斜带石斑鱼piscidin1及其合成多肽在制备抗病毒或抗细菌药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及斜带石斑鱼piscidin1及其合成多肽在制备抗病毒或抗细菌药物中的应用。


背景技术：

2.斜带石斑鱼(epinepheluscoioides)为鮨科(serranidae)鲈形目(perciformes)石斑鱼属(epinephelus)，是我国南方地区重要的海水养殖经济鱼类，因其富含蛋白质，营养价值高，肉质鲜嫩可口而深受广大海产消费者青睐，在水产海鲜市场的需求量较大，但细菌病和病毒病的出现给斜带石斑鱼的养殖造成重大的经济损失。其中，细菌类病原主要以弧菌属细菌(vibrio)为主，病毒类则主要有石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus，sgiv)和神经坏死病毒(red
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spotted grouper nervous necrosis virus，rgnnv)。而为了防治病害，化学药剂和抗生素等的滥用使耐药性菌株日益增多，造成了药物残留、耐药性及环境污染等严重问题。为此，开展鱼类免疫抗病的基础研究及研制新型抗病基因工程产品已经成为当务之急。
3.抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)是一类具有广谱抗微生物活性的天然小肽类物质，广泛存在于动物、植物和真菌中，具有多种生物学功能，如抗凋亡、抗病毒等，应用潜力很大。piscidin是一类来源于鱼类的抗菌肽，为α螺旋结构，富含阳离子，具有疏水性和两亲性，广泛存在于硬骨鱼类(特别是鲈形目类)中，目前已在不同鱼类中发现piscidin基因存在多种亚型，有些已应用于制备抗细菌及抗病毒的药物。例如中国专利cn 105801680a公开了一种石斑鱼piscidin 4多肽及其应用，其实验结果表明，piscidin 4具有抑制哈维氏弧菌(vibrioharveyi)和溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)生长，以及抑制sgiv和nnv复制的活性，但piscidin 4对其它致病菌，例如创伤弧菌等的抑制效果未知，且当piscidin 4的浓度达到1600μg/ml时，其对鱼类细胞具有明显毒性，不利于其实际应用。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供斜带石斑鱼piscidin1及其合成多肽在制备抗病毒或抗细菌药物中的应用。
5.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
6.本发明利用数据库中斜带石斑鱼piscidin1的基因片段设计特异性引物，从斜带石斑鱼中扩增到了编码piscidin1的基因片段，从而确定了斜带石斑鱼piscidin1的氨基酸片段。依据得到的氨基酸片段，分析其成熟肽区域，通过人工合成的方法获得了斜带石斑鱼piscidin1的成熟多肽(后称合成多肽)。结果发现人工合成的斜带石斑鱼piscidin1的成熟多肽具有抑制石斑鱼虹彩病毒和鱼类神经坏死病毒复制的活性，同时还具有抑制溶和创伤弧菌生长的活性，因此，本发明申请保护以下应用：
7.本发明申请保护斜带石斑鱼piscidin1在制备抗鱼类病毒或抗细菌的药物中的应
用，所述斜带石斑鱼piscidin1的氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.本发明还申请保护编码斜带石斑鱼piscidin1的基因在制备抗鱼类病毒或抗细菌的药物中的应用，所述编码斜带石斑鱼piscidin1的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明还申请保护斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽在制备抗鱼类病毒或抗细菌的药物中的应用，所述合成多肽具有seq id no.3所示的氨基酸序列。
10.优选地，所述鱼类病毒为石斑鱼虹彩病毒和/或鱼类神经坏死病毒，见实施例2。
11.更优选地，所述鱼类神经坏死病毒为赤点石斑鱼神经坏死病病毒，见实施例2。
12.优选地，所述细菌为溶壁微球菌和/或创伤弧菌，见实施例3。
13.本发明还申请保护一种抗鱼类病毒和/或抗细菌的药物，其含有氨基酸序列如seq id no.1所示的斜带石斑鱼piscidin1或氨基酸序列如seq id no.3所示的斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽。
14.优选地，所述鱼类病毒为石斑鱼虹彩病毒和/或鱼类神经坏死病毒，见实施例2。
15.优选地，所述细菌为溶藻弧菌和创伤弧菌，见实施例3。
16.优选地，所述药物中斜带石斑鱼piscidin1或斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽的浓度为50～3200μg/ml，见实施例2和3。
17.本发明具有以下有益效果：
18.本发明所述斜带石斑鱼piscidin1的成熟多肽具有抗病毒及抗细菌活性，人工合成的斜带石斑鱼piscidin1的成熟多肽不仅可以抑制鱼类dna和rna病毒的复制，同时还能抑制鱼类病原细菌的生长，且在高浓度下，依然具有较低的细胞毒性，适用于制备抗鱼类病毒或抗细菌的药物。对斜带石斑鱼piscidin1的进一步研究也有助于抗病功能基因制品的开发，具有重要的科学价值和应用价值。
附图说明
19.图1为斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽的质谱检测图。
20.图2为斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽的hplc高效液相色谱纯化图。
21.图3为斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽对gs细胞的毒性实验结果。
22.图4为斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽对sgiv病毒复制的影响结果。
23.图5为斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽对rgnnv病毒复制的影响结果。
24.图6为斜带石斑鱼piscidin1和4的合成多肽对溶藻弧菌的抑制率。
25.图7为斜带石斑鱼piscidin1和4的合成多肽对创伤弧菌的抑制率。
具体实施方式
26.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
27.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
28.实施例1斜带石斑鱼piscidin1成熟多肽的人工合成及质量检测
29.本发明利用数据库中斜带石斑鱼piscidin1的基因片段设计特异性引物，从斜带
石斑鱼中扩增到了编码piscidin1的基因片段，从而确定了斜带石斑鱼piscidin1的氨基酸片段；斜带石斑鱼piscidin1的氨基酸序列如seq id no.1所示，编码斜带石斑鱼piscidin1的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。将所得斜带石斑鱼piscidin1的氨基酸序列与其他物种的piscidin1氨基酸序列进行同源比对，确定其成熟肽区域。将成熟肽的氨基酸序列送英潍捷基贸易有限公司进行人工合成，获得斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽，所述合成多肽的氨基酸序列如seq id no.3(fffhivkglfhagrmihglv)所示，并通过质谱检测合成多肽的质量。
30.斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽的质谱检测结果如图1所示，hplc高效液相色谱纯化结果如图2所示，由图可知，合成多肽的质量较好，纯度大于95％。
31.斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽用真空干燥为粉末后，分装为每管10mg的量，并用氮气作保护以防止合成多肽的氧化变性，储存于
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80℃的超低温冰箱。
32.实施例2斜带石斑鱼piscidin1对病毒复制的影响
33.1、石斑鱼脾脏细胞(gs)的培养
34.石斑鱼gs细胞株保存于液氮之中，在使用前，从液氮中取出，并将其转移到l15培养基中培养，培养的细胞生长到一定密度之后，进行传代。
35.2、斜带石斑鱼piscidin1对细胞的毒性试验
36.待gs细胞传代三到四次，细胞达到良好状态后，将消化液和培养液从冰箱中取出，常温解冻和预热；吸出培养液，缓缓加入约1.0ml的消化液；消化2～5min，期间在显微镜下观察，消化至细胞收缩变圆、部分脱落即可；加入约2ml培养液，吹打均匀，吸取10μl到细胞计数板上，在显微镜下计数，并且计算细胞的密度；按照约1
×
105个细胞/孔的细胞密度接种于24孔板中。16～24h后，吸出培养基，将600μl浓度分别为50，100，200，400，800，1600和3200μg/ml的斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽的培养基加入孔中，96h后通过mts法验证合成斜带石斑鱼piscidin1对细胞的毒性。结果如图3所示，由图可知，当斜带石斑鱼piscidin1的浓度小于800μg/ml时对细胞没有毒性，在浓度1600μg/ml及3200μg/ml时，尽管有细胞毒性，但细胞存活率依然保持在40％～75％，表现出较低的细胞毒性。
37.3、斜带石斑鱼piscidin1对病毒复制的影响
38.将gs细胞转至24孔板，每孔接种约1
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105个细胞，培养16～24h，使细胞长满单层。在病毒感染前，于28℃条件下，用斜带石斑鱼piscidin1合成多肽浓度为50μg/ml的不含血清的细胞培养基l15预处理细胞1h，然后分别感染病毒sgiv和rgnnv，同时在24孔板的细胞中加入500μl含10％fbs的培养基至终体积为600μl。对照组加相同体积的无菌水，其他操作与实验组一致。在感染24h后，取感染后的细胞培养物，每个实验组和对照组分别收取三个重复孔，提取总rna，并分别检测病毒sgiv中orf072基因，以及rgnnv中cp基因的表达情况。斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽对sgiv病毒复制的影响结果如图4所示，斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽对rgnnv病毒复制的影响结果如图5所示，由图可知，斜带石斑鱼piscidin1的合成多肽可显著抑制病毒sgiv和rgnnv的复制(p＜0.05)。
39.实施例3斜带石斑鱼piscidin1对细菌生长的影响
40.本发明分别用piscidin1和piscidin4对石斑鱼的重要病原菌，即溶藻弧菌和创伤弧菌进行细菌生长抑制实验。将溶藻弧菌和创伤弧菌分别接种在用海水配制的lb液体培养基中，于28℃条件下培养16～24小时后，3000
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g离心3分钟以收集细菌沉淀；细菌沉淀用
pbs稀释至浓度为105cells/ml；用无菌水溶解合成的石斑鱼piscidin1和piscidin4，使母液浓度为10mg/ml，用无菌水稀释至浓度分别为25、50、100、200、400、800、1600和3200μg/ml；每180μl石斑鱼piscidin1和piscidin4溶液中加20μl菌液，对照组在180μl无菌水中加20μl菌液，在室温条件下静置1小时；每组混合液分别涂布4个lb平板，每平板50μl的混合液；lb平板于37℃条件下培养16小时，计算每个lb平板上的菌落数目，计算细菌的存活率并绘图。
41.存活率＝实验组的菌落数目/对照组的菌落数目
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100％((n＝4)
42.抑菌效率＝1—存活率
43.斜带石斑鱼piscidin1和4的合成多肽对溶藻弧菌的抑制率如图6所示，对创伤弧菌的抑制率如图7所示。由图6和图7可知，斜带石斑鱼piscidin1和4合成多肽对溶藻弧菌和创伤弧菌的抑制率均随着多肽浓度的升高而升高。其中，piscidin1和4合成多肽对溶藻弧菌的抑制效果差别不大，但是piscidin1合成多肽对创伤弧菌的抑制效果要比piscidin4强。
44.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。