的眼球捐献者的视网膜色素上皮细胞中存在差异表达蛋白，例如rnf149蛋白、rnf123蛋白、armc8蛋白、pcnp蛋白、fbxo9蛋白和fbxl18蛋白；说明这些差异表达蛋白可以单独或联合作为预测视网膜衰老进程的蛋白标志物；进一步地，本发明以这些差异表达蛋白作为变量对不同年龄对应的视网膜色素上皮细胞进行评估，具有更高的灵敏度和特异性，能够较为准确地进行预测。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
25.图1：不同年龄人类视网膜色素上皮细胞的分离及蛋白质组的研究策略。
26.图2：hrpe细胞年龄相关蛋白的全蛋白。
27.图3：hrpe细胞年龄相关性蛋白参与的信号通路（kegg）。
28.图4：rnf149，rnf123，armc8，pcnp，fbxo9，fbxl18蛋白在不同年龄hrpe细胞中的表达趋势。
29.图5：hrpe细胞年龄相关的分泌蛋白。
30.图6：年龄相关分泌蛋白共表达网络（wgcna）分析，模块
‑
特征分析图。
31.图7：年龄相关分泌蛋白共表达网络（wgcna）分析，年龄相关模块所涉及的信号通路及蛋白。
32.图8：部分年龄相关蛋白在不同年龄眼球捐献者hrpe细胞中的蛋白表达验证结果。
具体实施方式
33.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
34.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行描述。
35.一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物，包括rnf149蛋白、rnf123蛋白、armc8蛋白、pcnp蛋白、fbxo9蛋白、fbxl18蛋白中的至少一种。
36.其中rnf149蛋白、rnf123蛋白、armc8蛋白、pcnp蛋白、fbxo9蛋白和fbxl18蛋白氨基酸序列分别如seq id no .1
‑
6所示，或与其具有至少95％的同源性。
37.rnf149蛋白序列(seq id no.1)如下，或与如下序列具有至少95％的同源性：mawrrreasvgargvlalallalalcvpgargralewfsavvnieyvdpqtnltvwsvsesgrfgdsspkegahglvgvpwapggdlegcapdtrffvpepggrgaapwvalvarggctfkdkvlvaarrnasavvlyneeryg
nitlpmshagtgnivvimisypkgreilelvqkgipvtmtigvgtrhvqefisgqsvvfvaiafitmmiislawlifyyiqrflytgsqigsqshrketkkvigqlllhtvkhgekgidvdaencavcienfkvkdiirilpckhifhricidpwlldhrtcpmckldvikalgywgepgdvqempapesppgrdpaanlslalpdddgsddssppsaspaesepqcdpsfkgdagentalleagrsdsrhggpis。
38.rnf123蛋白序列(seq id no.2)如下，或与如下序列具有至少95％的同源性：maskgagmsfsrksyrltsdaeksrvtgivqekllndylnrifsssehappaatsrkplnfqnlpehldqllqvdneeeesqgqvegrlgpstvvldhtggfeglllvdddllgvighsnfgtirsttcvykgkwlyevlissqglmqigwctiscrfnqeegvgdthnsyaydgnrvrkwnvtttnygkawaagdivsclidlddgtlsfclngvslgtafenlsrglgmayfpaislsfkesvafnfgsrplrypvagyrplqdppsadlvraqrllgcfravlsveldpvegrlldkesskwrlrgqptvlltlahifhhfapllrkvylveavlmsfllgivekgtptqaqsvvhqvldllwlfmedyevqdclkqlmmsllrlyrfspivpdlglqihylrltiailrheksrkfllsnvlfdvlrsvvffyiksplrveeaglqelipttwwphcssregkestemkeetaeerlrrrayergcqrlrkrievveelqvqilkllldnkddnggeasryifltkfrkflqenasgrgnmpmlcppeymvcflhrlisalryywdeykasnphasfseeayippqvfyngkvdyfdlqrlggllshlrktlkddlaskanividplelqstamddldedeepapamaqrpmqalavggplplprpgwlssptlgranrflstaavslmtprrplstsekvkvrtlsveqrtrediegshwneglllgrppeepeqpltensllevldgavmmynlsvhqqlgkmvgvsddvneyamalrdtedklrrcpkrrkdilaeltksqkvfsekldhlsrrlawvhatvysqekmldiywllrvclrtiehgdrtgslfafmpefylsvainsysalknyfgpvhsmeelpgyeetltrlaailakhfadarivgtdirdslmqalasyvcyphslraveripeeqriamvrnllapyeqrpwaqtnwilvrlwrgcgfgyrytrlphllktkledanlpslqkpcpstllqqhmadllqqgpdvapsflnsvlnqlnwafsefigmiqeiqqaaerlernfvdsrqlkvcatcfdlsvsllrvlemtitlvpeifldwtrptsemllrrlaqllnqvlnrvtaernlfdrvvtlrlpglesvdhypilvavtgilvqllvrgpasereqatsvlladpcfqlrsicyllgqpeppapgtalpapdrkrfslqsyadyisadelaqveqmlahltsasaqaaaaslptseedlcpicyahpisavfqpcghksckacinqhlmnnkdcffckttivsvedwekgantsttssaa。
39.armc8蛋白序列(seq id no.3)如下，或与如下序列具有至少95％的同源性：maclletpirmsvlsevtassrhyvdrlfdpdpqkvlqgvidmknavignnkqkanlivlgavprllyllqqetsstelktecavvlgslamgtennvkslldchiipallqgllspdlkfieaclrclrtiftspvtpeellytdatviphlmallsrsrytqeyicqifshcckgpdhqtilfnhgavqniahlltslsykvrmqalkcfsvlafenpqvsmtlvnvlvdgellpqifvkmlqrdkpiemqltsakcltymcragairtddncivlktlpclvrmcskerlleervegaetlayliepdvelqriasitdhliamladyfkypssvsaitdikrldhdlkhahelrqaafklyaslgandedirkkiietenmmdrivtglsessvkvrlaavrclhslsrsvqqlrtsfqdhavwkplmkvlqnapdeilvvassmlcnlllefspskepilesgavellcgltqsenpalrvngiwalmnmafqaeqkikadilrslsteqlfrllsdsdlnvlmktlgllrnllstrphidkimsthgkqimqavtlilegehnievkeqtlcilaniadgttakdlimtnddilqkikyymghshvklqlaamfcisnliwneeegsqerqdklrdmgivdilhklsqspdsnlcdkakmalqqyla。
40.pcnp蛋白序列(seq id no.4)如下，或与如下序列具有至少95％的同源性：madgkagdekpeksqragaaggpeeeaekpvktktvsssnggesssrsaekrsaeeeaadlptkptkiskfgfaigsqttkkasaisiklgsskpketvptlapktlsvaaafnededsepeemppeakmrmknigrdtptsagpnsfnkgkhgfsdnqklwernikshlgnvhdqdn。
41.fbxo9蛋白序列(seq id no.5)如下，或与如下序列具有至少95％的同源性：mpdiiwvfppqaeaeedchsdtvradddeenespaetdlqaqlqmfraqwmfelapgvsssnlenrpc
raargslqktsadtkgkqeqakeekarelflkaveeeqngalyeaikfyrramqlvpdiefkitytrspdgdgvgnsyiedndddskmadllsyfqqqltfqesvlklcqpelessqihisvlpmevlmyifrwvvssdldlrsleqlslvcrgfyicardpeiwrlaclkvwgrsciklvpytswremflerprvrfdgvyiskttyirqgeqsldgfyrawhqveyyryirffpdghvmmlttpeepqsivprlrtrntrtdaillghyrlsqdtdnqtkvfavitkkkeekpldykyryfrrvpvqeadqsfhvglqlcssghqrfnkliwihhschitykstgetavsafeidkmytplffarvrsytafserpl。
42.fbxl18蛋白序列(seq id no.6)如下，或与如下序列具有至少95％的同源性：mhavprgfgkkvrvgvqscppllgpgvppallrvlvsaeepalpgtpradwvqlllrhapqrarhpqlaptlqprtecrglgggrhrpaglpaapdartaaqrpyglragqyrpavpavavpvagqpghdgeggvharalrhvealqaaegpqagaallqrqrpvlpgaepvplaaapvpglsqrhpparcraglhgslpagchvppvhrgvprhlqepaavaspqlpgraarvkrrhlpsaprgpdrrhpgrppgapg。
43.蛋白标志物的筛选方法，包括以下步骤：（1）不同年龄人类rpe细胞的收集；（2）不同年龄人类rpe细胞的全蛋白提取；（3）不同年龄人类rpe细胞的分泌蛋白提取；（4）生物质谱样品的制备；（5）生物质谱分析；（6）人类rpe细胞年龄相关细胞全蛋白分析；（7）不同年龄眼球捐献者hrpe细胞年龄相关分泌蛋白分析；（8）年龄相关蛋白在不同年龄眼球捐献者rpe细胞中的表达验证，最后筛选出相关蛋白标志物。
44.步骤（1）的具体操作过程为：
①
摘取捐献者的眼球（去世72小时以内）眼球，用青链霉素混合液过夜浸泡消毒；去除角膜、晶状体以及玻璃体，分离去掉视网膜神经上皮层，将眼球后段制成眼杯；
②
将眼杯置于10cm培养皿中，用毛细吸管轻轻从眼杯中吸出视网膜神经上皮层；以pbs液漂洗眼杯2次，吸干；
③
向眼杯中加入0.25%胰蛋白酶
‑
edta的消化液，于37℃恒温箱中消化20min；
④
加入有血清的培养基，中止消化，吸出眼杯内的细胞悬液，离心（1000r/min）5min，弃上清，加入有血清培养基重悬细胞，置于培养瓶中培养；
⑤
用pbs清洗眼杯后，再次消化20 min，收集细胞悬液，离心（1000r/min）5min，弃上清，加入有血清培养基重悬细胞，置于培养瓶中培养。
45.步骤（2）的具体操作过程为：
①
培养上述不同年龄人类rpe细胞，待细胞贴壁长至50%以上后，去除培养基，用pbs洗3次，加入1.5 ml的pbs用细胞刮刀将细胞刮下，2000 rpm离心3 min，去除上清，收集细胞；
②
向收集的细胞中加入500 μl含有cocatail的netn裂解液，超声裂解；将超声后的细胞裂解液20000 g离心30 min；取上清；
③
用brandford法分别测定样本浓度，并将样本浓度定量到1 μg/μl。
46.步骤（3）的具体操作过程为：
①
培养上述不同年龄人类rpe细胞，当细胞贴壁并长致70
‑
80%左右后，去除培养
基；利用生理盐水润洗细胞3次，加入无血清培养基继续培养24 h。随后收集无血清培养基，并用超滤管（5 kda）将其浓缩至100 μl；随后向样品中分别加入50 μl含有cocatail的netn裂解液，超声裂解；将超声后的细胞裂解液20000 g离心30 min。取上清。
47.②
用brandford法分别测定样本浓度，并将样本浓度定量到0.5 μg/μl。
48.步骤（4）的具体操作过程为：
①
样品分组：将细胞的全蛋白样品和分泌蛋白样品分别按照捐献者年龄分为年轻组（y，＜18岁）、中年组（m，35
‑
45岁）和老年组（o，<55岁）；具体信息如下：
②
蛋白还原：分别取50 μg rpe细胞的全蛋白及分泌蛋白，加入100 mm 的teab补足至50 μl，向样品中分别加入2.5 μl 200 mm的tcep溶液，混匀后56 ℃孵育1 h；
③
蛋白烷基化：将还原后蛋白冷却至室温，在避光条件下加入2.5 μl 、357 mm的碘乙酰胺溶液，室温避光孵育30 min；
④
蛋白沉淀：向还原烷基化蛋白中加入4倍体积甲醇，1倍体积氯仿和3倍体积水，涡旋混匀后，20000 g离心10 min，蛋白液分为两层，将上层液体吸除后，再次加入4倍体积甲醇，混匀后20000 g离心10 min，吸除上清，沉淀室温下挥干；
⑤
蛋白酶解：分别向50 μg挥干蛋白中加入50 μl 50 mm teab，斡旋后加入2 μl 1 μg/μl胰酶，斡旋混匀，37℃下孵育14 h；
⑥
多肽tmt标记；按下表所示，分配标记试剂，分别对18例全蛋白和18例分泌蛋白样本进行标记。
49.⑦
将标记后的每批样品混匀，浓缩仪浓缩干；
⑧
c18柱脱盐，浓缩干燥后对两批tmt标记试剂分别进行hplc分级；流动相条件：buffer a：98% 水，2% 乙腈，甲酸铵 10 mm，ph=10buffer b：90%乙腈，10% 水，甲酸铵10 mm，ph=10hplc分级时间梯度表多肽样品按上述hplc条件，每分钟收集一组，共120个组分，每5个样品合并为一组，共合并成为24组。
50.⑨
将分级合并后的多肽样品浓缩干，经ziptip脱盐柱除盐后进行lc/ms/ms分析。
51.步骤（5）的具体操作过程为：
①
设置液相及质谱参数：液相参数包括：流速：300 nl/min；总梯度时间：65 min；梯度分布：0
‑
3 min b相（乙腈）0
‑
6%，3
‑
53 min b相6%
‑
26%，53
‑
59 min b相26%
‑
63%，59
‑
62 min b相63%
ꢀ‑ꢀ
95%，62
‑ꢀ
65 min b相95%；上样最大压力：250.0 bar；上样体积：12 μl （a相0.1% fa溶液）；平衡预柱压力：250.0 bar；平衡预柱体积：6 μl；平衡分析柱压力：300.0 bar；平衡分析柱体积：4 μl；液相系统自动洗针，按照标准的方式，每次取100 μl 0.1%甲酸溶液；质谱参数包括：总梯度时间：65 min；采集模式为数据依赖型（data
‑
dependent mode）；离子传输管温度：320 ℃；离子源电压：2.50 kv；s透镜无线电频率：55.0；一级扫描分辨率：70000；扫描范围：350
‑
1800 m/z；正离子模式采集；agc上限：1e5；最大注射时间：
100 ms；母离子筛选窗口（isolation window）：1.6 m/z；筛选碎裂强度为前15的母离子；二级谱图最小质荷比：110.0 m/z；hcd碎裂碰撞能量：30%；二级质谱谱图信号：大于2.0 e5；筛选做二级质谱的母离子电荷：除 1、 8、> 8之外的价态；多肽自动匹配天然同位素峰且动态排除（dynamic exclude）时间是50.0 s；
②
样品制备：20 μl含4%乙腈的0.1% fa水溶液充分溶解除盐后样品，4 ℃下20000 g离心15 min，取上清加入到样品瓶中并依次放入纳升液相样品盘中：
③
在质谱程序上提交样品序列，并按照样品瓶的位置依次采样；
④
样品搜库。raw文件搜库软件为maxquant1.5.3，数据库为swiss
‑
prot下载的人源蛋白信息（09/2017更新，共含有20239个序列），母离子质量偏差 < 10 ppm，碎片离子：< 0.02 da。胰酶（trypsin），最大漏切位点：2；固定修饰：半胱氨酸的脲基甲基化（carbamidomethyl_c）；动态修饰：蛋氨酸的氧化（oxidation_m）；定量形式：二级离子定量（tmt
‑
10plex）；蛋白和多肽的错误率小于1%；
⑤
搜库后的数据首先用excel处理，对可定量的蛋白进行后续差异性和生物信息学分析。
52.步骤（6）的具体操作过程为：共鉴定到7921个hrpe细胞全蛋白，其中可定量的蛋白有5735个。对于可定量的蛋白，首先进行年龄相关性分析，将相关系数（r）大于0.5（或小于
‑
0.5）且组间具有显著性差异（p<0.05）的蛋白，认为是年龄相关性蛋白。
53.其中有46个蛋白随年龄增加表达量上调：akr1b10、prph、inpp1、fbxo9、palmd、papss2、fgg、dnajb4、ptgr1、bak1、uaca、dhps、map7d3、prkca、ada、rnf123、rnf149、ssfa2、bsdc1、tenm3、rin1、prkci、ybx1、fau、akap10、evi5、bcar1、snx17、gspt2、pcnp、fbxl18、dst、adsl、zpr1、akap9、malt1、mtmr12、mrfap1、atg101、pcyt1a、armc8、atxn2、g3bp2、arl1、rpl29、caprin1。
54.35个蛋白随年龄增加表达量下调：gnai2、yes1、kiaa1217、epn1、fam98b、rpp25l、vprbp、bmp2k、ppie、lzts2、itgb6、ppox、dusp23、vps13a、sp100、fmnl3、atf7ip、npc1、parp14、h1fx、slc25a6、ano6、itgb3、khdrbs3、pdk3、mtarc2、atpif1、col18a1、erap1、baz2a、ddx3y、hist1h1d、eif1ay、rps4y1、oxtr。
55.对以上的年龄相关蛋白进行kegg通路分析发现，随着年龄的增长而上调的通路有：蛋白水解参与的细胞蛋白分解过程（proteolysis involved in cellular protein catabolic process），调节细胞
‑
细胞黏附（regulation of cell
−
cell adhesion），伤口愈合（wound healing），血液凝固（blood coagulation），白细胞变异（leukocyte differentiation），凋亡信号通路（apoptotic signaling pathway），活化免疫应答信号转到（immune response
−
activating signal transduction），b细胞分化（b cell differentiation），眼形态形成（eye morphogenesis），t细胞受体信号通路（t cell receptor signaling pathway），嘌呤核苷酸生物合成过程（purine nucleotide biosynthetic process），衰老（aging），视觉系统发育（visual system development），阳性调节alpha
‑
beta t细胞分化（positive regulation of alpha
‑
beta t cell differentiation），内皮细胞凋亡过程（endothelial cell apoptotic process），调节nik/nf
‑
kappa b 信号通路（regulation of nik/nf
‑
kappab signaling）。
56.随年龄增长而下调的通路有：血管生成（angiogenesis），阳性调节信号迁移（positive regulation of cell migration），白细胞迁移（leukocyte migration），胞外结构组合（extracellular structure organization），调节凋亡通路（regulation of apoptotic signaling pathway），胞外基质组合（extracellular matrix organization），活性氧自由基代谢过程（reactive oxygen species metabolic process），阳性调节肽基
‑
丝氨酸磷酸化（positive regulation of peptidyl
‑
tyrosine phosphorylation），notch 信号通路（notch signaling pathway）。
57.其中，蛋白水解参与的细胞蛋白分解过程（proteolysis involved in cellular protein catabolic process）主要涉及的年龄相关蛋白是rnf149，rnf123，armc8，pcnp，fbxo9，fbxl18。
58.步骤（7）的具体操作过程为：共鉴定到3843个hrpe细胞的分泌蛋白，其中可定量的蛋白有2455个。对于可定量的蛋白，首先进行年龄相关性分析，将相关系数（r）大于0.5（或小于
‑
0.5）且组间具有显著性差异（p<0.05）的蛋白，认为是年龄相关性蛋白。
59.其中有38个蛋白随年龄增加表达量上调：rpl13a、rps9、phyhd1、rpl28、rps18、rpl7、rpl15、rps8、rpl32、rpl3、rpl21、srgn、rps11、rpl13、rps16、rps2、ywhaq、rps25、rps6、rpl18、imup、rps4x、rps17、rps15a、psph、add1、rps7、s100a11、dsg1、dsp、rpl34、gpx1、bpgm、ttll12、rpl10、rps19、cbs、rps20。
60.16个蛋白随年龄增加表达量下调：postn、tfpi2、papola、myef2、spint1、sgce、angptl4、mmp3、adamts7、inhba、mgat1、rmdn3、sparcl1、mgat5、cpd、impad1。
61.对所有分泌蛋白进行共表达网络（wgcna）分析，发现随年龄变化的分泌蛋白所富集的通路有：剪接体（spliceosome）、mrna检测通路（mrna surveillance pathway）、rna转运（rna transport）、非同源的末端链接（non
‑
homologous end
‑
joining）、核苷酸切补修复（nucleotide excision repair）、泛素调节的蛋白水解（ubiquitin mediated proteolysis）、核糖体（ribosome）、蛋白输出（protein export）、卵母细胞减数分裂（oocyte meiosis）、碳代谢（carbon metabolism）、乙醛酸与碳酸氢盐的代谢（glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解（valine, leucine and isoleucine degradation）、丙酮酸代谢（pyruvate metabolism）、2
‑
氧代羧酸代谢（2
‑
oxocarboxylic acid metabolism）、氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids）、三羧酸循环（citrate cycle (tca cycle)）、卟啉和叶绿素滴血（porphyrin and chlorophyll metabolism）、精氨酸生物合成（arginine biosynthesis）、并酸代谢（propanoate metabolism）、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酰胺代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢（glycine, serine and threonine metabolism）、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢（cysteine and methionine metabolism）和糖酵解/糖原异生（glycolysis / gluconeogenesis）。
62.步骤（8）的具体操作过程为：分别取不同年龄（10岁、12岁、13岁、35岁、38岁、40岁、41岁、44岁、56岁、60岁、64岁、66岁、67岁）眼球捐献者的rpe细胞，用netn裂解液超声裂解细胞，利用rnf149蛋白抗体、rnf123蛋白抗体及蛋白全泛素化抗体检测不同年龄样本的rnf149蛋白、rnf123蛋白及全蛋
白泛素化的表达水平。随着年龄增加，rnf149蛋白、rnf123蛋白和全蛋白泛素化水平上调，说明rnf149蛋白，rnf123蛋白参与的蛋白泛素化相关的蛋白水解过程与rpe细胞的衰老相关。
63.一种蛋白标志物的试剂在制备用于预测视网膜衰老进程试剂盒中的应用。
64.所述试剂包括抗所述蛋白标志物的抗体；所述抗体包括抗rnf149蛋白抗体、抗rnf123蛋白抗体、抗armc8蛋白抗体、抗pcnp蛋白抗体、抗fbxo9蛋白抗体、抗fbxl18蛋白抗体中的至少一种。
65.所述试剂盒包括检测蛋白标志物的试剂。图2显示，有46个rpe细胞全蛋白随年龄增加表达量上调，包括：akr1b10、prph、inpp1、fbxo9、palmd、papss2、fgg、dnajb4、ptgr1、bak1、uaca、dhps、map7d3、prkca、ada、rnf123、rnf149、ssfa2、bsdc1、tenm3、rin1、prkci、ybx1、fau、akap10、evi5、bcar1、snx17、gspt2、pcnp、fbxl18、dst、adsl、zpr1、akap9、malt1、mtmr12、mrfap1、atg101、pcyt1a、armc8、atxn2、g3bp2、arl1、rpl29、caprin1蛋白。35个蛋白随年龄增加表达量下调，包括：gnai2、yes1、kiaa1217、epn1、fam98b、rpp25l、vprbp、bmp2k、ppie、lzts2、itgb6、ppox、dusp23、vps13a、sp100、fmnl3、atf7ip、npc1、parp14、h1fx、slc25a6、ano6、itgb3、khdrbs3、pdk3、mtarc2、atpif1、col18a1、erap1、baz2a、ddx3y、hist1h1d、eif1ay、rps4y1、oxtr。
66.图3为对以上的年龄相关蛋白进行kegg通路分析的结果，发现随着年龄的增长而上调的通路有：蛋白水解参与的细胞蛋白分解过程（proteolysis involved in cellular protein catabolic process），调节细胞
‑
细胞黏附（regulation of cell
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cell adhesion），伤口愈合（wound healing），血液凝固（blood coagulation），白细胞变异（leukocyte differentiation），凋亡信号通路（apoptotic signaling pathway），活化免疫应答信号转到（immune response
−
activating signal transduction），b细胞分化（b cell differentiation），眼形态形成（eye morphogenesis），t细胞受体信号通路（t cell receptor signaling pathway），嘌呤核苷酸生物合成过程（purine nucleotide biosynthetic process），衰老（aging），视觉系统发育（visual system development），阳性调节alpha
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beta t细胞分化（positive regulation of alpha
‑
beta t cell differentiation），内皮细胞凋亡过程（endothelial cell apoptotic process），调节nik/nf
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kappa b 信号通路（regulation of nik/nf
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kappab signaling）。随年龄增长而下调的通路有：血管生成（angiogenesis），阳性调节信号迁移（positive regulation of cell migration），白细胞迁移（leukocyte migration），胞外结构组合（extracellular structure organization），调节凋亡通路（regulation of apoptotic signaling pathway），胞外基质组合（extracellular matrix organization），活性氧自由基代谢过程（reactive oxygen species metabolic process），阳性调节肽基
‑
丝氨酸磷酸化（positive regulation of peptidyl
‑
tyrosine phosphorylation），notch 信号通路（notch signaling pathway）。
67.图4所示为随年龄上调蛋白影响最为显著的通路，即蛋白水解参与的细胞蛋白分解过程（proteolysis involved in cellular protein catabolic process）主要涉及的年龄相关蛋白，包括rnf149，rnf123，armc8，pcnp，fbxo9，fbxl18在不同年龄中的表达趋势。
68.图5所示为hrpe细胞随年龄增加表达量上调的38个分泌蛋白：rpl13a、rps9、
phyhd1、rpl28、rps18、rpl7、rpl15、rps8、rpl32、rpl3、rpl21、srgn、rps11、rpl13、rps16、rps2、ywhaq、rps25、rps6、rpl18、imup、rps4x、rps17、rps15a、psph、add1、rps7、s100a11、dsg1、dsp、rpl34、gpx1、bpgm、ttll12、rpl10、rps19、cbs、rps20。以及随年龄增加表达量下调的16个分泌蛋白：postn、tfpi2、papola、myef2、spint1、sgce、angptl4、mmp3、adamts7、inhba、mgat1、rmdn3、sparcl1、mgat5、cpd、impad1。
69.图6与图7为分泌蛋白进行共表达网络（wgcna）分析的结果，发现随年龄变化的分泌蛋白所富集的通路有：剪接体（spliceosome）、mrna检测通路（mrna surveillance pathway）、rna转运（rna transport）、非同源的末端链接（non
‑
homologous end
‑
joining）、核苷酸切补修复（nucleotide excision repair）、泛素调节的蛋白水解（ubiquitin mediated proteolysis）、核糖体（ribosome）、蛋白输出（protein export）、卵母细胞减数分裂（oocyte meiosis）、碳代谢（carbon metabolism）、乙醛酸与碳酸氢盐的代谢（glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解（valine, leucine and isoleucine degradation）、丙酮酸代谢（pyruvate metabolism）、2
‑
氧代羧酸代谢（2
‑
oxocarboxylic acid metabolism）、氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids）、三羧酸循环（citrate cycle (tca cycle)）、卟啉和叶绿素滴血（porphyrin and chlorophyll metabolism）、精氨酸生物合成（arginine biosynthesis）、并酸代谢（propanoate metabolism）、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酰胺代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢（glycine, serine and threonine metabolism）、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢（cysteine and methionine metabolism）和糖酵解/糖原异生（glycolysis / gluconeogenesis）。
70.如图8所示，随着hrpe细胞捐献者的年龄增加，rnf149的表达增高，且整体蛋白的泛素化水平上调。
71.本实施例并非对本发明的形状、材料、结构等作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。