一种高稳定性溶瘤肽荧光探针及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药和疾病治疗技术领域，具体涉及一种高稳定性溶瘤肽荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.2020年，全球约有1930万新发癌症病例并且有近1000万癌症患者因治疗无效而死亡。在肿瘤的治疗选择中，化疗仍然是常规且重要的系统性治疗方式，但受其不良反应和耐药性的限制，迫切需要寻找一种新的有效且毒副作用小的抗癌药物。
4.溶瘤肽是一类源自天然抗微生物肽(amp)或受天然抗微生物肽启发得到的抗肿瘤药物，其展现出较高的抗肿瘤活性而对正常细胞毒性较小。重要的是，无论肿瘤细胞的遗传特征和表观遗传特征如何，溶瘤肽都能介导抗癌作用，这在很大程度上是由其独特的理化特性决定的，具体来说，溶瘤肽表面的净正电荷和疏水残基的特定分布对于溶瘤肽活性至关重要。溶瘤肽因为静电相互作用与肿瘤细胞细胞膜相结合，疏水残基插入细胞膜中破坏脂质双层，促进膜的裂解，最终导致肿瘤细胞死亡。
5.由天然抗微生物肽牛乳铁蛋白改造得到的阳离子溶瘤肽ltx
‑
315，对悬浮肿瘤细胞具有很高的抗肿瘤活性(4小时ic
50
仅为8.3
±
1.2μm)，为一种有广阔前景的阳离子溶瘤肽。ltx
‑
315破坏肿瘤细胞胞膜和线粒体膜，细胞膜破碎后细胞内容物流出，释放与危险相关的分子模式分子(danger
‑
associated molecular pattern molecules)，此类分子会引发强烈的免疫反应，这体现了ltx
‑
315杀灭肿瘤细胞和诱导保护性免疫反应的能力。 ltx
‑
315的治疗能降低免疫抑制细胞的数量，增加效应t细胞的丰度，最终达到重塑肿瘤微环境的作用。
6.发明人发现，尽管ltx
‑
315对悬浮肿瘤细胞有着较强的活性，但前人合成的此肽对贴壁肿瘤细胞活性很差，24小时ic
50
约为150μm，且其抗癌的具体机制一直不明确，这一直限制着其应用。


技术实现要素：

7.基于上述现有技术的不足，本发明提供一种高稳定性溶瘤肽荧光探针及其制备方法和应用。本发明合成一系列新型溶瘤肽荧光探针，其通过与ltx
‑
315和罗丹明b不同的连接基团连接而成并经实验验证，本发明制备得到的新型溶瘤肽荧光探针不仅可以发射红色荧光，而且极大增加了溶瘤肽对贴壁肿瘤细胞的抑制活性，量效曲线表明，改造后的多肽，其抗肿瘤活性显著提高，抗肿瘤活性约为ltx
‑
315的10倍。同时，时效曲线表明，对溶瘤肽的结构改造极大地增加了溶瘤肽的稳定性，延长了作用时间，解决了 ltx
‑
315在贴壁细胞上活性不高、不能示踪等不足。因此，本发明的高稳定性溶瘤肽荧光探针具有良好的实际应用
之价值。
8.为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
9.本发明的第一个方面，提供一种高稳定性溶瘤肽荧光探针，所述溶瘤肽荧光探针包含如下氨基酸残基序列：
10.wkw
‑
212罗丹明b
‑5‑
氨基
‑3‑
氧戊酸
‑
kkwwkkw(dip)k
‑
nh211.wkw
‑
217罗丹明b
‑
gaba
‑
kkwwkkw(dip)k
‑
nh212.wkw
‑
223罗丹明b
‑
11
‑
氨基
‑
3,6,9
‑
三氧杂十一酸
‑
kkwwkkw(dip)k
‑
nh213.wkw
‑
385罗丹明b
‑
aeea
‑
kkwwkkw(dip)k
‑
nh214.上述溶瘤肽荧光探针可以发射红色荧光，实现了溶瘤肽的时空定位和示踪。同时大幅提高溶瘤肽的抗肿瘤活性和稳定性，特别是对贴壁肿瘤细胞的杀伤活性有显著提高。
15.本发明的第二个方面，提供编码所述溶瘤肽荧光探针的核苷酸，其包含下组中的任一种：
16.(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽的核苷酸；
17.(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸。
18.本发明的第三个方面，提供上述溶瘤肽荧光探针的合成方法，所述合成方法包括采用固相多肽合成法合成多肽，以及，将多肽与连接基团、荧光基团进行缩合反应连接即得。
19.具体的，基于9
‑
芴甲氧羰基的固相多肽合成法(fmoc
‑
spps)合成上述多肽。
20.本发明的第四个方面，提供上述溶瘤肽荧光探针在制备预防和/或治疗(辅助治疗)肿瘤相关疾病的药物中的应用。
21.同时，需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。
22.本发明的第五个方面，提供一种组合物，其包含上述高稳定性溶瘤肽荧光探针。
23.本发明的第六个方面，提供一种制剂，其包含高稳定性溶瘤肽荧光探针和药学上可接受的辅料和/或载体。
24.本发明的第七个方面，提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括：其包括向受试者施用治疗有效剂量的上述高稳定性溶瘤肽荧光探针、上述组合物或上述制剂。
25.本发明的第八个方面，提供上述高稳定性溶瘤肽荧光探针作为非治疗目的的肿瘤细胞抑制剂和/或示踪剂的用途。根据本发明，所述“非治疗目的”例如在体外抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞死亡，特别地，上述高稳定性溶瘤肽荧光探针对贴壁肿瘤细胞杀伤活性更高；同时，本发明的高稳定性溶瘤肽荧光探针，可以发射红色荧光，从而实现溶瘤肽的时空定位和示踪，红色荧光波长较长，穿透力较强，从而应用于细胞、组织和活体动物成像，因此可以作为示踪剂使用，从而探索溶瘤肽的在分子、细胞、组织、动物水平的抗肿瘤活性和作用机制。
26.上述技术方案的有益技术效果如下：
27.1)上述技术方案中通过使溶瘤肽发射红色荧光，实现溶瘤肽的时空定位和示踪。红色荧光波长较长，穿透力较强，可以广泛应用于细胞成像、活体动物成像等，该类荧光探
针是研究溶瘤肽在细胞和动物水平作用机制及定位的重要工具。
28.2)上述技术方案可大幅提高溶瘤肽的抗肿瘤活性。本发明合成的溶瘤肽荧光探针，极大提高了溶瘤肽对贴壁肿瘤细胞的杀伤活性。其中，各肽的ic
50
(24小时)分别为 14.7
±
2.7μm(wkw
‑
212)，15.2
±
0.9μm(wkw
‑
217)，14.3
±
1.4μm(wkw
‑
223)和13.8
±
0.3 μm(wkw
‑
385)，而传统经典溶瘤肽ltx
‑
315的ic
50
高达152
±
5.9μm，本实验说明溶瘤肽荧光探针对贴壁肿瘤细胞的杀伤活性提升了约10倍以上。
29.3)上述技术方案可大幅提高溶瘤肽的稳定性。前人开发的ltx
‑
315等溶瘤肽，结构相对简单，易被体内蛋白酶降解，生物稳定性较差，半衰期较短。本项目在溶瘤肽上引入罗丹明b和聚乙二醇等基团，可以阻止蛋白酶对溶瘤肽的降解，提高溶瘤肽的酶解稳定性，具有较大的应用价值。时效曲线表明，溶瘤肽荧光探针的抗肿瘤活性可以保持72 小时以上；而ltx
‑
315等传统溶瘤肽在12小时抗肿瘤活性开始下降，48小时抗肿瘤活性几乎消失。
30.综上所述，前人开发的阳离子溶瘤肽ltx
‑
315对贴壁肿瘤细胞的杀伤活性较低，酶解稳定性较差、半衰期较短，抗肿瘤机制尚不明确。针对存在的上述问题，本发明设计合成了新型溶瘤肽荧光探针，该类探针可以发射红色荧光，针对贴壁肿瘤细胞的杀伤活性更高，具有非常高的酶解和抗肿瘤细胞稳定性。本发明涉及的荧光探针不仅可以作为工具分子探索溶瘤肽的在分子、细胞、动物水平的抗肿瘤活性和作用机制，而且可以作为潜在的抗肿瘤先导多肽进行抗肿瘤多肽药物的开发，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
31.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
32.图1为本发明固相多肽合成方法示意图。
33.图2为本发明实施例1中wkw
‑
212的结构式、一级氨基酸序列，分析型反相高效液相色谱图和esi
‑
ms质谱图。
34.图3为本发明实施例1中wkw
‑
217的结构式、一级氨基酸序列，分析型反相高效液相色谱图和esi
‑
ms质谱图。
35.图4为本发明实施例1中wkw
‑
223的结构式、一级氨基酸序列，分析型反相高效液相色谱图和esi
‑
ms质谱图。
36.图5为本发明实施例1中wkw
‑
385的结构式、一级氨基酸序列，分析型反相高效液相色谱图和esi
‑
ms质谱图。
37.图6为本发明实施例1中溶瘤肽荧光探针wkw
‑
385激发和发射波谱图。
38.图7为本发明实施例1中溶瘤肽荧光探针wkw
‑
385的摩尔浓度和荧光强度关系图。
39.图8为本发明实施例1中溶瘤肽探针wkw
‑
385在hepg2贴壁肝癌细胞中的分布图。
40.图9为本发明实施例1中溶瘤肽探针wkw
‑
385在荷瘤小鼠中的分布图。
41.图10为本发明实施例1中溶瘤肽荧光探针对hepg2贴壁肝癌细胞增殖的抑制作用图。
42.图11为本发明实施例1中溶瘤肽荧光探针wkw
‑
385导致贴壁肿瘤细胞形态学发生改变图。
43.图12为本发明实施例1中溶瘤肽荧光探针对贴壁肿瘤细胞抑制作用的时效曲线
图。
具体实施方式
44.应该指出，以下详细说明均为示例性，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
45.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
46.术语解释：
47.肽：由氨基酸的氨基(
‑
nh2)和羧基(
‑
cooh)脱水缩合形成肽键后形成的分子，其中由10～100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。多肽类药物具有活性更高、稳定性更强、毒副作用较小、给药量较少等优点，对于肿瘤、自身免疫性病症、高血压与某些心血管、代谢性病症具备明显的治疗收益，具备广阔的开发应用前景。
48.溶瘤肽：溶瘤肽是一类源自天然抗微生物肽(amp)或受天然抗微生物肽启发得到的抗肿瘤药物，其展现出较高的抗肿瘤活性而对正常细胞毒性较小。重要的是，无论肿瘤细胞的表型或遗传特征如何，溶瘤肽都能发挥抗癌作用，这在很大程度上是由其独特的理化特性决定的，具体来说，溶瘤肽表面的净正电荷和疏水残基的特定分布对于溶瘤肽活性至关重要。溶瘤肽因为静电相互作用与肿瘤细胞胞膜相结合，疏水残基插入细胞膜中破坏脂质双层，促进膜的裂解，最终导致肿瘤细胞死亡。
49.多肽荧光探针：受到激发光激发后，在紫外
‑
可见
‑
近红外区有特征发光，称之为荧光。多肽荧光探针是多肽与荧光基团以共价键形式结合在一起，形成的能发射荧光的一类分子。
50.罗丹明b：是一种较典型的三苯甲烷类人工合成染料，总体电荷为正电荷，分子量为479.029。其具有鲜桃红色，水溶液为蓝红色，稀释后有强烈荧光，为一类常用的荧光基团。
51.ic
50
：药物达到最大抑制效应一半时所需要的浓度。数值越小，抑制活性越强。
52.以下几种模型解释了溶瘤肽破膜杀伤肿瘤细胞的机制。
53.桶壁模型。单体溶瘤肽在细胞上的积累，随后发生构象变化和聚集，形成桶状多聚体。在这个模型中，聚集迫使多肽进入细胞膜的疏水中心，然后溶瘤肽的疏水链与膜的酰基链接触，与双层的脂质核心对齐，削弱了细胞膜。而肽的亲水部分则形成水孔，水孔随着聚集肽数量增加而变宽。
54.地毯模型。此模型描述了带正电的α螺旋与膜外层带负电荷的磷脂相互作用，膜被肽覆盖形成一层肽的“地毯”。溶瘤肽保持平行于细胞表面而不插入脂质双层，但是随着肽的浓度增加，磷脂自行旋转并重新定向，这个过程增加了膜的流动性，因此削弱了膜的阻隔性能，破坏脂质双层并形成胶束。
55.环孔模型。这是一个两阶段的模型，肽在低浓度下是不活跃的，其分布平行于双层，而它们在高浓度下转化为活性形式并垂直于双分子层，不可逆地破坏膜。新形成环形孔
的不稳定性允许肽进入膜内，肽进入细胞内空间并抑制多种生命进程，如dna复制以及蛋白质合成，导致肿瘤细胞死亡。
56.如前所述，由天然抗微生物肽牛乳铁蛋白改造得到的阳离子溶瘤肽ltx
‑
315，对悬浮肿瘤细胞具有很高的抗肿瘤活性，但对贴壁肿瘤细胞活性很差，且其抗癌的具体机制一直不明确，从而限制其应用。
57.有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种高稳定性溶瘤肽荧光探针，所述溶瘤肽荧光探针包含如下氨基酸残基序列：
58.wkw
‑
212罗丹明b
‑5‑
氨基
‑3‑
氧戊酸
‑
kkwwkkw(dip)k
‑
nh259.wkw
‑
217罗丹明b
‑
gaba
‑
kkwwkkw(dip)k
‑
nh260.wkw
‑
223罗丹明b
‑
11
‑
氨基
‑
3,6,9
‑
三氧杂十一酸
‑
kkwwkkw(dip)k
‑
nh261.wkw
‑
385罗丹明b
‑
aeea
‑
kkwwkkw(dip)k
‑
nh262.上述溶瘤肽荧光探针可以发射红色荧光，实现溶瘤肽的时空定位和示踪；同时大幅提高溶瘤肽的抗肿瘤活性和稳定性，尤其是对贴壁肿瘤细胞的杀伤活性具有显著提高。
63.本发明的又一具体实施方式中，提供编码所述高稳定性溶瘤肽荧光探针的核苷酸，其包含下组中的任一种：
64.(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽的核苷酸；
65.(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸。
66.本发明的又一具体实施方式中，提供上述溶瘤肽荧光探针的合成方法，所述合成方法包括：采用固相多肽合成法合成多肽；以及，将所述多肽与连接基团、荧光基团进行缩合反应连接。
67.具体的，基于9
‑
芴甲氧羰基的固相多肽合成法(fmoc
‑
spps)合成上述多肽。
68.如无特殊说明，本发明使用rinkamideam树脂(取代度为0.32mmol/g)合成氮末端为酰胺的目标多肽，使用的氨基酸均为fmoc
‑
l
‑
型氨基酸。
69.更具体的，所述溶瘤肽荧光探针的合成方法包括：
70.s1、基于9
‑
芴甲氧羰基的固相多肽合成法合成多肽；
71.s2、将步骤s1制得的多肽与连接基团、荧光基团进行缩合反应；
72.s3、向步骤s2制得的缩合产物中加入切肽试剂进行切肽处理，经分离纯化后即得所述溶瘤肽荧光探针。
73.其中，所述步骤s1具体方法包括：
74.将rinkamideam树脂进行预活化和活化处理，然后使用含有哌啶的dmf溶液脱除fmoc保护基进行脱保护；对氨基酸进行缩合至所有氨基酸的缩合完成以后，脱去最后一个氨基酸的fmoc保护基，然后进行清洗。
75.本发明的又一具体实施方式中，所述预活化处理方法为：将树脂使用dmf和dcm交替清洗，室温浸泡1
‑
2小时；
76.所述活化处理方法为：将经预处理后的树脂浸入dmf/dcm混合溶液(1:1，体积比，v:v)中，在25～30℃(优选28℃)条件下振荡活化处理0.5
‑
2小时(优选1小时)。
77.脱保护具体方法包括：在25～30℃(优选28℃)条件下，在含有20％哌啶(v:v)的dmf溶液中脱除fmoc保护基，脱保护操作两次，时间分别为5分钟和10分钟。
78.缩合反应具体方法包括：在25～30℃(优选28℃)条件下，每个氨基酸缩合反应进
行两次，时间分别为20分钟和30分钟。反应物氨基酸的配比为fmoc
‑
l
‑
型氨基酸： hctu：dipea＝3倍当量：2.8倍当量：6倍当量。
79.清洗步骤包括：用dmf和dcm交替清洗，最后用dcm将树脂清洗干净，并彻底去除(如采用水泵、油泵抽干的方式)树脂中残留的溶剂。
80.所述步骤s2具体方法包括：
81.将步骤s1制得的多肽与荧光基团进行缩合反应，反应物配比为罗丹明b：hatu： hoat：dipea＝6倍当量：2.8倍当量：3倍当量：6倍当量。在25～30℃(优选28℃) 下，固相缩合三次，反应时间分别为30分钟、40分钟和50分钟。在荧光基团连接过程中，罗丹明b必须过量(树脂的6倍当量)。加入dipea试剂后，两分钟内必须将缩合溶液加入合成管中。
82.所述步骤s3中，切肽处理具体方法包括：
83.往合成管中加入含有tfa的切肽试剂(tfa：tips：水：苯酚＝88:2:5:5(v:v:v:v)) 切割多肽，反应时间为2.5
‑
3小时，反应温度为25～30℃(优选28℃)。反应结束后对反应产物进行浓缩，然后将提前冰浴的无水乙醚(提前预冷至4
‑
10℃)加入到浓缩的反应溶液中，沉淀出目标多肽；随后通过离心得到粗肽的白色沉淀。再用冰浴的无水乙醚反复清洗、离心两次，得到的固体沉淀进行通风干燥，挥发有机溶剂后得到粉末状的粗肽。
84.分离纯化具体方法包括：
85.用含有0.1％tfa的乙腈和水混合溶剂溶解上述粗肽，将其进行冷冻干燥，得到絮状的粗肽固体。再次用含有0.1％tfa的乙腈和水混合溶剂溶解粗肽固体，将此粗肽溶液通过半制备型反相高效液相色谱(rp
‑
hplc)分离纯化，得到纯的目标多肽溶液，然后将此多肽溶液再进行冷冻干燥后得到纯的固体目标多肽。
86.可利用分析型反相高效液相色谱和esi
‑
ms等对目标多肽进行分析鉴定。固体目标多肽放置在
‑
20℃冰箱内密封保存，备用。
87.本发明的又一具体实施方式中，提供上述溶瘤肽荧光探针在在制备预防和/或治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。
88.同时，需要说明的是，“肿瘤”或“癌症”可互换使用，这些术语意指存在这样的细胞，所述细胞具有致癌细胞的典型特点，如不受控制的增殖、永生化、转移潜能、快速生长和增殖速率，以及某些特有形态学特征。癌细胞通常呈肿瘤形式，但是这类细胞可单独存在于动物体内，或可以是非致瘤性癌细胞，如白血病细胞。这些术语包括实体肿瘤、软组织肿瘤或转移病灶。如本发明所使用的，术语“肿瘤”包括恶化前肿瘤以及恶性肿瘤。在某些实施例中，肿瘤是实体肿瘤、软组织肿瘤或转移病灶。所述术语还指代针对形成实体肿瘤、血液、骨髓或淋巴系统癌症的细胞类型命名的实体肿瘤。实体肿瘤的实例包括但不限于肉瘤和癌瘤。血液癌症的实例包括但不限于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。这些术语包括但不限于起源于身体中具体部位的原发性癌症、从其开始的位置扩散至身体其它区部的转移性癌症、缓解后原始的原发性癌症的复发，和第二种原发性癌症，所述第二种原发性癌症是具有与后者不同类型的既往癌症病史的人员的新原发性癌症。
89.本发明的又一具体实施方式中，所述癌症选自以下良性或恶性肿瘤组成的组：肺(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、支气管、前列腺、乳腺(包括散发性乳腺癌和考登病患者)、胰腺、胆囊、胃肠道、结肠、直肠、结肠癌、结直肠癌、甲状腺、肝、胆道、肝内胆管、肝细胞、肾上腺、胃、胃部、中枢或周围神经系统(包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、成胶
质细胞瘤和神经鞘瘤)、神经内分泌、子宫内膜、肾、肾盂、膀胱、子宫、宫颈、阴道、卵巢、多发性骨髓瘤、食管、鼻、颈或头、脑、口腔和咽、喉、小肠、黑素瘤、结肠绒毛腺瘤、肉瘤(包括骨肉瘤、纤维肉瘤或横纹肌肉瘤和卡波济氏肉瘤)、瘤形成、上皮特征性肿瘤、乳腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、光化性角化病、红细胞增多、原发性血小板增多症、甲状腺滤泡状癌、白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、骨髓性白血病、脑膜白血病和早幼粒细胞白血病)、淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯奇氏淋巴瘤)、骨髓增生异常综合征、绒毛膜癌、横纹样癌、精原细胞瘤、畸胎癌、着色性干皮病；视网膜母细胞瘤、角化棘皮瘤、髓样化生性骨髓纤维化、瓦尔登斯特伦氏病和barret腺癌。
90.本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物组合物，其包含上述溶瘤肽荧光探针。
91.本发明化合物的药物组合物，可以以选自以下任意方式施与：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、阴道给药、局部给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选口服、肌注、腹膜内或静脉内用药方式。
92.本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物制剂，其包含溶瘤肽荧光探针和药学上可接受的载体。
93.上述药物制剂可以是药剂学上可以接受的任何药物剂型，如片剂(包括分散片、缓释片、肠溶片、泡腾片、口腔崩解片、咀嚼片、异型片等)、硬胶囊剂(包括胃溶、肠溶、缓释胶囊)、软胶囊剂(包括胃溶、肠溶软胶囊)、滴丸剂、微丸剂、颗粒剂、干混悬剂、散剂、口服液体剂(包括溶液、混悬液、乳液剂)、注射剂(包括注射用粉针剂和注射液) 等，以上这些药物剂型在《中国药典》中都有记载和描述。
94.根据药物剂型的不同，视需要还可以选择性地含有其它适宜的药用载体，诸如稀释剂、填充剂、崩解剂、表面活性剂、助悬剂、粘合剂、润滑剂、着色剂、调味剂等。所述“选择性地含有”是指可以选其中一种或几种，也可以不选。
95.所用的适宜填充剂或稀释剂包括乳糖、甘露醇、山梨醇、微晶纤维素、淀粉、改性淀粉、糊精、环糊精及其衍生物、磷酸钙、蔗糖、聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、预胶化淀粉、木糖醇、果糖、麦芽糖醇、右旋糖酐、葡萄糖、硫酸钙、磷酸氢钙，等等；所述崩解剂包括羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉、玉米淀粉、交联羧甲基淀粉钠、微晶纤维素、羧甲基纤维素钙，等等；所述表面活性剂包括十二烷基硫酸钠、十四烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠、聚山梨酯(通用名：吐温，包括其各种型号)、脂肪酸山梨坦(通用名：司盘，包括其各种型号)，等等；所述粘合剂包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉浆、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、明胶、瓜耳胶、黄原胶，等等；所述助悬剂包括但不限于羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、阿拉伯胶、黄原胶、羧甲基纤维素钠，等等；所述润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、硬脂基富马酸钠，等等。另外，还可包括ph值调节剂或缓冲剂，例如磷酸盐缓冲液、柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸盐缓冲液、稀盐酸、碳酸钠、氢氧化钠，等等；还可包括防腐剂，例如苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯，等等；还可包括稳定剂和抗氧剂，例如依地酸钙钠、亚硫酸钠、维生素c、维生素e，等等；还可包括
(v:v:v:v))切割多肽，反应时间为2.5
‑
3小时，反应温度为28℃。保留切肽溶液并转移到三颈瓶中，使用高纯氮鼓泡浓缩切肽溶液至2毫升。然后将提前冰浴的无水乙醚(提前预冷至4
‑
10℃)加入到浓缩的反应溶液中，沉淀出目标多肽。随后通过离心机离心得到粗肽的白色沉淀。再用冰浴的无水乙醚反复清洗、离心两次，得到的固体沉淀在通风橱内静置1小时，挥发有机溶剂，得到粉末状的粗肽。
107.分离纯化：用含有0.1％tfa的乙腈和水混合溶剂溶解粗肽，将其放在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到絮状的粗肽固体。再次用含有0.1％tfa的乙腈和水混合溶剂溶解粗肽固体，将此粗肽溶液通过半制备型反相高效液相色谱(rp
‑
hplc)分离纯化，得到纯的目标多肽溶液，然后将此多肽溶液放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥后得到纯的固体目标多肽。
108.利用分析型反相高效液相色谱和esi
‑
ms等对目标多肽进行分析鉴定。本发明制备得到的4种溶瘤肽荧光探针的结构式、一级氨基酸序列，分析型反相高效液相色谱图和 esi
‑
ms质谱图如图2
‑
5所示。固体目标多肽放置在
‑
20℃冰箱内密封保存，备用。
109.溶瘤肽荧光探针波长扫描实验
110.打开flexstation仪器主机并预热，用三蒸水配置浓度为300μm的wkw
‑
385溶液后，每孔200μl加入到黑色96孔板中。96孔板放入flexstation中读数，先进行发射波长的扫描，设置激发波长为550纳米，扫描发射波长范围560～650纳米，扫描间隔为1纳米。再进行激发波长的扫描，设置发射波长为600纳米，扫描激发波长范围500～580，扫描间隔为1纳米。
111.结果如图6所示，溶瘤肽荧光探针wkw
‑
385的最大激发波长为560纳米，最大发射波长为590纳米。
112.溶瘤肽荧光探针荧光强度与浓度关系实验
113.打开flexstation主机并预热，用三蒸水梯度配置浓度为50μm、75μm、100μm、150 μm、200μm、300μm、400μm、500μm、700μm、800μm、900μm和1000μm的 wkw
‑
385溶液后，每孔200μl加入到黑色96孔板中并设置三个复孔。96孔板放入 flexstation中读数，设置激发波长为560纳米，发射波长为590纳米。
114.结果如图7所示，新型溶瘤肽探针wkw
‑
385的荧光强度呈浓度依赖模式，荧光强度随浓度的增加而增大。
115.溶瘤肽荧光探针在贴壁肿瘤细胞内的分布实验
116.肝癌细胞hepg2(来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)培养在含 10％胎牛血清的mem培养基中。将状态良好的hepg2贴壁细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞后用培养基稀释，均匀接种在6孔板中(500μl/孔)。细胞培养过夜后，用培养基配置1毫升wkw
‑
385溶液(终浓度为30μm)，此溶液中还包括2μg/ml hoechst 33258(细胞核蓝色荧光探针)和1μm mito
‑
tracker green(线粒体绿色荧光探针)。加到细胞中后， 6孔板放回培养箱中孵育，30分钟时取出，弃上清，用无酚红dmem冲洗三遍，用荧光显微镜观察并拍照。
117.结果如图8所示，wkw
‑
385在细胞中发红色荧光，并且根据融合图可见，红色荧光与蓝色荧光有很好的共定位，说明wkw
‑
385主要聚集在细胞核中。上述实验说明 wkw
‑
385等荧光探针可以作为工具分子探索溶瘤肽的作用机制。
118.溶瘤肽荧光探针在小鼠中的活体成像实验
119.荧光探针活体成像实验选用荷有b16
‑
f10移植瘤的cb6f1小鼠，为其躯干退毛后，实验组在其右腋下移植瘤内注射50μl 10mg/ml的wkw
‑
385溶液(生理盐水配置)，对照组仅
注射50μl 10mg/ml的ltx
‑
315溶液(生理盐水配置)。在0小时、1小时、6小时、12小时、24小时和48小时对给药小鼠进行活体成像，成像前用水合氯醛进行麻醉。24小时成像结束后，处死小鼠，解剖取其各脏器进行脏器的荧光成像。成像条件：激发波长570纳米，发射波长620纳米。
120.结果如图9所示，右侧实验组小鼠可见明显新型溶瘤肽探针wkw
‑
385聚集区域，此探针可以长时间聚集在肿瘤区域，48小时在肿瘤组织中有明显分布，在其它脏器中没有明显分布，而左侧对照组则无荧光。
121.溶瘤肽荧光探针对贴壁肿瘤细胞增殖抑制实验
122.将状态良好的hepg2细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞后用培养基稀释，均匀接种在 96孔板中(100μl/孔)。细胞培养过夜后配制药液，用培养基将30mm的wkw
‑
212、 wkw
‑
217、wkw
‑
223、wkw
‑
385和ltx
‑
315储存液2倍梯度稀释到指定浓度(100μm、 50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm)，每个浓度重复3个孔(150μl)。将药液加入到孔内后，96孔板放回培养箱中孵育24小时。24小时后每孔加入15μl mtt工作液(5mg/ml)，反应4小时后弃上清，加入150μl dmso，静置1小时后用酶标仪在 490nm波长下读取od值。
123.如图10所示，新型溶瘤肽以浓度依赖的模式杀伤肿瘤细胞，24小时ic
50
为15μm 左右，ltx
‑
315的ic
50
为150μm左右，本实验说明荧光探针表现出较强的抗贴壁肿瘤细胞活性，抗肿瘤活性是经典溶瘤肽ltx
‑
315的十倍。
124.溶瘤肽荧光探针影响肿瘤细胞的形态学实验
125.将状态良好的肝癌贴壁细胞hepg2细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞后用培养基稀释，均匀接种在6孔板中(500μl/孔)。细胞培养过夜后，用培养基将30mm的wkw
‑
385 储存液稀释到30μm，加到细胞中后，6孔板放回培养箱中孵育，分别在0分钟、15分钟、30分钟和60分钟取出，用显微镜观察并拍照。
126.如图11所示，细胞形态学实验说明溶瘤肽荧光探针wkw
‑
385引发了贴壁肿瘤细胞形态改变，细胞萎缩、碎片化，死亡细胞数量随着时间延长逐渐增加，呈现时间依赖性特征。
127.溶瘤肽荧光探针的细胞稳定性实验
128.将状态良好的肝癌贴壁细胞hepg2用胰蛋白酶消化，收集细胞后用培养基稀释，均匀接种在96孔板中(100μl/孔)。细胞培养过夜后配制药液，用培养基将30mm的 wkw
‑
212、wkw
‑
217、wkw
‑
223、wkw
‑
385和ltx
‑
315储存液稀释到30μm，每个浓度重复3个孔(150μl)。将药液加入到孔内后，96孔板放回培养箱中孵育，分别在4 小时、12小时、24小时、36小时、48小时和72小时进行mtt实验。每孔加入15μl mtt 工作液(5mg/ml)，反应4小时后弃上清，加入150μl dmso，静置1小时后用酶标仪在490nm波长下读取od值，根据每个时间点的od值计算抑制率。
129.如图12所示，随着时间的延长，溶瘤肽荧光探针的抗肿瘤活性逐渐升高，在36小时到达峰值。溶瘤肽荧光探针在各时间点的抗肿瘤活性均远高于ltx
‑
315，并可保持活性达72小时以上。ltx
‑
315的抗肿瘤活性在12小时到达峰值，随后活性便开始下降，到48小时的时候抗肿瘤活性基本消失。以上结果说明溶瘤肽荧光探针具有更高的抗肿瘤活性和抗肿瘤稳定性。
130.最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施案例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施案例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然
可以对前述实施案例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。