免疫缺陷小鼠的制作方法

1.本发明涉及能够重现人的自然免疫系统的啮齿类动物。


背景技术：

2.作为非常优异的免疫缺陷小鼠，nog小鼠是已知的(专利文献1)。向nog小鼠中移植人的细胞、组织，可制备人源化nog小鼠。为了重现人自然免疫系统，需要人嗜中性粒细胞等人粒细胞长期在外周进行循环的小鼠。出于该目的，存在移植有人造血干细胞、并施予人g
‑
csf蛋白的小鼠(非专利文献1、2)，但人嗜中性粒细胞植入是暂时性的，并且小鼠的嗜中性粒细胞也增加，因此，不能特化为人的自然免疫系统成为主要问题。
3.此外，嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞均为与变态反应疾病相关的自然免疫系统细胞。存在人嗜酸性粒细胞、人嗜碱性粒细胞分化的小鼠(非专利文献3、4)。然而，任一种小鼠中均仅有少量的人嗜酸性粒细胞和人嗜碱性粒细胞分化，尚不存在可长期维持充足的量的啮齿类。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：国际公开第wo2002/043477号
7.非专利文献
8.非专利文献1：tanaka s.等，j immunol.2012 jun 15；188(12):6145
‑
55
9.非专利文献2：coughlan am等，stem cells dev.2016 apr 1；25(7):530
‑
41
10.非专利文献3：ito r等，journal of immunology 2013；191:2890
‑
2899.
11.非专利文献4：ito r等，jci insight.2018nov 2；3(21)


技术实现要素：

12.发明所要解决的课题
13.本发明的目的为提供小鼠的自然免疫系统未激活、且能够长期重现人的自然免疫系统的人源化小鼠。
14.用于解决课题的手段
15.本技术的发明人为了使人嗜中性粒细胞的植入性亢进，将作为嗜中性粒细胞的诱导因子而已知的人g
‑
csf细胞因子敲入免疫缺陷小鼠中。此时，为了阻止人g
‑
csf与小鼠的g
‑
csf受体交叉反应而激活小鼠的自然免疫系统，将人g
‑
csf基因敲入小鼠的g
‑
csf受体基因座中，使小鼠g
‑
csf受体的功能缺损。
16.结果，制出了血清中存在人g
‑
csf、并于免疫缺陷小鼠中重建有人造血系统的人源化小鼠，从而完成了本发明。
17.进而，制出了在前述的血清中存在人g
‑
csf、并于免疫缺陷小鼠中重建有人造血系统的人源化小鼠中使与抗体fc区进行结合的受体缺损、人嗜中性粒细胞的分化比前述小鼠亢进的人源化小鼠，完成了另一项本发明。
18.并且，制出了在人嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞以少量程度分化的hil
‑
3/hgm
‑
csf tg小鼠和hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg小鼠中使与抗体fc区进行结合的受体缺损、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的分化亢进的人源化小鼠，完成了又一项本发明。
19.即，本发明如下所述。
20.[1]人g
‑
csf基因敲入啮齿类动物，其是向g
‑
csf受体基因座中敲入人g
‑
csf基因、使g
‑
csf受体的功能缺损而得的免疫缺陷啮齿类动物，所述动物表达人g
‑
csf且不表达啮齿类的g
‑
csf受体。
[0021]
[2][1]的人g
‑
csf基因敲入啮齿类动物，其为小鼠。
[0022]
[3][2]的人g
‑
csf基因敲入啮齿类动物，其为nog小鼠，正式品系名称表示为nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug csf3r
tm1(cmv
‑
csf3)
/jic。
[0023]
[4]人源化啮齿类动物，其是向[1]～[3]中任一项的人g
‑
csf基因敲入啮齿类动物移植人造血干细胞而得的，所述人源化啮齿类动物在外周循环有人嗜中性粒细胞。
[0024]
[5]人病原菌感染症模型啮齿类动物，其是使细菌或病毒感染[4]的人源化啮齿类动物而得的。
[0025]
[6]人g
‑
csf基因敲入啮齿类动物的制备方法，其包括向免疫缺陷啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中敲入人g
‑
csf基因的步骤，其中，所述人g
‑
csf基因敲入啮齿类动物表达人g
‑
csf且不表达啮齿类的g
‑
csf受体。
[0026]
[7][6]的人g
‑
csf基因敲入啮齿类动物的制备方法，其中，啮齿类动物为小鼠。
[0027]
[8][7]的人g
‑
csf基因敲入啮齿类动物的制备方法，其中，小鼠为nog小鼠，正式品系名称表示为nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
csf3r
tm1(cmv
‑
csf3)
/jic。
[0028]
[9]人源化啮齿类动物的制备方法，其包括向啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中敲入人g
‑
csf基因、进而移植人造血干细胞的步骤，其中，所述人源化啮齿类动物在外周循环有人嗜中性粒细胞。
[0029]
[10][9]的人源化啮齿类动物的制备方法，其中，啮齿类动物为小鼠。
[0030]
[11][10]的人源化啮齿类动物的制备方法，其中，小鼠为nog小鼠，正式品系名称表示为nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
csf3r
tm1(cmv
‑
csf3)
/jic。
[0031]
[12]人病原菌感染症模型啮齿类动物的制备方法，其包括下述步骤：向啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中敲入人g
‑
csf基因，移植人造血干细胞，进而使细菌或病毒感染所述啮齿类动物。
[0032]
[13][12]的人病原菌感染症模型啮齿类动物的制备方法，其中，啮齿类动物为小鼠。
[0033]
[14][13]的人病原菌感染症模型啮齿类动物的制备方法，其中，小鼠为nog小鼠，正式品系名称表示为nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
csf3r
tm1(cmv
‑
csf3)
/jic。
[0034]
[15]g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因、并且fcer1g和fcgr2b缺损的啮齿类动物，其是[1]～[3]中任一项的啮齿类动物，所述啮齿类动物是进一步使作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b缺失而得的。
[0035]
[16]如权利要求15所述的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因、并且fcer1g和fcgr2b缺损的啮齿类动物，所述啮齿类动物是将[1]～[3]中任一项的啮齿类动物与缺失了作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b的啮齿类动物进行交配
而制得的。
[0036]
[17][15]或[16]的啮齿类动物，其中，[1]～[3]中任一项的向g
‑
csf受体基因座中敲入人g
‑
csf基因、使g
‑
csf受体的功能缺损而得的免疫缺陷啮齿类动物为nog小鼠，且是正式品系名称表示为nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
csf3r
tm1(cmv
‑
csf3)
/jic的小鼠，缺失了作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b的啮齿类动物为fcr ko小鼠。
[0037]
[18]人源化啮齿类动物，其是向[15]～[17]中任一项的啮齿类动物移植人造血干细胞而得的，所述人源化啮齿类动物在外周循环有人嗜中性粒细胞。
[0038]
[19]人病原菌感染症模型啮齿类动物，其是使细菌或病毒感染[18]的人源化啮齿类动物而得的。
[0039]
[20]插入人il
‑
3和gm
‑
csf基因、并且fcer1g和fcgr2b缺损的啮齿类动物，其中，使已插入人il
‑
3和gm
‑
csf基因的啮齿类动物进一步缺失作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b。
[0040]
[21][20]的插入人il
‑
3和gm
‑
csf基因、并且fcer1g和fcgr2b缺损的啮齿类动物，其是将插入人il
‑
3和gm
‑
csf基因的啮齿类动物与缺失了作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b的啮齿类动物进行交配而得的。
[0041]
[22][21]的啮齿类动物，其中，已插入人il
‑
3和gm
‑
csf基因的啮齿类动物为hil
‑
3/hgm
‑
csf tg小鼠，缺失了作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b的啮齿类动物为fcr ko小鼠，交配而得的小鼠为hil
‑
3/hgm
‑
csf tg,fcr ko小鼠。
[0042]
[23][20]的啮齿类动物，其为nog小鼠，正式品系名称表示为nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug csf3r
tm1(cmv
‑
csf3)
/jic。
[0043]
[24]人源化啮齿类动物，其是向[20]～[23]中任一项的人g
‑
csf基因敲入啮齿类动物移植人造血干细胞而得的，所述人源化啮齿类动物在外周循环有人嗜酸性粒细胞。
[0044]
[25]人病原菌感染症模型啮齿类动物，其是使细菌或病毒感染[24]的人源化啮齿类动物而得的。
[0045]
[26]插入人il
‑
3、gm
‑
csf和il
‑
5基因、并且fcer1g和fcgr2b缺损的啮齿类动物，其是在已插入人il
‑
3、gm
‑
csf和il
‑
5基因的啮齿类动物中进一步使作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b缺失而得的。
[0046]
[27][26]的插入人il
‑
3、gm
‑
csf和il
‑
5基因、并且fcer1g和fcgr2b缺损的啮齿类动物，其是将已插入人il
‑
3、gm
‑
csf和il
‑
5基因的啮齿类动物与缺失了作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b的啮齿类动物进行交配而得的。
[0047]
[28][26]或[27]的啮齿类动物，其中，已插入人il
‑
3、gm
‑
csf和il
‑
5基因的啮齿类动物为hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg小鼠，缺失了作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b的啮齿类动物为fcr ko小鼠，交配而得的小鼠为hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg,fcr ko小鼠。
[0048]
[29][28]的啮齿类动物，其为nog小鼠，正式品系名称表示为nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug csf3r
tm1(cmv
‑
csf3)
/jic。
[0049]
[30]人源化啮齿类动物，其是向[26]～[29]中任一项的人g
‑
csf基因敲入啮齿类动物移植人造血干细胞而得的，所述人源化啮齿类动物在外周循环有人嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
[0050]
[31]人病原菌感染症模型啮齿类动物，其是使细菌或病毒感染[30]的人源化啮齿类动物。
[0051]
本说明书包含作为本技术的优先权基础的日本专利申请号2019
‑
062919的公开内容。
[0052]
发明效果
[0053]
本发明的移植了人造血干细胞的啮齿类动物是向啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中敲入人g
‑
csf基因而得的敲入啮齿类动物，其在外周循环有人嗜中性粒细胞、单核细胞，是重现了人免疫系统的人源化啮齿类动物。这样的啮齿类动物可用于研究人的免疫系统等。并且，本发明的小鼠是首创的在外周血中长期循环有人嗜中性粒细胞的人源化小鼠，对于针对人的细菌感染的先天性防御机制的研究是有用的。进而通过使病原菌进行感染，可作为人感染症的模型啮齿类动物进行利用。
[0054]
通过使用人嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞高度分化、并长期得到维持的人源化小鼠，重现以往难以实现的难治性哮喘等重度人变态反应疾病成为可能。
附图说明
[0055]
图1：为示出人g
‑
csf敲入靶向载体的结构的图。
[0056]
图2：为示出人g
‑
csf敲入小鼠的小鼠g
‑
csf受体基因型的图。
[0057]
图3：为示出人g
‑
csf敲入小鼠血清中的人g
‑
csf浓度(平均值)的图。
[0058]
图4：为示出人g
‑
csf敲入小鼠粒细胞上的小鼠g
‑
csf受体表达缺失的图。
[0059]
图5：为示出人g
‑
csf敲入小鼠血中的小鼠嗜中性粒细胞数的图。
[0060]
图6：为示出对人g
‑
csf敲入小鼠的放射线敏感性进行分析的结果的图。
[0061]
图7：为示出由人造血干细胞进行人源化12周后的人g
‑
csf敲入小鼠血中人细胞的比例的图。
[0062]
图8：为示出由人造血干细胞进行人源化4、8和12周后的人g
‑
csf敲入小鼠血中人cd45 细胞的比例和细胞数的图。
[0063]
图9：为示出由人造血干细胞进行人源化4、8和12周后的人g
‑
csf敲入小鼠血中人嗜中性粒细胞的比例和细胞数的图。
[0064]
图10：为示出由人造血干细胞进行人源化4、8和12周后的人g
‑
csf敲入小鼠血中人单核细胞的比例和细胞数的图。
[0065]
图11：为示出通过吉姆萨染色分析由人造血干细胞进行人源化而得的人g
‑
csf敲入小鼠的人嗜中性粒细胞的形态所得结果的图。
[0066]
图12：为示出分析由人造血干细胞进行人源化而得的人g
‑
csf敲入小鼠的人嗜中性粒细胞的活性氧(ros)产生能力所得结果的图。
[0067]
图13：为示出由人造血干细胞进行人源化而得的人g
‑
csf敲入小鼠的血清中的人细胞因子的产生的图。
[0068]
图14：为示出向由人造血干细胞进行人源化而得的人g
‑
csf敲入小鼠施予酵母聚糖(zymosan)4h后的人嗜中性粒细胞的比例的图。
[0069]
图15：为示出向由人造血干细胞进行人源化而得的人g
‑
csf敲入小鼠施予酵母聚糖4h后的各种人细胞的比例的图。
cell)时，人g
‑
csf在啮齿类动物体内刺激人造血干细胞，人嗜中性粒细胞和单核细胞进行分化并增殖，在外周血中循环。即，向啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中敲入人g
‑
csf基因而得的啮齿类动物移植人hsc后，在该啮齿类动物的体内，人造血系统被重建。这意味着，该啮齿类动物是在其体内重建有人造血系统的人源化啮齿类动物。该啮齿类动物中，在外周循环有人嗜中性粒细胞、单核细胞。
[0086]
本发明包含被敲入人g
‑
csf基因而得的敲入啮齿类动物的制备方法，所述方法包括将人g
‑
csf基因敲入啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中的步骤。
[0087]
还包含通过向被敲入人g
‑
csf基因而得的敲入啮齿类动物移植人hsc来制备下述啮齿类动物的方法，所述啮齿类动物是啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因而得的敲入啮齿类动物，其移植有人hsc，且在外周分化并循环有人嗜中性粒细胞。
[0088]
本发明还包含啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因而得的敲入啮齿类动物，其移植有人hsc、且在外周分化并循环有人嗜中性粒细胞。
[0089]
在本发明中，啮齿类动物没有限定，可举出小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、海狸鼠等，其中优选小鼠。
[0090]
人g
‑
csf基因的碱基序列示于序列号1中，小鼠g
‑
csf受体基因的碱基序列示于序列号2中。
[0091]
本发明中使用的在外周循环有人嗜中性粒细胞的人源化啮齿类动物是人嗜中性粒细胞等人细胞不会被免疫排斥的啮齿类动物，即，是针对人的免疫反应未激活的啮齿类动物。作为这样的动物，可举出免疫功能低下或缺损的、针对人的免疫反应未激活的啮齿类动物，例如，可以使用免疫缺陷啮齿类动物。
[0092]
免疫缺陷啮齿类动物是免疫功能低下或缺损的动物，是t细胞、b细胞、nk细胞、树突状细胞、巨噬细胞中的部分或全部缺损的动物。免疫缺陷啮齿类动物可以通过全身照射x射线来制备，或者可以使用遗传上免疫功能缺损的啮齿类动物。
[0093]
作为免疫缺陷小鼠，可举出裸小鼠、nod/scid小鼠、rag2敲除小鼠、向scid小鼠施予asialo gm1抗体、tmβ1而得的小鼠、x射线照射小鼠等。此外，还可使用在上述nod/scid小鼠、rag2敲除小鼠中叠加il
‑
2rγ敲除而得的敲除动物(以下为dko(双敲除)动物)。例如，可使用dko小鼠(rag2 ko、il
‑
2r
null
)。在本发明中，将遗传背景为balb/c的dko小鼠称为balb/c dko小鼠，将遗传背景为nod的小鼠称为nod dko小鼠。此外，小鼠的遗传背景不限于此，可以是c57bl/6、c3h、dba2、iqi品系，可以是具有scid突变和il
‑
2rγ敲除、或者rag2敲除和il
‑
2rγ敲除突变的品系，并且由于在il
‑
2受体的共通γ链的下游负责信号传递的jak3蛋白的缺损也具有与il2rγ
null
同样的表型，因此也可以是在rag2敲除小鼠中叠加jak3敲除而得的敲除小鼠、叠加scid突变和jak3敲除而得的敲除小鼠、将它们进行交配而得的近交系、非近交系、杂交系(f1杂交种)小鼠。
[0094]
进而，为了将该小鼠中观察到的nk细胞等免疫细胞造成的影响排除在外，除了如上所述向scid小鼠中施予asialo gm1抗体而进行使用的方式以外，作为可用于本发明中的其他小鼠，可举出如下基因修饰免疫缺陷小鼠，所述小鼠的il
‑
2受体γ链基因中导入突变使il
‑
2受体γ链缺损，且与t细胞和b细胞的抗原受体基因的重建相关的基因的scid突变位于双等位基因座。作为这样的小鼠，可举出作为来源于nod/scid小鼠、并敲除il
‑
2受体的共通γ链而得的小鼠的nog小鼠(nod/scid/γc
null
(nod/shi
‑
scid,il
‑
2rγko小鼠))、nsg小
鼠(nod/scid/il2rγ
null
(nod.c g
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1wjl
/szj))、ncg小鼠(nod
‑
prkdc
em26cd52
il2rg
em26cd22
/njucrl)等。还可使用向jak3基因中导入突变使jak3缺损、且参与t细胞和b细胞的抗原受体基因的重建的基因的scid突变位于双等位基因座的基因修饰免疫缺陷小鼠noj小鼠(nod/scid/jak3
null
(nod.cg
‑
prkdc
scid
jal3
tm1card
))。以下，将通过scid突变等而使prkdc基因、及其基因产物的功能缺损、并且通过il2rγ基因的缺损、突变、或位于信号传递下游的基因及其产物的功能缺损而使il2rγ基因产物的正常功能丧失而得的这些动物指称为nog小鼠(“nog mouse”为注册商标)，亦可作为宿主使用。由于在上述小鼠中未观察到淋巴细胞的存在，nog小鼠未示出nk活性也缺损树突状细胞功能。nog小鼠的制出方法记载于wo2002/043477中。nsg小鼠的制出方法记载于ishikawa f.等，blood 106:1565
‑
1573,2005中，ncg小鼠的制出方法记载于zhou j.等，int j biochem cell biol 46:49
‑
55,2014中，noj小鼠的制出方法记载于okada s.等，int j hematol 88:476
‑
482,2008中。
[0095]
敲入人g
‑
csf基因的方法没有限定，例如，可通过同源重组、基因组编辑来敲入。
[0096]
同源重组指细胞内2个dna分子介由相同的碱基序列相互发生重组的现象，是具有庞大的基因组dna的生物的重组所常用的方法。构建以将作为靶标的基因位点的序列在中央处分隔的形式，与其他dna连接而成的质粒(称为靶向载体)。即，分离人g
‑
csf基因，制备该基因的dna被夹在啮齿类动物的g
‑
csf受体的上游部分和下游部分的同源序列之间的构建体，将所述构建体插入已知的载体中，制备靶向载体。导入免疫缺陷啮齿类动物的es细胞(胚胎干细胞)中。通过同源重组，发生啮齿类动物的g
‑
csf受体基因dna与靶向载体上的同源序列部分之间的交换，被夹住的其他dna被组入作为靶基因的g
‑
csf受体基因中，该基因丧失功能。如此建立了es细胞，将该es细胞注入啮齿类动物胚或囊胚中，将嵌合胚移植到假孕啮齿类动物的子宫中，制备嵌合小鼠。通过将得到的嵌合小鼠与前述免疫缺陷啮齿类动物进行交配，可以得到以杂合形式具有敲入啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中的人g
‑
csf基因的f1个体。通过使该杂合个体彼此交配，可以得到以杂合形式具有敲入啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中的人g
‑
csf基因的免疫缺陷啮齿类动物。
[0097]
此时，作为制备靶向载体的载体，可以使用在啮齿类动物的es细胞中可表达、可转化的载体，可以使用来源于大肠杆菌的质粒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、牛痘病毒等。
[0098]
可以使启动子连接于人g
‑
csf基因的上游，例如，可以使用cmv启动子等。
[0099]
靶向载体向es细胞的导入可以通过已知的电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、脂质转染法、显微注射法、粒子枪法等实施。
[0100]
载体可含有用于筛选的标记基因，作为标记基因，可举出潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。标记基因可以在同源重组体的选择后除去，可以通过利用cre
‑
loxp系统、flp
‑
frt系统来除去。
[0101]
还可以使用啮齿类动物的ips细胞等干细胞来替代es细胞。
[0102]
基因组编辑是利用位点特异性核酸酶修饰靶基因的方法。作为基因组编辑的方法，通过使用的核酸酶，可举出zfn(锌指核酸酶：zinc finger nuclease)法(urnov,fyodor d.等，natur,vol 435,2june2005,pp.642
‑
651)、talen(tale核酸酶)法(mahfouz,magdy m等，pnas february 8,2011,108(6),pp.2623
‑
2628)、crispr(聚簇有规律间隔的短回文重
复序列：clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/cas9(crispr相关蛋白9：crispr associated protein 9)(jinek,martin,等，science,vol 337,17august 2012,pp.816
‑
821)、crispr/cas3等基于crispr/cas系统的方法等。上述方法还包括使用切口酶修饰型cas的方法等将核酸酶进行了修饰的方法。其中，基于crispr/cas9系统的方法是优选的。crspr/cas9系统中，例如，将如下靶向载体注入免疫缺陷啮齿类基因的受精卵中，所述靶向载体包含具有含有与希望通过切割而使功能缺损的啮齿类动物的g
‑
csf受体基因的靶序列互补的序列的向导rna(guide rna)(crrna、tracrrna)和作为核酸酶的cas9，以及作为供体dna敲入的人g
‑
csf基因dna。在受精卵内，啮齿类动物的g
‑
csf受体基因缺损，取而代之的是人g
‑
csf基因被敲入。
[0103]
通过基因组编辑破坏啮齿类动物的g
‑
csf受体基因的情况下，可以选择基因中的靶序列，设计包含与该序列互补的序列的向导rna的序列。向导rna的碱基长度优选为20个以上。基于crspr/cas9的基因组编辑可以使用市售的crispr/cas9工具实施。
[0104]
nog小鼠的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因而得的敲入小鼠的品系正式地以nod.cg
‑
prkdc
scid il2rg
tm1sug
csf3r
tm1(cmv
‑
csf3)
/jic这一正式品系名称表示，简称为hg
‑
csf ki。
[0105]
通过向如此得到的啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因的敲入啮齿类动物移植人造血干细胞，可以得到人造血干细胞植入啮齿类动物中、且在外周循环有人嗜中性粒细胞的人源化啮齿类动物。
[0106]
移植前向敲入啮齿类动物照射放射线是优选的。此时，照射0.5～1.5gy，优选0.8～1.3gy，进一步优选1gy的放射线是优选的。
[0107]
人造血干细胞(cd34 细胞)的移植优选经由静脉实施，例如，可经由尾静脉实施。移植的人造血干细胞取决于啮齿类动物的体重，但在例如小鼠的情况下，可以移植103～106个，优选104～105个，进一步优选4～5
×
104个。可以在移植后2～20周，优选3～16周，进一步优选4～12周得到在外周循环有人嗜中性粒细胞的人源化啮齿类动物。
[0108]
2、啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因、并且移植人造血干细胞(hsc:hematopoietic stem cell)而得的、在外周循环有人嗜中性粒细胞的人源化啮齿类动物的特性
[0109]
在1、中制备的啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因、并移植人hsc、在外周循环有人嗜中性粒细胞的人源化啮齿类动物具有以下特性。
[0110]
人g
‑
csf存在于血中，细胞中啮齿类动物g
‑
csf受体缺损。由此，啮齿类动物的嗜中性粒细胞减少，或者不存在。
[0111]
人嗜中性粒细胞进行分化、增加，并在外周血进行循环。人嗜中性粒细胞的比例在移植后12周为4～12％。此外，人嗜中性粒细胞具有活性氧产生能力。
[0112]
人嗜中性粒细胞和单核细胞进行分化、增加，并在外周血进行循环。人单核细胞的比例在移植后12周为10～40％。
[0113]
来源于骨髓细胞的人细胞因子存在于血中。作为细胞因子，可举出il
‑
8、il
‑
6、il
‑
10、mcp
‑
1、mip1a、mip
‑
1b、ifng等。
[0114]
移植具有上述特性的人造血干细胞而得的本发明的敲入啮齿类动物能够重现人的自然免疫系统。
[0115]
例如，通过施予作为tlr2配体的酵母聚糖，人嗜中性粒细胞增加，并且人细胞因子浓度增加。此外，通过施予大肠杆菌等细菌，人嗜中性粒细胞增加，重现了人在细菌感染时发生的紧急粒细胞生成(emergency granulopoiesis)。此外，由于施予细菌，人细胞因子浓度增加。
[0116]
3、啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因、并移植人造血干细胞(hsc:hematopoietic stem cell)而得的、在外周循环有人嗜中性粒细胞的人源化啮齿类动物的利用
[0117]
啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因、并移植人造血干细胞(hsc:hematopoietic stem cell)而得的、在外周循环有人嗜中性粒细胞的人源化啮齿类动物能够重现人的自然免疫系统，可用于人的免疫学研究。
[0118]
此外，通过使该啮齿类动物感染细菌，可以用于针对人的细菌感染的先天性防御机制的研究。
[0119]
本发明包含人感染症模型啮齿类动物，所述人感染症模型啮齿类动物是使啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因、并移植人造血干细胞(hsc:hematopoietic stem cell)而得的、在外周循环有人嗜中性粒细胞的人源化啮齿类动物感染细菌、病毒而得的。作为细菌、病毒，可举出作为病原菌作用于人的病原性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、沙门氏菌属菌、空肠/大肠弯曲菌(campylobacter jejuni/coli)、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、肉毒杆菌、蜡样芽孢杆菌、韦尔氏菌、诺如病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒等。通过使上述病原菌对本发明的啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因、并在外周循环有人嗜中性粒细胞的人源化啮齿类动物进行感染，可以制备人感染症的模型啮齿类动物。使用该模型啮齿类动物可以研究人的感染症防御机制，进而可以用于新的治疗方法、治疗药的探索。
[0120]
4、hg
‑
csf ki,fcr ko啮齿类动物
[0121]
本发明包含啮齿类动物的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因、并且fcer1g和fcgr2b缺损的啮齿类动物，所述啮齿类动物是将敲入上述人g
‑
csf基因的啮齿类动物与缺失了作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b的啮齿类动物进行交配而制得的。
[0122]
通过将人造血干细胞(cd34 细胞)移植到该啮齿类动物中，人嗜中性粒细胞进行分化、增加，并在外周血进行循环。人造血干细胞(cd34 细胞)的移植可以通过上述方法实施。
[0123]
作为啮齿类动物，可举出免疫功能低下或缺损、针对人的免疫反应未激活的啮齿类动物，作为这样的免疫缺陷啮齿类动物可举出上述免疫缺陷啮齿类动物。其中，小鼠，尤其nog小鼠是优选的。
[0124]
作为小鼠，可举出将上述hg
‑
csf ki小鼠与缺失了作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b的fcr ko小鼠(inoue y等，journal of immunology 2007；179:764
‑
774.)进行交配而得的hg
‑
csf ki/fcr ko小鼠。需要说明的是，使fcer1g基因、fcgr2b基因通过基因组编辑而缺失，也可以制备hg
‑
csf ki/fcr ko小鼠。
[0125]
对于该小鼠而言，nog小鼠的g
‑
csf受体基因座中被敲入人g
‑
csf基因、并且fcer1g和fcgr2b缺损。
[0126]
通过向该小鼠移植人造血干细胞(cd34 细胞)，人嗜中性粒细胞进行分化、增加，并在外周血进行循环。人嗜中性粒细胞的比例在移植后4周为15～20％。此外，人嗜中性粒细胞具有活性氧产生能力。
[0127]
本发明包含使上述啮齿类动物感染细菌、病毒而得的人感染症模型啮齿类动物。细菌、病毒如上所述。
[0128]
5、hil
‑
3/hgm
‑
csf tg,fcr ko啮齿类动物和hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg,fcr ko啮齿类动物
[0129]
本发明包含基因组中被插入人il
‑
3和gm
‑
csf基因、并且fcer1g和fcgr2b缺损的啮齿类动物，所述啮齿类动物是将基因组中已插入人il
‑
3和gm
‑
csf基因的啮齿类动物与缺失了作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b的啮齿类动物进行交配而得的。
[0130]
通过向该啮齿类动物移植人造血干细胞(cd34 细胞)，人嗜酸性粒细胞进行分化、增加，并在外周血进行循环。
[0131]
作为免疫缺陷啮齿类动物可举出上述免疫缺陷啮齿类动物。其中，小鼠，尤其nog小鼠是优选的。
[0132]
在小鼠的情况下，可举出hil
‑
3/hgm
‑
csf tg小鼠(ito r等，journal of immunology 2013；191:2890
‑
2899.)与fcr ko小鼠进行交配而得的hil
‑
3/hgm
‑
csf tg,fcr ko小鼠。需要说明的是，使fcer1g基因、fcgr2b基因通过基因组编辑而缺失，也可以制备hil
‑
3/hgm
‑
csf tg,fcr ko小鼠。
[0133]
通过向该小鼠移植人造血干细胞(cd34 细胞)，人嗜酸性粒细胞进行分化、增加，并在外周血进行循环，在移植后4周为10～15％。
[0134]
进而，本发明包含啮齿类动物的基因组中插入人il
‑
3、gm
‑
csf和il
‑
5基因、并且fcer1g和fcgr2b缺损的啮齿类动物，所述啮齿类动物是将基因组中插入有人il
‑
3、gm
‑
csf和il
‑
5基因的啮齿类动物与缺失了作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b的啮齿类动物进行交配而得的。
[0135]
通过向该啮齿类动物移植人造血干细胞(cd34 细胞)，人嗜酸性粒细胞和人嗜碱性粒细胞进行分化、增加，并在外周血进行循环。
[0136]
作为免疫缺陷啮齿类动物可举出上述免疫缺陷啮齿类动物。其中，小鼠，尤其nog小鼠是优选的。基因组中插入有人il
‑
3、gm
‑
csf和il
‑
5基因的啮齿类动物分泌人il
‑
3、gm
‑
csf、il
‑
5细胞因子，在人造血干细胞移植后能够分化嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥満细胞等人细胞。
[0137]
在小鼠的情况下，可举出将hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg小鼠(ito r等，jci insight.2018nov 2；3(21))与fcr ko小鼠进行交配而得的hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg,fcr ko小鼠。需要说明的是，使fcer1g基因、fcgr2b基因通过基因组编辑而缺失，也可以制备hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg,fcr ko小鼠。
[0138]
通过向该小鼠移植人造血干细胞(cd34 细胞)，人嗜酸性粒细胞进行分化、增加，并在外周血进行循环。人嗜酸性粒细胞的比例在移植后4周为20～30％。
[0139]
此外，通过向该小鼠移植人造血干细胞(cd34 细胞)，人嗜碱性粒细胞进行分化、增加，并在外周血进行循环。人嗜碱性粒细胞的比例在移植后4周为4～8％。
[0140]
本发明包含使上述啮齿类动物感染细菌、病毒而得的人感染症模型啮齿类动物。细菌、病毒如上所述。
[0141]
图23中示出了小鼠品系与人粒细胞在人白细胞中所占比例的关系。
[0142]
[实施例]
[0143]
通过以下实施例具体说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
[0144]
实施例1：人嗜中性粒细胞分化的人g
‑
csf敲入小鼠
[0145]
1、ki靶向载体的制备
[0146]
将人g
‑
csf基因与作为全身性表达启动子的巨细胞病毒(cmv)启动子邻接地配置在其下游，以小鼠g
‑
csf受体区域上游3.3kb和下游6.5kb的同源序列夹持，制备ki靶向载体。靶向载体的结构示于图1中。
[0147]
2、人g
‑
csf敲入小鼠的制备
[0148]
以如上所述制得的靶向载体对nog小鼠es细胞施以电穿孔，建立同源重组es细胞，然后制备嵌合小鼠，进而通过与nog小鼠的交配建立f1小鼠，用pcr法分析g
‑
csf受体基因。图2中示出基因分析的结果。所建立的小鼠的系统正式地以nod.cg
‑
prkdc
scid il2rg
tm1sug
csf3r
tm1(cmv
‑
csf3)
/jic这一正式品系名称表示，简称为hg
‑
csf ki。
[0149]
3、hg
‑
csf ki小鼠的评价
[0150]
(1)人g
‑
csf的表达的确认
[0151]
利用肝素采集6～8周龄的hg
‑
csf ki小鼠(杂合、纯合)和nog小鼠血液，通过离心操作分离血浆后，用human g
‑
csf quantikine elisa kit(r&d systems)测定人g
‑
csf细胞因子水平。结果示于图3中。ki/ 杂合小鼠和ki/ki纯合小鼠中，人g
‑
csf细胞因子分别以1.69μg/ml和1.87μg/ml的高浓度表达。
[0152]
(2)小鼠g
‑
csf受体的表达
[0153]
利用肝素采集6～8周龄的hg
‑
csf ki小鼠和nog小鼠血液，使红细胞溶血并分离白细胞，用抗小鼠g
‑
csf受体抗体染色后，用流式细胞仪测定表达。结果示于图4中。ki/ki纯合小鼠的粒细胞未观察到g
‑
csfr的表达，由此表明基因破坏导致了表达消失。
[0154]
(3)小鼠嗜中性粒细胞数的确认
[0155]
利用肝素采集6～8周龄的hg
‑
csf ki小鼠(杂合、纯合)和nog小鼠血液，使红细胞溶血并分离白细胞，用抗小鼠gr1抗体染色后用流式细胞术分析小鼠嗜中性粒细胞数。结果示于图5中。小鼠嗜中性粒细胞数在ki/ 中显著增加，在ki/ki中为非常低的值，由此表明在ki/ki小鼠中由小鼠g
‑
csf受体缺损导致小鼠嗜中性粒细胞减少。
[0156]
4.人g
‑
csf敲入小鼠的人源化
[0157]
(1)放射线敏感性测试
[0158]
向6～8周龄的hg
‑
csf ki小鼠照射1、1.5、2、2.5gy的放射线，观察小鼠1个月以上，计数死亡率。放射线敏感性测试的结果示于图6中。hg
‑
csf ki小鼠与nog小鼠放射线相比敏感性高，在2gy下约9成左右的小鼠死亡，在1.5gy下也有2成左右死亡。因此，采用1gy作为最适的照射条件。
[0159]
(2)人嗜中性粒细胞的确认
[0160]
向6～8周龄的hg
‑
csf ki小鼠照射1gy的放射线，次日经由尾静脉移植4～5
×
104个人cd34 细胞(hsc:造血干细胞)。采集移植后12周的外周血，用流式细胞仪分析人嗜中性
bioscience)定量血浆中的各种人细胞因子。结果示于图16中。hg
‑
csf ki小鼠中，在施予酵母聚糖后人il
‑
10、il
‑
1b、il
‑
6、mcp
‑
1、mip1a、mip
‑
1b和tnfa的产生显著增加，表明介由人嗜中性粒细胞、单核细胞
·
巨噬细胞的自然免疫应答与nog小鼠相比是亢进的。
[0179]
(12)大肠杆菌施予后的人细胞的比例
[0180]
向人源化14周后的hg
‑
csf ki小鼠和nog小鼠腹腔内施予4
×
108cfu的大肠杆菌溶液，于4小时后采集血液，实施人嗜中性粒细胞、单核细胞、b细胞的流式细胞术分析。结果示于图17中。人嗜中性粒细胞在大肠杆菌施予后显著增加，重现了在人的细菌感染时发生的紧急粒细胞生成。
[0181]
(13)大肠杆菌施予后的细胞因子的测定
[0182]
于图17所记载的实验中采集血浆，用cytokine beads array(cba:bd bioscience)定量血浆中的各种小鼠和人的细胞因子。图18
‑
1中示出小鼠细胞因子的定量结果，图18
‑
2中示出人细胞因子的定量结果。对小鼠细胞因子而言，在nog小鼠和hg
‑
csf ki小鼠间未观察到差别，对人细胞因子而言，il
‑
6、il
‑
1b、il
‑
8、mcp
‑
1、mip1a和tnfa的产生在g
‑
csf ki小鼠中显著亢进。基于此可认为，g
‑
csf ki小鼠是能够分析伴随细菌感染后的紧急粒细胞生成、人细胞因子亢进的自然免疫应答的人源化小鼠，作为细菌感染诱发的败血症的治疗药研发模型是有用的。
[0183]
实施例2：与fcr ko小鼠的交配造成的人嗜中性粒细胞的亢进
[0184]
缺失了作为与抗体的fc区进行结合的受体的构成分子的fcer1g和fcgr2b的fcr ko小鼠已经被建立(inoue y等，journal of immunology 2007；179:764
‑
774.)。新建立了将这一fcr ko小鼠与hg
‑
csf ki小鼠交配而得的hg
‑
csf ki,fcr ko小鼠，移植了人造血干细胞，结果显示，小鼠外周血中的人白细胞中的人嗜中性粒细胞的比例在hg
‑
csf ki小鼠中为2～5％左右，与之相对，在hg
‑
csf ki,fcr ko小鼠中增加4倍左右，为15～20％(图19)。嗜中性粒细胞在骨髓中以g
‑
csf依赖性的方式从造血干细胞分化，响应感染等刺激，分化亢进，同时迅速转移至刺激进入的局部，从而能够排除细菌。
[0185]
实施例3：与fcr ko小鼠的交配造成的人嗜酸性粒细胞的亢进
[0186]
将本技术发明人已经报道的hil
‑
3/hgm
‑
csf tg小鼠(ito r等，journal of immunology 2013；191:2890
‑
2899.)与fcr ko小鼠进行交配，新建立hil
‑
3/hgm
‑
csf tg,fcr ko小鼠。向上述小鼠移植人造血干细胞，结果显示，外周血中的人嗜酸性粒细胞的比例在hil
‑
3/hgm
‑
csf tg小鼠中为2～5％左右，相对地，在hil
‑
3/gm
‑
csf tg,fcr ko小鼠中增加3倍左右，为10～15％。(图20)
[0187]
此外，同样地将hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg小鼠(ito r等，jci insight.2018nov 2；3(21))与fcr ko小鼠进行交配，新建立hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg,fcr ko小鼠，向上述小鼠移植人造血干细胞，结果显示，小鼠外周血中的人白细胞中的人嗜酸性粒细胞的比例在hil
‑
3/hgm
‑
csf tg小鼠中为10～15％左右，相对地，在hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5/fcr ko小鼠中增加2倍左右，为20～30％(图21)。嗜酸性粒细胞在骨髓中从造血干细胞分化，由于il
‑
5等细胞因子而增加。在肺组织等局部于介由过敏原造成的炎症应答时观察到高度的组织浸润。
[0188]
实施例4：与fcr ko小鼠的交配造成的人嗜碱性粒细胞的亢进
[0189]
向hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg小鼠和hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg,fcr ko小鼠移植人造
血干细胞，测定小鼠外周血中的人白细胞中的人嗜碱性粒细胞的比例，结果显示，在hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg小鼠中为1～3％左右，相对地，在hil
‑
3/hgm
‑
csf/hil
‑
5tg,fcr ko小鼠中增加2倍左右，为4～8％(图22)。嗜碱性粒细胞在骨髓中从造血干细胞分化，由于il
‑
3等细胞因子而增加。过敏炎症时移动至局部，使炎症恶化。
[0190]
产业上的可利用性
[0191]
人嗜中性粒细胞分化的人g
‑
csf敲入啮齿类可作为人免疫系统的研究、人感染症模型小鼠进行利用。进而通过与fcr ko小鼠交配，可以更有效地诱导粒细胞，并可用于高敏感性感染症模型、过敏模型。
[0192]
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用直接并入本说明书中。