一种复合声敏剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及超声抗肿瘤领域，特别涉及一种复合声敏剂及其制备方法。


背景技术：

2.随着发病率和死亡率的不断上升，恶性肿瘤严重威胁着人类健康和生命安全。近年来，通过利用活性氧诱导细胞凋亡已被广泛应用于癌症治疗。其中，声动力疗法已经成为癌症治疗的一种有效策略而备受关注。超声波(ultrasound， us)介导的声动力治疗是一种非侵入性、高穿透深度的治疗方法，在治疗深部实体肿瘤方面具有较大的潜力。通过利用超声波触发声敏剂，产生过量的活性氧引发氧化应激，杀伤癌细胞，是声动力治疗肿瘤的内在机制。理想的声动力疗法需要三要素：超声激发、氧气和声敏剂。其中，肿瘤乏氧和氧气供应不足已成为限制声动力疗法用于肿瘤疗效的主要因素之一，且在声动力治疗过程中，氧气的进一步消耗会加剧肿瘤的乏氧状态。
3.研究表明，由于实体瘤的肿瘤细胞快速增殖、血管发育不全、分布不均匀造成其内部氧气供应不足，导致肿瘤内乏氧。因此，乏氧是晚期实体肿瘤的一个主要特征。乏氧进一步加剧肿瘤基因的不稳定性并激活肿瘤生长因子，促进肿瘤的转移，严重限制了治疗效果。其中，乏氧诱导因子－1α(hypoxia induced factor 1α，hif－1α)相关信号通路的高表达，进一步抑制上皮标志物e－cadherin的表达，促进间质标志物n－cadherin和vimentin的表达，增加肿瘤细胞的迁移性和侵袭性。所以，乏氧与肿瘤的发生、发展、预后和转移密切相关。针对肿瘤乏氧的高效治疗是实现肿瘤彻底治愈必须攻克的重要难题之一。
4.随着纳米技术的广泛发展，为缓解或逆转肿瘤缺氧区，研究者开发了基于全氟化碳、血红蛋白和过氧化氢酶等新型产氧纳米材料，提高肿瘤乏氧区域的氧气浓度，从而提高声动力疗法对乏氧肿瘤的疗效。然而，这些方法存在诸多弊端，例如，全氟化碳负载氧气效率低，且它本身具有毒性，高浓度的摄入会对机体造成严重威胁；游离的血红蛋白四聚体分子及其分解产物能渗透血管内皮进入器官及组织间质，会引发副作用；由于肿瘤微环境过氧化氢浓度低，负载过氧化氢酶的纳米粒子缺少反应底物来产生足够的氧气，从而难以达到理想治疗效果。因此，开发新型氧气载体，设计和构建高效且生物安全性高的持续供氧体系缓解肿瘤乏氧微环境是改善声动力治疗效果的最佳手段之一。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种复合声敏剂及其制备方法，所述复合声敏剂高效且生物安全性高，可持续供氧以缓解肿瘤乏氧微环境，改善了声动力治疗的效果。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种复合声敏剂，所述复合声敏剂包括声敏剂纳米粒子以及产氧微生物。
7.进一步地，所述声敏剂纳米粒子为双金属锰钨氧化物(表示为：mn
a
w
b
o
x
，或 m)纳米粒子。用于多模态成像导航下的肿瘤声动力治疗，由于mn(ii)离子和w 元素的存在，mn
a
w
b
o
x
纳米粒子可用于磁共振造影和计算机断层扫描成像。
8.进一步地，所述产氧微生物为蓝细菌(表示为：cyanobacteria，或cyan)。近年来，微生物在生物纳米医学领域受到广泛关注。将微生物和纳米材料整合起来，功能互补，包含治疗、分子成像和生物检测等组合功能，对改善人类健康有较高的优势。蓝细菌是地球上最早出现的光合自养生物，它以水作为电子供体，利用太阳光能将co2还原成有机碳化合物，并释放氧气。将具有产氧能力的蓝细菌作为声敏剂的载体和“推进器”，可在乏氧肿瘤中原位光合产氧，促进化学反应产生具有细胞毒性的单线态氧，从而解决声动力疗法对乏氧肿瘤效果较低的难题，为肿瘤超声治疗提供新的科学依据。
9.具体地，光合供氧伴以声敏剂mn
a
w
b
o
x
提高乏氧肿瘤的声动力功效。在660 nm波长激光辐照下，蓝细菌发生光合作用产生氧气，使得乏氧肿瘤区域发生光合氧合，进一步超声激发声敏剂，将氧气转变成大量有细胞毒性的单线态氧，从而重创缺氧的肿瘤组织和细胞达到高效治疗的目的。肿瘤乏氧环境的改善和声动力治疗后导致了免疫原性的细胞死亡，以及蓝藻本身可作为免疫佐剂激活免疫系统，从而实现声动力疗法与免疫的协同治疗。此外，大量的氧气释放抑制hif－1α基因的表达，进一步提高了声动力治疗的效率，并最终达到高效治疗肿瘤的目的。该发明为微生物纳米医学用于辅助增效声动力肿瘤治疗提供理论依据和实验支撑。
10.本发明还提供一种制备上述复合声敏剂的方法，所述制备方法包括：通过静电吸附作用将声敏剂纳米粒子负载在产氧微生物表面完成所述复合声敏剂的构建。
11.进一步地，所述产氧微生物表面带有负电荷，将所述产氧微生物分散在磷酸盐缓冲液中；所述声敏剂纳米粒子表面带有正电荷，将所述声敏剂纳米粒子加入所述磷酸盐缓冲液中，混合搅拌，所述产氧微生物和所述声敏剂纳米粒子通过正负电荷吸附作用进行结合(表示为：mn
a
w
b
o
x
＠cyan，或m＠c)。
12.进一步地，所述声敏剂纳米粒子为双金属锰钨氧化物(mn
a
w
b
o
x
)纳米粒子，所述双金属锰钨氧化物(mn
a
w
b
o
x
)纳米粒子的制备方法包括：使用高温有机相合成法制备双金属锰钨氧化物(mn
a
w
b
o
x
)初始粒子；以及使用氨基聚乙二醇硬脂酸(c
18
－polyethylene glycol－amine，c
18
－peg－nh2)对所述双金属锰钨氧化物 (mn
a
w
b
o
x
)初始粒子进行改性修饰得到所述双金属锰钨氧化物(mn
a
w
b
o
x
)纳米粒子。
13.进一步地，所述高温有机相合成法的步骤包括：将10－20ml苄醚、1－1.5g 的1，2－十二烷二醇和0.35－0.5g六羰基钨置入三颈烧瓶中，搅拌混合，在惰性气体保护下，将混合体系进行第一次加热，分别加入1－3ml油酸和1－3ml油胺，将其进行第二次加热，再加入0.25g乙酰丙酮锰，反应30分钟后，将体系冷却至室温，再加入过量乙醇，充分混合后离心，经洗涤剂反复洗涤，收集生成的所述双金属锰钨氧化物初始粒子。
14.进一步地，所述第一次加热的温度为100－120℃，所述第二次加热的温度为 230－260℃。
15.进一步地，所述洗涤剂为环己烷和乙醇的混合物。
16.进一步地，对所述双金属锰钨氧化物(mn
a
w
b
o
x
)初始粒子进行改性修饰的步骤包括：将10－12mg所述双金属锰钨氧化物(mn
a
w
b
o
x
)初始粒子和50mg氨基聚乙二醇硬脂酸(c
18
－polyethylene glycol－amine，c
18
－peg－nh2)混合于4－5ml 氯仿中，超声作用15－30min，然后将混合溶液在室温下搅拌2－3h，氮气烘干，然后溶解在去离子水中，4℃保存备用。
17.本发明提供一种新型具有高生物安全性、自供给氧气的超声激发的微生物增强型复合声敏剂，以实现高效的声动力肿瘤治疗。通过对蓝藻表面进行功能声敏剂的修饰，构建一种新型高效的微生物增强型复合微纳声敏系统用于肿瘤的声动力治疗。探究蓝藻的瘤内光合产氧作用机制，优化声敏剂的诊疗性能，并明确蓝藻－声敏剂－超声三者之间协同作用机理。以期该复合声敏剂在超声的作用下实现活性氧自由基的连续产出，以提高声动力肿瘤治疗效率。同时，光合作用增强的声动力疗法能够有效改善肿瘤免疫抑制微环境，诱导免疫原性细胞死亡介导的抗肿瘤免疫应答，最终实现肿瘤的声动力与免疫高效协同治疗。
18.与现有技术相比，本发明的复合声敏剂，在近红外激光照射下，产氧微生物持续的光合作用产生氧气，使得缺氧肿瘤区域发生光合氧合，超声激发声敏剂将氧气转变成大量有细胞毒性的单线态氧，从而有效杀死肿瘤细胞和破坏肿瘤组织。肿瘤乏氧环境的改善和声动力治疗后导致的免疫原性细胞死亡，实现声动力与免疫的协同治疗。与此同时，该复合声敏剂可用于磁共振成像和电子计算机断层扫描造影成像，实现对声动力治疗过程的实时监控。这项工作为使用杂化微生物的良好生物相容性和有效声动力的发展提供了良好的理论和实验支撑，并在微生物纳米医学的声动力中显示重要的临床转化前景。
19.更具体地，本发明的有益效果包括：
20.(1)本发明构建的微生物增强型复合声敏系统制备过程简便、原料来源广泛、实验装置简易、制备时间短且条件温和。
21.(2)为了解决声动力疗法中肿瘤乏氧问题，本发明设计一种稳定性好，粒径均一、分散性好、具有良好生物相容性的纳米声敏剂，并可作为成像对比剂用于磁共振成像和电子计算机断层扫描造影成像，实现对声动力疗效的实时监控；同时以蓝细菌为载体，构建超声激发的微生物增强型复合杂化微纳声敏系统，使其实现氧气及单线态氧的持续输出，为低氧实体肿瘤超声治疗提供新方法。
22.(3)本发明构建的超声激发的微生物增强型复合杂化声动力微纳声敏系统中，在超声辐射以及声敏剂和氧气的参与下，通过产生活性氧杀死肿瘤细胞。通过氧气含量测定，hif－1α表达实验等数据结果考察其产氧机制。构建的超小缺氧锰钨双金属氧化物mn
a
w
b
o
x
表现出高效的超声波触发生成活性氧，由于 mn
a
w
b
o
x
的缺氧结构充当电子陷阱位点，可以防止电子－空穴复合，同时持续高效的供氧增加了活性氧的产量，有利于增强声动力触发的癌细胞杀伤。开发新型高性能多功能声敏剂，将为超声波触发的非侵入性、便捷和经济有效的癌症治疗奠定坚实的基础。
23.(4)绝大多数实体肿瘤内存在乏氧微环境，肿瘤细胞会激活一系列相关分子信号传导途径以适应乏氧微环境。hif－1α是介导细胞对乏氧微环境进行适应性反应的关键性转录调控因子，在维持肿瘤细胞的能量代谢、心血管形成、细胞增殖和凋亡、肿瘤细胞侵袭转移等方面发挥重要的作用。本发明构建微纳声敏系统，使得肿瘤区域发生再氧合，下调hif－1α通路，改善肿瘤乏氧微环境，并且声动力治疗后导致了免疫原性的细胞死亡，由于氧气的产生和免疫增强的双重作用，从而实现了声动力与免疫的协同治疗。
24.(5)本发明提供了一种增强声动力疗法的有效方法，蓝细菌光合作用产氧改善了肿瘤内乏氧状态，超声激发产生大量的活性氧杀死癌细胞，同时肿瘤细胞的碎片可以作为抗原，解除免疫抑制微环境，激活其抗肿瘤免疫应答，从而实现肿瘤的高效活性氧与免疫协同治疗，从根本上防止肿瘤复发和转移，本发明拟深入研究探讨其协同治疗机制，以期为肿
瘤的精准高效提供新的思路。
附图说明
25.图1所示为实施例所得的一种复合声敏剂用于肿瘤的声动力与免疫协同治疗的方法的实验流程图；
26.图2为复合声敏剂的制备实验结果，其中，a是mn
a
w
b
o
x
纳米粒子的tem 图像；b是mn
a
w
b
o
x
纳米粒子的eds－mapping图像；c是蓝细菌细胞的tem图像；d是复合声敏剂mn
a
w
b
o
x
＠cyan的tem图像；e是复合声敏剂mn
a
w
b
o
x
＠cyan的eds－mapping图像；
27.图3为声敏剂的生物安全性评价预实验结果，a、b、c分别为不同浓度的蓝细菌、mn
a
w
b
o
x
纳米粒子、复合声敏剂mn
a
w
b
o
x
＠cyan的细胞毒性；
28.图4为蓝细菌产氧机制的实验结果，其中，a是肿瘤内注射蓝细菌(1.1
×
109细胞/毫升，100μl)并在激光照射下(50mw/cm2)在指定的时间点进行肿瘤光声成像；b是根据pa成像的平均氧水平的相应时间过程；c是瘤内注射蓝细菌(1.1
×
109细胞/毫升，100μl)后不同时间的hif－1α和cd31免疫组织化学分析和h&e染色；d是瘤内注射蓝细菌(1.1
×
109细胞/毫升，100μl)后hif－1α的蛋白质印迹分析；e、f是分别根据c对hif－1α和cd31的表达进行量化的结果。
29.图5为在缺氧和常氧条件下测定4t1细胞的活力。
30.图6为不同处理后的活细胞(绿色荧光)和死亡或晚期凋亡细胞(红色荧光)染色结果，其中，第一列对照组、第二列us组、第三列m＠c 激光组、第四列mnwoxnps us组、第五列m＠c 激光 us组。
31.图7为通过瘤内注射对4t1荷瘤小鼠进行级联光合氧化增强声动力疗法的体内评价。
32.图8～10为本发明实施例5方案效果图。
具体实施方式
33.本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4 和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4和2－5。在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
34.在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
35.在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，但是优选是顺序进行的。
36.实施例1
37.复合声敏剂的制备方法：
38.(1)采用高温有机相合成方法制备mn
a
w
b
o
x
初始粒子。将20ml苄醚、1.5g 的1，2－十二烷二醇和0.35g六羰基钨置入三颈烧瓶中，磁力搅拌混合；在氮气保护下，将混合体系加热至120℃，分别加入1ml油酸和1ml油胺，将其加热至 260℃，再加入0.25g乙酰丙酮锰，反应30分钟后，将体系冷却至室温，再加入过量乙醇，充分混合后离心，经环己烷和乙醇反复洗涤，收集生成的mn
a
w
b
o
x
初始粒子。
39.(2)使用c
18
－peg－nh2来修饰合成的mn
a
w
b
o
x
初始粒子，简单地说，10mgmn
a
w
b
o
x
初始粒子和50mg c
18
－peg－nh2混合于4ml氯仿中，超声作用15min。然后将混合溶液在室温下搅拌2h，氮气烘干制得mn
a
w
b
o
x
纳米粒子。将获得的 mn
a
w
b
o
x
－peg－nh2样品溶解在去离子水中，4℃保存备用。
40.(3)由于蓝细菌表面带有负电荷，mn
a
w
b
o
x
纳米粒子表面带有正电荷，因此可通过正负电荷吸附作用将材料和蓝细菌进行结合。具体步骤如下：将一定数量的蓝细菌细胞分散在磷酸盐缓冲液中，室温下，将合适比例的mn
a
w
b
o
x
纳米粒子溶液加入上述溶液中，混合搅拌，离心洗涤，备用。
41.实施例2
42.在进行体内治疗评估之前，分别对不同分组的细胞的体内生物相容性进行了系统研究。并且进一步检测白细胞(wbc)、平均血小板体积(mpv)、红细胞 (rbc)、平均红细胞血红蛋白(mch)、淋巴细胞、血红蛋白(hgb)、中性粒细胞 (neut)等血液学指标，同时检测血清谷丙转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)、肌酐(crea)和尿素等生化指标。
43.实施例3
44.(1)测试荷瘤小鼠模型中的再氧合和相关蛋白表达。首先，通过基于氧饱和度模式(so2)的光声(pa)成像评估了激光照射下的体内肿瘤氧合效应。将蓝细菌(1.1
×
109细胞/毫升，100μl)注射到携带4t1肿瘤的balb/c裸鼠中。pa成像监测so2的产生；
45.(2)体内持续的肿瘤氧合可能导致hif－1α的表达下调。然后通过蛋白质印迹监测hif－1α的表达；
46.(3)he染色与免疫组织化学染色动态监测监测hif－1α和cd31的表达。
47.实施例4
48.采用钙黄绿素/碘化丙啶(calcein－am/pi)染色进一步评价体外sdt性能。将4t1癌细胞接种到共聚焦培养皿中使其附着。然后将贴壁的4t1细胞放入密封的厌氧产气袋或湿化培养箱中，获得缺氧或常氧细胞。12h后，将m＠c生物混合声敏剂或mn
1.4
wo
x np与4t1细胞在缺氧或常氧条件下共孵育12h。随后，将与m＠c生物混合声敏剂共孵育的4t1细胞在预光照射后，用或不用us照射 1分钟。将与mn
1.4
wo
x np共孵育的4t1细胞用us照射。然后用calcein－am/pi 37℃孵育15min，pbs洗涤，然后用激光共聚焦显微镜观察。
49.实施例5
50.20只植入4t1肿瘤的小鼠随机分为5组，荷瘤小鼠经或不经激光照射，瘤内注射不同的药物，试验期为2周。每两天测量并计算肿瘤体积和小鼠体重，得到时间变化曲线。观察期结束时，处死所有小鼠，解剖取主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤组织。取肿瘤组织称重、照相、h&e、tunel试剂盒、ki67 抗体染色。
51.图1所示为本方案的复合声敏剂用于肿瘤的声动力与免疫协同治疗的实验流程图。本发明的复合声敏剂，在近红外激光照射下，产氧微生物蓝细菌持续的光合作用产生氧
气，使得缺氧肿瘤区域发生光合氧合，超声激发声敏剂 mn
a
w
b
o
x
纳米粒子将氧气转变成大量有细胞毒性的单线态氧，从而有效杀死肿瘤细胞和破坏肿瘤组织。肿瘤乏氧环境的改善和声动力治疗后导致的免疫原性细胞死亡，实现声动力与免疫的协同治疗。
52.如图2所示可以看出，前期初步制备了mn
a
w
b
o
x
、mn
a
w
b
o
x
－peg、 mn
a
w
b
o
x
－nh2、mn
a
w
b
o
x
＠cyan纳米材料，通过tem图像证明mn
a
w
b
o
x
纳米粒子呈现出均匀的球形形态，直径分布狭窄约为2－4nm，元素图谱显示出均匀分布的mn、w、o元素共存(图2b)，同时，tem图谱显示蓝细菌细胞呈典型的棒状结构，长度为2－4μm(图2c)，除此之外，图2e元素图谱进一步显示mn
a
w
b
o
x
纳米粒子可成功负载在cyan上。
53.如图3所示可以看出，在30天的观察中，实验组和对照组均无死亡，行为明显异常，体重差异显著(图3a)。白细胞(wbc)、平均血小板体积(mpv)、红细胞(rbc)、平均红细胞血红蛋白(mch)、淋巴细胞、血红蛋白(hgb)、中性粒细胞(neut)等血液学指标的结果表明，不同组间无显著差异(图3b
‑
h)。同时血清谷丙转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)、肌酐(crea)和尿素等生化指标的结果表明m@c对所有小鼠均无明显的肝肾毒性。
54.如图4所示可以看出，通过光声成像技术评价激光照射下体内肿瘤的氧合情况，在注射蓝细菌前，平均so2值为10.6％，表明肿瘤区域存在相对缺氧水平。当注入蓝藻并接受10分钟的激光照射(50mw/cm2)时，观察到显着的氧气张力。如图4a所示，在辐照结束时可以观察到饱和so2水平的爆炸性增长。照射 10分钟后，平均饱和so2水平从8.2％增加到28.0％。注射后60分钟后，平均 so2值为16.2％，略高于对照组(图4b)。即使辐照后so2水平逐渐降低，这种高氧张力水平仍可在注射后稳定保持75分钟，表明蓝细菌在体内持续产生so2的能力。体内持续的肿瘤氧合可能导致hif－1α的表达下调。然后通过蛋白质印迹和免疫组织化学染色动态监测hif－1α的表达。如图4c所示，蓝细菌和激光照射组合可以显着下调hif－1α的表达，特别是在给药2小时后。然后它在24小时时回到初始水平(图4f)。此外，cd31表达没有显着变化(图4e)。进一步的 wb分析发现注射后2小时hif－1α表达水平最低，这与免疫组织化学染色一致(图4d)。这些结果表明，蓝藻光合作用引起的肿瘤再氧合可以进一步下调 hif－1α的表达。众所周知，hif－1α作为缺氧信号传导的操作介质已被证明在肿瘤进展中发挥重要作用。在某种程度上，hif－1α的下调可能会提高治疗效果。
55.如图5所示，分别在缺氧和常氧条件下测定4t1细胞的活力。缺氧条件下，与mn
1.4
wo
x
纳米声敏剂加us组(71.0％细胞活力)相比，常氧条件下细胞活力明显下降至48.0％，说明氧气在高效sdt中起着不可或缺的作用。值得注意的是，光照m＠c在低氧条件下显示出更强的细胞毒性(29.0％细胞活力)，这表明光照 m＠c具有更强的肿瘤细胞杀伤功能。随后，采用钙黄素－乙酰氧甲基酯(钙黄素－ am)/碘化丙啶(pi)共染色进一步观察不同处理后的活细胞(绿色荧光)和死亡或晚期凋亡细胞(红色荧光)。对照组、us组和m＠c加激光组分别出现较强的绿色荧光(图6)，说明m＠c低强度us照射具有较高的生物相容性和较低的细胞毒性。但mn
1.4
wo
x
us组和m＠c 激光 us组在常氧条件下同时呈现明显的红色荧光信号，说明mn
1.4
wo
x
和m＠c均可作为us激活的声敏剂。
56.如图7所示，通过瘤内注射对4t1荷瘤小鼠进行级联光合氧化增强声动力疗法的体内评价。不同治疗后，每两天测量各组小鼠个体肿瘤体积和体重。整个治疗期间体重未见明显变化。14天治疗后，如图8、9所示，m＠c laser us 组的肿瘤生长明显受到抑制，肿瘤抑制率达到91.3％，说明在光合氧化和纳米声敏化剂支持的声动力ros生成辅助下，耐缺氧声动
力疗法具有较高的治疗效果。进一步采集肿瘤切片的h&e和免疫组化染色，观察其对肿瘤的高抑制效果。与对照组、us组和m＠c 激光组正常肿瘤组织状态比较，m＠c laser us组可见明显的组织损伤和细胞坏死，细胞核收缩破裂(图10)。在ki67抗体染色(图10) 中，m＠c laser us组的深棕色细胞代表肿瘤细胞增殖被显著抑制。同样， tunel染色显示，同一组不同处理后细胞凋亡的深棕色细胞面积最大。结果表明，蓝细菌介导的肿瘤微环境改善可以充分发挥声动力治疗的优势。体外和体内实验结果均证明，声敏化m＠c生物杂交能提高活性氧的产生率，增强声动力疗法的效力，在激光照射下显著抑制肿瘤生长。
57.以上所揭露的仅为本发明的优选实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。