KDM6作为靶标在制备用于提高早期神经外胚层分化效率的药物中的应用的制作方法

id no.1所示和sed id no.2所示。
13.进一步地，所述kdm6b敲除试剂包括：靶向目标基因的sgrna，其核苷酸序列如sed id no.3所示和sed id no.4所示。
14.进一步地，所述kdm6抑制剂包括：gsk
‑
j1或者抑制kdm6表达的grna和/或shrna。
15.在本发明的第二方面，提供了kdm6a/kdm6b的敲除试剂或/和kdm6抑制剂在制备用于提高早期神经外胚层分化效率的药物中的应用。
16.在本发明的第三方面，提供了一种用于提高早期神经外胚层分化效率的药物，所述药物包括以下成分中的至少一种：
17.kdm6a的敲除试剂；
18.kdm6b的敲除试剂；
19.kdm6抑制剂。
20.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
21.本发明提供kdm6作为靶标在制备用于提高早期神经外胚层分化效率的药物中的应用，研究中发现，kdm6的缺失可以促进人胚胎干细胞向早期神经外胚层分化效率的提高，因为kdm6家族是h3k27me3的去甲基化酶，研究发现在早期神经外胚层分化过程中使用kdm6抑制剂(gsk
‑
j1)也可以提高其分化效率。因此，kdm6a的敲除试剂、kdm6b的敲除试剂和kdm6抑制剂可以通过提高早期神经分化效率从而促进神经元的早期生成，改善神经元凋亡(而不是改善已有神经元代谢)，是一种潜在的退行性疾病新型药。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
23.图1为本发明实施例的模式图；
24.图2为本发明实施例的培养过程示意图；
25.图3为kdm6在被ko后，早期神经分化过程中sox1、nestin、pax6表达量在上升的免疫荧光检测结果；
26.图4为kdm6在被ko后，早期神经分化过程中sox1、nestin、pax6表达量在上升的qrt
‑
pcr结果；
27.图5为人胚胎干细胞中kdm6抑制剂gskj1提高早期神经分化过程中sox1、nestin、pax6表达量，ezh2抑制剂gsk 126对早期神经分化过程中sox1、nestin、pax6表达量基本没有影响的免疫荧光结果；
28.图6为人胚胎干细胞中kdm6抑制剂gskj1提高早期神经分化过程中sox1、nestin表达量，ezh2抑制剂gsk 126对早期神经分化过程中sox1、nestin表达量基本没有影响的qrt
‑
pcr结果；
29.图7为人诱导多能干细胞中kdm6抑制剂gskj1提高早期神经分化过程中sox1、nestin、pax6表达量，ezh2抑制剂gsk 126对早期神经分化过程中sox1、nestin、pax6表达量基本没有影响的免疫荧光结果；
30.图8为人诱导多能干细胞中kdm6抑制剂gskj1提高早期神经分化过程中sox1、nestin表达量，ezh2抑制剂gsk 126对早期神经分化过程中sox1、nestin表达量基本没有影响的qrt
‑
pcr结果。
具体实施方式
31.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
32.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
33.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
34.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
35.第一部分是在人胚胎干细胞(hues8)中敲除kdm6a/kdm6b,诱导敲除细胞系向早期神经外胚层分化发现kdm6a/kdm6b的敲除可以促进早期神经外胚层的分化；
36.第二部分是在人胚胎干细胞(hues8)早期神经分化过程中加入kdm6抑制剂
‑
gskj1，从而促进早期神经分化；
37.第三部分是在人诱导多能干细胞(wtc)早期神经分化过程中加入kdm6抑制剂
‑
gskj1，从而促进早期神经分化。
38.下面将结合实施例及实验数据对本技术的kdm6作为靶标在制备用于提高早期神经外胚层分化效率的药物中的应用进行详细说明。
39.实施例1、在人胚胎干细胞(hues8)中敲除kdm6a/kdm6b
40.1、获得kdm6a/kdm6b基因敲除的人胚胎干细胞
41.通过crispr/cas9技术获得kdm6a/b两个基因都被敲除的细胞系dko1和dko2，方法步骤为：
42.(1)sgrna和genotype primers的设计合成
43.sgrna设计：对靶基因序列进行分析，筛选合适的靶位点，每个靶位点设计1条sgrna。通常，将cas9靶向编码功能蛋白结构域外显子的sgrna比单纯靶向5'外显子更有可能消除基因功能。
44.所述kdm6a敲除中，靶向目标基因的sgrna的核苷酸序列包括：
45.sgrna1
‑
kdm6a：5
’‑
cctgggagataaagccacca
‑3’
(如sed id no.1所示)；
46.sgrna2
‑
kdm6a：5
’‑
atcctaattctggccagtcc
‑3’
(如sed id no.2所示)；
47.所述kdm6b敲除中，靶向目标基因的sgrna的核苷酸序列包括：
48.sgrna1
‑
kdm6b：5
’‑
aggctggatgcatcgggcag
‑3’
(如sed id no.3所示)；
49.sgrna1
‑
kdm6b：5
’‑
ccgcattggccgactgcagc
‑3’
(如sed id no.4所示)；
50.(2)载体构建
51.根据设计的sgrna序列，合成oligo dna。酶切带有cas9基因的空载体(带有筛选基因(嘌呤霉素))得到线性化质粒，混合oligo dna与线性化空载体，以t4连接酶连接，添加
buffer与ddh2o，16℃连接过夜。
52.将连接产物转入dh5α大肠杆菌，37℃培养过夜。挑选单菌落进行扩增，提取质粒，进行酶切鉴定。对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，挑选具有正确大小的酶切产物进行测序验证，并质粒提取与质量检测。
53.(3)将验证的质粒转入新的dh5a感受态大肠杆菌中，37℃培养过夜。挑取单菌落进行扩增培养，提取质粒。检测内毒素；进行其吸光度检测(260nm/280nm的比例在1.8～2.0)；并通过琼脂糖电泳检测质粒的完整性。
54.(4)进行细胞转染：转染前1天，将生长状态良好的hues8细胞铺在6孔板中，细胞培养箱中培养过夜，至90％～95％的细胞密度。将转染所需试剂在37℃水浴锅中预热(包括opti
‑
mem、质粒)。
55.结果如表1所示：
56.表1 kdm6 ko基因型
57.细胞系名称kdm6a缺失碱基kdm6b缺失碱基dko1(del 10bp)(del 753bp敲掉起始密码子)dko2(del 53bp)(del 728bp)
58.在其他具体实施方式中，也可采用其他敲除或敲低方式。
59.2、细胞培养与分化
60.对照组：人胚胎干细胞
61.阳性组：上述步骤获得的kdm6a/kdm6b基因敲除的人胚胎干细胞
62.将所述对照组和所述阳性组进行细胞培养细胞传代后通过细胞计数板计数，24孔板每孔2.0
×
105个细胞，并将细胞置入37度培养箱中。
63.第0
‑
4天配制早期神经外胚层分化(图2)n2b27培养基，并加入小分子2.5μm sb431542(selleck,#s1067)和0.05μm ldn193189(selleck,#s7507)。在第
‑
1天用mtesr1(stemcell technologies,#1000023391)换液培养。
64.第5
‑
7天使用n2b27培养基和小分子0.05μm ldn193189(selleck,#s7507)。
65.第7天可以得到早期神经外胚层细胞。
66.所述第0天到第7天所用基础分化培养基：knockout
tm
dmem/f12(gibco,#12660012)；0.5
×
n2(上海源培生物科技有限公司,#m430721),0.5
×
b
‑
27supplement w/o vit a(上海源培生物科技有限公司,#b430805),10％penicillin
‑
streptomycin(thermo,#15140163),1％2
‑
mercaptoethanol(gibco,#2121115),1％glutamax
tm
supplement(thermo,#35050061),1％mem non
‑
essential amino acids(gibco,#11140
‑
050)；
67.3、免疫荧光检测早期神经祖细胞特异性蛋白表达情况
68.用dpbs将24孔培养皿中的细胞涮洗1次，然后每孔加4％多聚甲醛200ul室温固定10分钟。继续用dpbs涮洗3次，每次5分钟，后加封闭液(dpbs为溶剂，10％驴血清，3
‰
triton)室温封闭30分钟。再用dpbs涮洗3次，每次5分钟，后加oct3/4(c
‑
10)(santa cruz,#sc
‑
5279,1：200)，sox1(cst,#4194s,1：200)，nestin(10c2)(santa cruz,#sc
‑
23927,1：200)，pax6(biolegend,#901301,1：400)4度过夜。第二天用dpbs涮洗3次，每次5分钟，后加二抗：tritc
‑
conjugated donkey anti
‑
rabbit igg(jackson immuno research,#711
‑
025
‑
152,1：200)，488
‑
conjugated donkey anti
‑
mouse igg(jackson immuno research,#
715
‑
545
‑
150,1：200)室温一个小时。然后再用dpbs涮洗3次，每次5分钟后，敷dapi(1：5000),室温10分钟，最后然后再用dpbs涮洗3次，每次5分钟，可以拍荧光(显微镜：奥林巴斯)。
69.免疫荧光结果如图3所示，可知kdm6在被ko后，早期神经分化过程中sox1，nestin和pax6表达量在上升。
70.4、qrt
‑
pcr检测早期神经祖细胞rna表达情况
71.(1)试剂盒提取rna
72.所用试剂盒：hipure total rna mini kit(magen，#r4111
‑
03)
73.(2)反转录为cdna
74.反转录所用试剂：5xabscript ii rt mix(abclonal,#9620520803)。
75.反转录所用20ul体系，1ug rna，其余用rnase
‑
free水来补齐。
76.反转录所用程序：25℃5min，42℃15min，85℃30s，4℃停止。然后放入负20度冰箱保存。
77.(3)qrt
‑
pcr体系和程序
78.qrt
‑
pcr所用试剂：2
×
sybr green qpcr mix(biomake,#b21202)。
79.qrt
‑
pcr所用10ul体系：2
×
sybr green qpcr mix
‑
5μl，10ng cdna，其余用rnase
‑
free水来补齐。
80.qrt
‑
pcr所用程序：(95℃5min，95℃15s，60℃30s)重复39个循环，95℃15s,65℃到95℃呈0.5℃递增15s。
81.结果如图4所示，qrt
‑
pcr结果显示，kdm6在被ko后，早期神经分化过程中sox1，nestin，pax6表达量在上升。
82.综上，由图3的免疫荧光结果和图4的qrt
‑
pcr结果可知，使用wt的esc为对照组，kdm6a/6b
‑
dko细胞系dko1，dko2向早期神经祖细胞分化过程中，其早期神经标记分子sox1和nestin表达量均上升。
83.实施例2、在早期神经分化过程中加入kdm6抑制剂
‑
gskj1
84.1、材料
85.对照组：人胚胎干细胞(hues8)向早期神经外胚层分化。
86.阳性组：人胚胎干细胞(hues8)向早期神经外胚层分化过程中添加gsk j1和gsk126。
87.2、方法
88.同实施例1中的细胞培养和分化的步骤，其中对照组完全相同，阳性组在分化第0天到第七天添加gsk j1和gsk 126。
89.3、细胞总rna提取及qrt
‑
pcr检测
90.具体操作步骤同实施例1，qrt
‑
pcr实验结果如图6所示；
91.由图6的qrt
‑
pcr实验结果可知，免疫荧光结果显示kdm6抑制剂gskj1提高早期神经分化过程中sox1，nestin和pax6表达量，ezh2抑制剂gsk 126对早期神经分化过程中sox1，nestin和pax6表达量基本没有影响。
92.4、免疫荧光结果。
93.具体操作步骤同实施例1，免疫荧光结果如图5所示；
94.由图5的免疫荧光结果可知，kdm6抑制剂gsk j1可以促进早期神经外胚层重要标记分子的表达，ezh1/2抑制剂gsk 126对早期神经外胚层重要maker的表达没有影响。
95.实施例3、在早期神经分化过程中加入kdm6抑制剂
‑
gskj1
96.1、材料
97.对照组：人诱导多潜能干细胞(wtc)向早期神经外胚层分化。
98.阳性组：人诱导多潜能干细胞(wtc)向早期神经外胚层分化过程中添加gsk j1和gsk 126。
99.2、方法
100.同实施例1中的细胞培养和分化的步骤，其中对照组完全相同，阳性组在分化第0天到第七天添加gsk j1和gsk 126。
101.3、细胞总rna提取及qrt
‑
pcr检测
102.具体操作步骤同实施例1，qrt
‑
pcr实验结果如图8所示；
103.由图8的qrt
‑
pcr实验结果可知，免疫荧光结果显示kdm6抑制剂gskj1提高早期神经分化过程中sox1，nestin和pax6表达量，ezh2抑制剂gsk 126对早期神经分化过程中sox1，nestin和pax6表达量基本没有影响。
104.4、免疫荧光结果。
105.具体操作步骤同实施例1，免疫荧光结果如图7所示；
106.由图7的免疫荧光结果可知，kdm6抑制剂gsk j1可以促进早期神经外胚层重要标记分子的表达，ezh1/2抑制剂gsk 126对早期神经外胚层重要maker的表达没有影响。
107.最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
108.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
109.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。