肾上腺素能β2受体激动剂R-对映体在治疗炎症性肠病及其肠外疾病的新应用的制作方法

肾上腺素能
β
2受体激动剂r
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对映体在治疗炎症性肠病及其肠外疾病的新应用
发明领域
1.本发明涉及肾上腺素能β2受体激动剂的光学纯r
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对映体的新用途，用于治疗炎症性肠病(ibd)和炎症性肠病的肠外疾病。ibd的确切病因尚不清楚，但ibd是免疫系统缺陷的结果。ibd包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，其特征是胃肠道慢性炎症、持续腹泻、腹痛、直肠血性大便、体重减轻和疲劳。ibd与肠外症状相关，如肝脏问题、关节炎、皮肤症状和眼部问题。目前尚无有效的治疗ibd的药物。控制ibd症状的主要治疗药物包括抗炎症药物，如5
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氨基水杨酸钠和皮质类固醇，以及免疫抑制剂，如环孢霉素。长期使用这些药物往往会引起严重的不良反应。ibd有时需要手术治疗。因此，需要一种更有效、更安全的药物来帮助需要治疗ibd的患者，这方面的医学需求尚未得到满足。
2.本发明公开了手性肾上腺素能β2受体激动剂的r
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对映体在治疗ibd中的新用途和ibd的肠外疾病。本发明还意外发现了手性肾上腺素能β2受体激动剂的s
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对映体能够引起ibd加剧。因此，β2受体激动剂的r
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对映异构体在治疗ibd方面优于其外消旋体，同时避免了s
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对映异构体的毒性。本发明公开了用于治疗ibd的肾上腺素能β2受体激动剂的r
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对映异构体及其肠外疾病，与其外消旋性药物和其他已上市药物相比，副作用较小。根据本发明，肾上腺素能受体激动剂的r
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对映体包括短效β2激动剂(saba)、优映体r
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沙丁胺醇和长效β2激动剂(laba)、优映体r
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班布特罗和r
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克伦特罗。本发明还公开了肾上腺素能β2受体激动剂的至少一种r
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对映体与至少一种抗炎症药物如皮质类固醇和至少一种免疫抑制剂，或与用于ibd的一种抗体和一种s1p受体调节剂的组合使用。本发明公开了一种新的肾上腺素能β2受体激动剂的r
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对映体用于治疗ibd的肠外表现，包括关节炎、葡萄膜炎、鼻炎、强直性脊柱炎，白癜风，牛皮癣，淀粉样变性，湿疹，痤疮和原发性硬化性胆管炎。


背景技术：

3.炎症性肠病(ibd)是两种疾病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)的统称，以自身免疫功能障碍导致的胃肠道慢性炎症为特征。长时间的炎症导致胃肠道损伤。一些常见的症状是：持续腹泻，腹痛，直肠出血，便血，体重减轻和疲劳(baumgart dc,&carding sr inflammatory bowel disease:cause and immunobiology.lancet.369(9573):1627,may2007)。相关的疾病包括关节炎、坏疽性脓皮病、原发性硬化性胆管炎和非甲状腺疾病综合征(ntis)(liu s,et al.,"nonthyroidal illness syndrome:is it far away from crohn's disease？.journal of clinical gastroenterology.47(2):153
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9.february 2013)。其次，克罗恩病和溃疡性结肠炎表现为不同程度的肠外表现(如肝脏疾病、关节炎、皮肤症状和眼部症状)(extraintestinal manifestations of inflammatory bowel disease,levine js et.al gastroenterology&hepatology vol.&,issue 4,235,april 2011)。
4.每年ibd的总患病率为396/100000。2013年，全球共有5.1万人死于ibd。自二战以来，ibd发病率的增加与全世界肉类消费的增加有关，这支持了动物蛋白摄入与ibd相关的
说法。在欧洲，炎症性肠病正在增加。ibd的确切病因尚不清楚，但ibd是免疫系统缺陷的结果。正常运作的免疫系统攻击外来生物，如病毒和细菌，以保护身体。在ibd中，免疫系统对导致胃肠道炎症的环境反应不正确。这似乎也有遗传因素。
5.治疗ibd的药物有几种：5
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氨基水杨酸、皮质类固醇(如泼尼松)、免疫调节剂和最新批准用于ibd的药物(生物制品)。同时也有几种推荐使用的疫苗用于预防ibd患者的感染。严重的ibd患者可能需要手术切除胃肠道的受损部分，但是药物治疗的进步意味着手术已经不像几十年前那么常见了。由于克罗恩病和溃疡性结肠炎影响到胃肠道的不同部位，因此这两种情况的手术方法是不同的。
6.类固醇，如糖皮质激素强的松，经常被用于控制疾病发作，并且曾经是一种可接受的维持药物。炎症性肠病的生物治疗，尤其是tnf抑制剂，被用于更严重或产生耐药的克罗恩病患者，有时用于溃疡性结肠炎。
7.尽管最近在治疗方面取得了新的进展，但仍然需要一种安全、耐受性好、起效快、增强长期缓解能力的治疗方法。此外，长期使用类固醇等药物会引起严重的副作用。因此，迫切需要更好的药物治疗ibd，以提高疗效，减少不良反应，降低成本。


技术实现要素：

8.ibd动物模型是研究ibd发病机制的重要研究工具，为研究ibd的各种因素和评价不同的治疗方案提供了广泛的选择。即使没有一个模型能代表溃疡性结肠炎的所有方面和阶段，也就是说，溃疡性结肠炎主要局限于结肠粘膜，或者克罗恩病通过跨壁炎症影响整个胃肠道(r.b.sartor and m.muehlbauer,“microbial host interactions in ibd:implications for pathogenesis and therapy,”current gastroenterology reports,vol.9(6),pp.497,2007)。
9.葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的结肠炎模型是目前公认且应用广泛的炎症性肠病模型。与其他动物结肠炎模型相比，dss诱发结肠炎模型具有一定的优势。例如，通过改变dss的给药浓度，可以很容易地建立急性、慢性或复发模型。此外，在临床人类肠炎中经常出现的异常增殖在dss诱导的慢性期肠炎中也经常可见。近年来，人们对dss诱导的结肠炎相关癌变模型进行了综述。此外，通过使用不同的ibd治疗药物验证dss模型的研究表明，dss诱导的小鼠结肠炎模型可以转化为人类疾病的相关模型(perse m&cerar a,dextran sodium sulphate colitis mouse model:traps and tricks.j of biomedicine and biotechnology,vol.2012,id 18617,mar.2012)。本发明采用dss小鼠模型。在现有技术中，r
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沙丁胺醇已被证明对治疗哮喘有效。它也是治疗盘状红斑狼疮等皮肤病的主要药物。r
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沙丁胺醇用于局部治疗盘状红斑狼疮的随机对照试验(br.j.demortol.161(16):1365,dec.2009)，促进皮肤慢性伤口愈合。然而，ibd是一种完全不同于哮喘和盘状狼疮(结缔组织病)或受损的皮肤慢性伤口愈合的疾病。上述临床表现和结肠炎的组织学特征在r
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沙丁胺醇治疗后均有明显改善。dai明显改善，体重增加，腹泻减少，粪便隐血减少。在病理和组织学检查中，r
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沙丁胺醇治疗后结直肠缩短率降低。粘膜畸变或糜烂减少。粘膜及粘膜下层炎症反应明显减轻。出现了大量新生长的隐窝。结肠粘膜上皮内层明显恢复。固有层完整，未见明显的炎性浸润。与dss诱导的结肠炎小鼠相比，r
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沙丁胺醇治疗的结肠炎小鼠组织学评分明显降低。本发明公开了r
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沙丁胺醇可用于预防和治疗ibd。这种报道是新颖的，也不
是业内人士可以预测和推知的。ibd通常不能通过皮肤局部治疗。ibd是一种慢性疾病，其发病机制和可以用r
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沙丁胺醇或其他β2激动剂治疗的疾病的临床表现不同，r
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沙丁胺醇或其他类似的β2激动剂是否用于ibd的治疗从未得到报道。
10.本发明公开了r
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沙丁胺醇可用于预防或治疗ibd。在一个实施方案中，将dss加入饮用水中，诱导小鼠ibd7天。在数天后结肠炎的临床表现，包括体重减轻、腹泻、粪便隐血(fob)在内的疾病活动指数增加(cooper,s.et al.,clinic pathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis,laboratory investigation,vol.69,no.2,p.238
–
249,1993)。
11.在第10天对小鼠进行解剖和组织学鉴定。结直肠长度缩短。急性结肠炎的组织学表现为粘液减少、上皮细胞变性、坏死导致上皮细胞消失。伴随着中性粒细胞的浸润和固有层和粘膜下层的破坏，隐匿性炎症(中性粒细胞向粘膜上皮的跨上皮迁移)，以及粘膜和粘膜下层的蜂窝织炎。粘膜及粘膜下层均有糜烂、蜂窝炎性改变，隐窝消失。将上述每一个组织学特征单独评分，并相加，共同表示为“组织学评分”，进行定量评价(cooper,s.et al.,above)。
12.上述临床表现和结肠炎的组织学特征在r
‑
沙丁胺醇治疗后均有明显改善。dai明显改善。体重增加，腹泻和fob明显减少。在病理和组织学检查中，r
‑
沙丁胺醇治疗后结直肠缩短率降低。粘膜异常或糜烂减少。粘膜及粘膜下层炎症反应明显减轻。随着结肠粘膜上皮内层的明显恢复，出现了大量的新生隐窝。固有层完整，未见明显的炎性浸润。与dss诱导的结肠炎小鼠相比，r
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沙丁胺醇诱导的结肠炎小鼠组织学评分明显降低。本发明公开了r
‑
沙丁胺醇可用于预防和治疗ibd。这种报道是新颖的。
13.在其他实施例中，本发明提供了包括r
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特布他林在内的其他短效β2激动剂的r
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对映异构体和包括r
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班布特罗和r
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克伦特罗在内的长效β2激动剂在预防和治疗dss诱发的ibd方面的类似作用。本发明公开了一种肾上腺素能β2激动剂的r对映体或r对映体在防治ibd中的新用途。本发明的公开是新颖的。
14.皮质类固醇是治疗ibd的常用药物。在一个实施方案中，本发明提供的r对映体肾上腺素能激动剂在改善ibd方面比地塞米松有更好的效果。
15.目前市面上大部分手性肾上腺素能β2激动剂都是以r和s对映体的混合物的外消旋形式销售的。众所周知，一个对映体有时可能是惰性的，不具有与另一个相同的生物活性。然而，在目前文献中，s
‑
对映体对ibd的毒性作用还没有报道。在一个实施例中，s
‑
沙丁胺醇代替r
‑
沙丁胺醇，以与r
‑
沙丁胺醇相同的方式用于ibd小鼠。令人惊讶的是，s
‑
沙丁胺醇并没有表现出r
‑
沙丁胺醇的改善或治疗作用，相反，s
‑
沙丁胺醇在dss刺激下使小鼠的临床表现和炎症特征明显恶化。比较未经治疗的dss小鼠，dai明显加重。特别是，fob比未经治疗的dss小鼠明显恶化。结肠的长度比未治疗的dss小鼠进一步缩短。与未经治疗的dss小鼠相比，dss小鼠的粘膜糜烂、上皮细胞损伤和隐窝丢失更为严重。与未治疗的dds小鼠相比，dds小鼠的粘膜及粘膜下层、固有层和肌肉层的炎症浸润增强，固有层的破坏更严重。组织学评分明显高于未治疗的dss小鼠。本发明公开了s
‑
沙丁胺醇对肠道有毒性作用，可进一步加重ibd的临床症状和炎症反应。此外，从消旋沙丁胺醇中去除s
‑
对映体沙丁胺醇，例如使用r
‑
对映体沙丁胺醇代替消旋沙丁胺醇，可以减少s
‑
对映体沙丁胺醇造成的毒性和不必要的不良影响。本发明的公开应被认为是新颖的。这些s
‑
对映异构体β2激动剂的毒性作用是
意想不到的，是无法预料的。
16.在另一个实施例中，包括s
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特布他林和s
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班布特罗在内的β2肾上腺素能激动剂的其他s
‑
对映体在dss小鼠中的使用方式与s
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沙丁胺醇相同。观察到类似的毒性作用。dss小鼠经s
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对映异构体β2受体激动剂治疗后，其疾病活性指数(dai)和组织学评分均明显高于未治疗的dss小鼠。本发明公开了s
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对映异构体β2激动剂对肠道有毒性，可进一步加重ibd的临床症状和炎症反应。此外，本发明还公开了r
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对映体β2激动剂在治疗ibd时的新用途，降低了毒性。本发明指出，从外消旋体除去s
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对映体，例如用r
‑
对映体β2激动剂代替外消旋体β2激动剂，可以减少s
‑
对映体引起的毒性和不良反应。本发明的这种报道应被视为具备新颖性。这些毒性是意想不到的。
17.本发明还公开了r
‑
沙丁胺醇用于亚急性期或慢性期ibd的治疗。在一个实施例中，如上所述，dss诱发了ibd，同时给予r
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沙丁胺醇治疗，在第7天，dss被移除并用饮用水替代2周。定期检测小鼠的疾病活动性指数(dai)。于第23天对小鼠进行病理和组织学检查。在dss诱导的ibd小鼠中，第14天和第22天体重和粪便隐血明显减少，结肠炎总体情况很严重，尽管与第7天相比有所改善。与对照组相比，结肠长度明显缩短，组织学评分显著增高。dss诱导的结肠炎小鼠可见明显的单核细胞浸润，隐窝结构紊乱，上皮细胞变性，粘膜异常。粘膜淋巴细胞增生，固有层破坏，有时可见透壁性炎症。
18.与未治疗的dss动物相比，r
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沙丁胺醇治疗后dai疾病活动指数显著改善。体重与对照正常小鼠相似；r
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沙丁胺醇治疗后，dss小鼠的粪便潜血明显减少。治疗后组织学指标也有明显改善。隐窝再生基本完成，排列正常。正常生长的上皮细胞形成完整的粘膜表面。固有层完好无损，基本正常。粘膜或粘膜下层均有少量炎性浸润。
19.在一个实施例中，类似于上面的研究，不同的是，处理从第7天开始，直到第22天，而不是像上面那样从第1天开始，直到第22天。结果与上述相似，r
‑
沙丁胺醇对dss所致ibd小鼠有明显的治疗作用。
20.本发明公开了r
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沙丁胺醇可用于预防或治疗亚急性或慢性ibd。在本发明中的这种报道是新颖的。
21.在一个实施例中，本发明进一步公开了r
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沙丁胺醇和其他r
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对映异构体β2激动剂在治疗tnbs引起的小鼠结肠炎(一种常见的克罗恩病动物模型)方面具有显著的治疗作用。r
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沙丁胺醇治疗ibd的疗效优于英夫利昔单抗(ifx)。采用直肠注射乙醇和tnbs(三硝基苯磺酸)联合诱导雄性小鼠结肠炎模型。以体重减轻和腹泻为特征的小鼠严重结肠炎。组织学上有正常结构丢失，可见离散的上皮样肉芽肿，多发性糜烂性病变，大量淋巴细胞穿透性炎症浸润，杯状细胞丢失。然而，口服沙丁胺醇或克伦特罗后病情明显好转。在体重减轻、腹泻、结肠长度方面，r
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沙丁胺醇或r
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克伦特罗治疗的小鼠与正常对照小鼠没有显著差异。病变明显减轻，很少有炎症浸润伴隐窝生长，黏膜上皮恢复。此外，英夫利昔单抗的治疗效果与沙丁胺醇相似，但是，ifx治疗的动物有明显的黏膜下层纤维化和肠腔狭窄，而r
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沙丁胺醇和r
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克伦特罗治疗的动物没有这种现象。此外，tnbs诱导的结肠炎小鼠出现肛周症状：部分小鼠出现红斑、脓肿和溃疡，可能导致肛周裂或瘘管。然而，经r
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沙丁胺醇或r
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班布特罗治疗后，tnbs诱导小鼠的这些肛周症状明显减轻。在现有报道中，r
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沙丁胺醇、r
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克伦特罗和r
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班特罗对tnbs诱导的克罗恩病症状的治疗作用从未报道过。
22.这些肛周病变与痔疮炎症症状有些相似。在一个实施例中，本发明公开了通过口
服或局部给予r
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沙丁胺醇、r
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克伦特罗和r
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班布特罗可显著减轻痔疮炎症症状。这种新的β2激动剂用于治疗痔疮炎症症状从未报道过。
23.在另一个实施例中，该发明揭示了tnbs诱导的克罗恩病存在黏膜下层纤维化和管腔狭窄，这可能导致ibd患者进行手术。r
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沙丁胺醇治疗可明显减少肠腔纤维化和狭窄。另一方面，英夫利昔单抗治疗增强了黏膜下层纤维化和管腔狭窄。r
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沙丁胺醇的这些有益作用是新颖的。
24.在另一实施例中，其他r
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对映体包括短效β2激动剂、r
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特布他林或长效β2激动剂r
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班布特罗和r
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克伦特罗分别用于上述亚急性或慢性dss小鼠。r
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对映体β2激动剂的这些药物显著改善了由dss或tnbs引起的亚急性或慢性临床症状和病理改变。与未治疗dss或tnbs诱导的ibd小鼠相比，β2激动剂的r
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对映体治疗后，疾病活性指数和组织学评分均显著改善。本发明公开了r
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对映体β2激动剂可用于亚急性或慢性ibd(包括uc和克罗恩病)的治疗，其治疗效果显著优于已上市的药物。这一发明的报道是新颖的，也不是业内人士可以预测和推知的。
25.本发明还公开了一组r
‑
对映体β2激动剂在预防和治疗上述ibd及相关痔疮症状中的新用途如下：短效β2激动剂：比托特罗、非诺特罗、异丙肾上腺素、奥西丙那林或甲丙肾上腺素长效β2激动剂：福莫特罗，阿福特罗，perforomist，沙美特罗，川町特罗；以及超长效β2激动剂：阿比替罗、卡莫特罗、茚达特罗、洛达特罗、维兰特罗、异舒普林、马博特罗和齐帕特罗。
26.在一个实施例中，s
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沙丁胺醇和s
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班布特罗在dss诱导ibd后使用8天，使用方式与上文提到的r
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沙丁胺醇相同。在22天内定期检查dai和组织学评分。令人惊讶的是，与r
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沙丁胺醇相比，s
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沙丁胺醇和s
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班布特罗并没有表现出改善症状或治疗效果的迹象，相反，与dss小鼠相比，s
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沙丁胺醇和s
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班布特罗均恶化了疾病表现和炎症反应。与未治疗的dss小鼠相比，s
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沙丁胺醇治疗后dai明显恶化。特别的是，与未处理的小鼠相比，s
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沙丁胺醇和s
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班布特罗处理后的小鼠体重更低，粪便隐血在第14天和22天更严重，结肠长度更短。组织学上，粘膜、固有层、粘膜下层甚至肌层均有炎性浸润。隐窝消失，上皮变性，粘膜糜烂。s
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沙丁胺醇和s
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班特罗治疗的dss小鼠的组织学评分均显著高于未治疗的dss小鼠。
27.本发明揭示，与r
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对映体不同，s
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沙丁胺醇和s
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班布特罗对ibd的肠道是有毒的，而不是有益的。s
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沙丁胺醇和s
‑
班布特罗的治疗进一步加重ibd的临床症状和炎症反应。此外，将s
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对映体沙丁胺醇和s
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对映体班布特罗从它们的外消旋形式中去除，例如使用r
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沙丁胺醇代替外消旋的沙丁胺醇和班布特罗，可以显著减少毒性和不良反应。因此，本发明公开了r
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沙丁胺醇或r
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班布特罗或其他r映体β2激动剂的新用途，用于亚急性或慢性ibd的治疗，以减少不良反应。本发明的报道应被认为是新颖的，并涉及到创造性的步骤，因为这些毒性作用是出乎意料的。
28.在另一个实施例中，β2肾上腺素能激动剂的其他s
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对映体，包括s
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特布他林和s
‑
克伦特罗，在dss小鼠中以上述相同方式使用。观察到类似的毒性作用。s
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特布他林和s
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克伦特罗治疗的dss小鼠的疾病活性指数(dai)和组织学评分均比未治疗的dss小鼠差得多。本发明揭示了s
‑
特布他林和s
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克伦特罗对肠道是有毒的，而不是像r
‑
对映体那样对肠道有治疗作用。
29.因此，本发明公开了r
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特布他林或r
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克伦特罗和其他r
‑
对映体β2激动剂的新用
途，用于亚急性或慢性ibd的治疗，以减少不良反应。根据本发明的其他r
‑
对映体β2激动剂包括：短效β2激动剂的r或r’r’对映体：比托特罗，非诺特罗，异丙肾上腺素，奥西普利那林或甲丙肾上腺素，比尔布特罗，普卡特罗，利托君；长效β2激动剂：沙美特罗、tranteniterol,阿福莫特罗、福莫特罗、perforomist、川丁特罗；以及超长效β2激动剂：阿比替罗、卡莫特罗、茚达特罗、洛达特罗、维兰特罗、异舒普林、马博特罗和齐帕特罗。
30.在其中一个实施方案中，本发明揭示了r
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对映体β2激动剂在ibd及其相关症状中的治疗机制，涉及抑制巨噬细胞极化和抑制肠固有淋巴细胞、cd4和cd8t淋巴细胞的活化，并诱导这些细胞中的代谢及重组。另一方面，s
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对映体β2激动剂起着相反的作用。这些发现是新颖的并且在现有技术中未被报道。
31.炎症性肠病(ibd)的肠外表现(eims)在溃疡性结肠炎(uc)和克罗恩病(cd)中都很常见。这些表现几乎可以累及多个器官系统，包括肌肉骨骼、皮肤、肝胰胆管、眼部、肾和肺。这些都会给内科医生治疗ibd患者带来巨大的挑战。结果显示，31.4％的uc患者和40.4％的cd患者有5种主要表现中的1种，少数患者有1种以上的主要eims。部分数据表明，大约三分之一的患者在诊断为ibd之前会发展成有症状的原发性硬化性胆管炎(psc)。根据一些小型研究，10
‑
30％与ibd相关的关节炎患者在诊断ibd之前会出现关节炎症状。(levine et al.,extraintestinal manifestations of inflammatory bowel disease.gastroenterology&hepatology volume 7,issue 4,235 april.2011).
32.皮肤问题影响着约15％的不同类型的ibd患者。皮肤问题涉及炎症性皮肤病(isds)，主要包括银屑病、红斑痤疮和特应性皮炎等(kim et.al.,inflammatory bowel disease is associated with an increased risk of inflammatory skin diseases,j am acad dermatol.2017 jan；76(1))。也包括自身免疫性皮肤病，如狼疮、白癜风和斑秃。与ibd相关的皮肤病还包括：粟粒疹、坏疽性脓皮病、sweet综合征、肠相关皮肤病
‑
关节炎综合征(badas)、植物性脓皮病
‑
脓口病(ppv)。过敏性血管炎、痤疮和荨麻疹(elaine k.luo,and ana gotter,10 skin rashes linked to ulcerative colitis,medically reviewed july 5,2017)
33.本发明公开了β2激动剂的r
‑
对映体可用于治疗炎性肠病(emi)的肠外表现，包括关节炎、骨关节炎、狼疮、强直性脊柱炎。白癜风、银屑病、淀粉样变、结节性红斑、坏疽性脓皮病、原发性硬化性胆管炎、痤疮、湿疹、荨麻疹、葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜上炎、硬化性软化、角膜溃疡、视网膜血管病、鼻炎和肺部炎性疾病。
34.在其中一个实施方案中，在dss诱导的ibd小鼠中，也存在膝关节损伤。关节软骨结构变薄，部分破坏。软骨细胞变性、减少、聚集。半月板受损，失去了结构完整性。x射线结果表明为关节软骨层变薄，骨结构减少。r
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沙丁胺醇或r
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班布特罗治疗组小鼠上述损伤明显减轻。关节软骨和骨结构逐渐恢复正常。
35.本发明提供了r
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沙丁胺醇或r
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班布特罗治疗ibd关节炎的新用途。在另一实施例中，在dss诱导的ibd小鼠中使用s
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沙丁胺醇和s
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班布特罗，与未治疗的dss小鼠相比，关节软骨和半月板的损伤加重。本发明公开了s
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沙丁胺醇和s
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班布特罗对软骨和半月板有害。此外，本发明公开了r
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沙丁胺醇或r
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班布特罗用于治疗关节炎的新用途，且能减少不良反应。已知在现有技术中，ibd的肠外表现(eims)具有共同的发病机制。本发明还公开了r
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沙丁胺醇或r
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班布特罗用于治疗上述ibd的其他肠外表现(eims)的用途，包括关节炎、强直性
脊柱炎。口腔克罗恩病、狼疮、淀粉样病变、结节性红斑和原发性硬化性胆管炎、眼部疾病、鼻炎和肺部炎症。
36.在其中一个实施例中，局部使用r
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沙丁胺醇、r
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特布他林和r
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克伦布特罗可显著减轻痤疮、恶性痤疮、荨麻疹和湿疹的症状。大鼠口服上述药物可明显改善银屑病和湿疹。
37.本发明提供了r
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沙丁胺醇、r
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特布他林、r
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班布特罗、r
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克伦特罗在治疗炎症性皮肤病(isds)和与ibd相关的自身免疫性皮肤病中的新用途，主要包括：银屑病、酒渣鼻、特应性皮炎、粟粒疹、痤疮、荨麻疹、坏疽性脓皮病、sweet氏综合征、肠相关皮肤病
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关节炎综合征(badas)、脓性皮炎
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化脓性口炎(ppv)。过敏性血管炎，白癜风和斑秃。其他对映体肾上腺素能β2激动剂具有类似的药理作用。本发明公开了其他r
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对映体肾上腺素能β2激动剂用于治疗关节炎和上述ibd的其他肠外表现(eim)的用途。上述根据本发明的其他手性β2激动剂包括短效β2激动剂的r或r'r'对映体：bitolterol、非诺特罗、异丙肾上腺素、奥奇普利或偏丙肾上腺素
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吡丁醇、丙卡特罗、利妥君；以及长效β2激动剂：阿福莫特罗、福莫特罗，富马酸福莫特罗、沙美特罗、曲丁特罗和超长效β2激动剂：阿贝地特罗、卡莫特罗、吲哚卡特罗、奥洛地特罗、维兰特罗、异舒普林、马布特罗和齐帕特罗。
38.本发明提供了r
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对映体肾上腺素能β2激动剂的新用途，用于治疗ibd和ibd的eims，减少不良反应。本发明公开的内容从未在现有技术中报道过，并且本领域的技术人员无法预料。
39.目前对ibd的治疗包括抗炎药，通常是5
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氨基水杨酸盐。这类药物包括柳氮磺胺吡啶、美沙拉秦、巴柳氮和奥柳氮。另一方面，皮质类固醇可用于中重度溃疡性结肠炎，包括强的松和氢化可的松等。其他治疗ibd的药物包括免疫抑制药物，包括硫唑嘌呤和巯基嘌呤，环孢霉素的应用较少。抗体也被使用，包括英夫利昔单抗、阿达木单抗和戈利单抗，以及韦多利珠单抗、赛妥珠单抗、那他珠单抗、尤特克单抗和bm
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ca。然而，上述药物通常有严重的副作用，大多数不适合长期使用。在临床前和临床研究中，手性r
‑
对映体β2激动剂的毒性较小，相对安全。本发明公开了r
‑
沙丁胺醇或r
‑
班布特罗或一种其他r
‑
或r'r'对映体β2激动剂与任何一种抗炎药(例如5
‑
氨基水杨酸盐或皮质类固醇)组合具有增效作用或使市售抗炎药的剂量降低并降低毒性。
40.本发明还公开了r
‑
沙丁胺醇或r
‑
班布特罗或其他r
‑
或r'r'对映体β2激动剂之一与任何一种免疫抑制药物(例如硫唑嘌呤和巯基嘌呤)组合具有协同作用，或降低市售免疫抑制剂药物剂量，以及降低药物的毒性。本发明公开了至少一种r或r'r
‑
对映体β2激动剂与至少一种抗炎药(包括至少一种5
‑
氨基乙酸和皮质类固醇)或至少一种上述免疫抑制剂的组合用途，或用上述至少一种免疫调节抗体，或用至少一种抗生素治疗ibd和ibd的肠外表现。
41.鞘氨醇
‑1‑
磷酸(sphingosine
‑1‑
phosphate，s1p)受体是ibd的药物靶点。s1p调节淋巴细胞从淋巴结流出进入循环系统，随后通过产生促炎细胞因子加强肠道的炎症反应。本发明公开了至少一种r或r'r
‑
对映体β2激动剂与至少一种s1p受体调节剂的组合用途，用于治疗ibd和ibd的肠外表现。
42.根据本发明涉及的皮质类固醇包括布地奈德、氟替卡松、氟尼索利特、环索奈德、莫米松、倍氯米松和地塞米松。
43.根据本发明涉及的抗生素包括氨基糖苷、安塞霉素、碳头孢烯、碳青霉烯、头孢菌
素、糖肽、林可酰胺、脂肽、大环内酯、单巴坦、硝基呋喃、恶唑烷酮、青霉素、多肽、喹诺酮类、磺胺类、四环素、氯霉素、膦酸抗生素和分枝杆菌抗生素。
44.根据本发明涉及的抗体包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利单抗、韦多利珠单抗、赛妥珠单抗、纳他利珠单抗、乌司他单抗和bm
‑
ca的抗体。
45.根据本发明涉及的s1p受体调节剂为芬格莫德、波奈西莫德、西波尼莫德、奥扎尼莫、阿米司利莫德和gsk2018682。
46.在本发明的实施例中，提供一种新的药物组合物，其包含有效量的β2激动剂的r
‑
沙丁胺醇或r
‑
班布特罗或其他r或r'r
‑
对映体及其盐，用于通过口服、口服膜剂、吸入、鼻喷雾剂、注射、局部、滴眼，直肠或阴道，对有需要的病人进行单次或联合给药治疗。剂型有固体制剂、溶液、雾化气雾剂、注射剂、软膏、皮肤贴片、薄膜、软胶囊和栓剂。
47.根据本发明的β2激动剂的r
‑
对映体的对映体ee值或光学纯度不小于80％或优选大于98％或更优选大于99％。
48.根据本发明的β2激动剂的r
‑
对映体的医药上可接受的盐包括那些由常规医药上可接受的无机或有机酸形成的盐，例如：盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸二氢盐、甲磺酸盐、溴化物、硫酸甲酯、醋酸盐、草酸盐，马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、2
‑
萘磺酸盐、乙醇酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸、丙酮酸异硫酯、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。
实施例
49.实施例1 r
‑
和s
‑
对映体β2激动剂对dss诱导的急性结肠炎的影响
50.方法
51.动物和药物治疗
52.雄性c57bl小鼠(8
‑
10周，18
‑
20g)分为对照组(仅饮用水)、dss组和dss加治疗组(n＝5)。给小鼠的饮水中加入分子量为36～50kda的2％(w/v)葡聚糖硫酸钠(dss)7天，造成急性结肠炎。第7天结束时，去除dss，动物只接受饮用水2天。动物在摄入dss后第10天被安乐死，进行解剖和组织学检查。
53.r
‑
沙丁胺醇(r
‑
s)(1mg/kg)，s
‑
沙丁胺醇(s
‑
s)(1mg/kg)，r
‑
特布他林(r
‑
t)(1mg/kg)，s
‑
特布他林(s
‑
t)(1mg/kg)，r
‑
班布特罗(r
‑
b)(10mg/kg)，s
‑
班布特罗(s
‑
b)(10mg/kg)，r
‑
克伦特罗(r
‑
c)(1mg/kg)，rs
‑
克伦特罗(rs
‑
c)(2mg/kg)每日静脉注射，从dss诱导的第2天开始连续8天。地塞米松(dex)1mg/kg作为对照药物。每种手性药物的对映体ee值均大于98％，化学纯度均大于99％。
54.疾病症状和组织学改变的评价
55.疾病活动指数(dai)：每天监测动物的体重、水/食物消耗量、发病率、粪便稠度和粪便血。将体重减轻、大便稠度、大便潜血等各项指标综合计算疾病活动指数(dai)，dai范围为0～12。得分定义如下：大便稠度0分为无腹泻，2分为不粘肛门的稀便，4分为粘肛门的液体大便；大便潜血0分为无，2分为中度，4分为大出血；体重减轻，如果体重保持在基线的1％或更高，则赋值为0，1表示体重下降1
–
5％，2表示体重下降5
–
10％，3表示体重下降10
–
15％，4表示体重下降超过15％。记录结肠长度作为炎症指标。将整个结肠纵向切开，用无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)轻轻冲洗，去除任何粪便痕迹，以备病理学检查。结肠段用10％中性
福尔马林固定。组织被石蜡包埋，切片，固定在载玻片上。采集h&e染色石蜡切片图像。病理学评价采用盲法。
56.组织学评分：上皮，0＝形态正常，1＝杯状细胞丢失，2＝大面积杯状细胞丢失，3＝隐窝丢失，4＝大面积隐窝丢失；炎症细胞浸润，0＝无浸润，1＝隐窝周围浸润，2＝浸润至粘膜肌层，3＝广泛浸润至粘膜肌层，粘膜增厚伴有大量水肿，4＝粘膜下层浸润。数据以平均值
±
标准差(sd)表示。
57.结果:
58.β2受体激动剂改善dss诱导的急性结肠炎。
59.小鼠口服2％dss7天后出现结肠炎症状，包括体重减轻、腹泻、便血。dss小鼠疾病活动指数(dai)明显升高。β2受体激动剂治疗可显著改善症状，降低dai值和组织学评分。β2受体激动剂r
‑
对映体的治疗效果优于对照药物地塞米松(表1)。
60.表1.dss急性结肠炎不同治疗方法的疗效观察
61.dai：疾病活动指数，fob：粪便潜血，col:结肠，hist:组织学。
62.[0063][0064]
图1.dss诱导的结肠炎和用rs(r
‑
沙丁胺醇)、rb(r
‑
班布特罗)、rt(r
‑
特布他林)、rc(r
‑
克伦特罗)、s
‑
s(s
‑
沙丁胺醇)、sb(s
‑
班布特罗)、s
‑
t(s
‑
特布他林)、rs
‑
c(消旋克伦特罗)和地塞米松(地塞米松)治疗一周。
[0065]
对照组h&e染色结肠标本的组织学分析显示(图1)，结肠粘膜上皮保持完整，连续，隐窝排列规则，结构清晰，无炎性细胞浸润和溃疡。dss模型组粘膜失去结构，粘膜上皮不连续，形成广泛的溃疡病变，隐窝消失，固有层破坏，炎症扩展至粘膜及粘膜下层，大量炎性细胞浸润。在r
‑
对映体治疗组(dss r
‑
a或r
‑
b或r
‑
t或r
‑
c)，组织学完整性得到极大改善，固有层完整。隐窝再生，黏膜上皮恢复清晰，炎性浸润明显减轻。dss dex治疗组动物黏膜及黏膜下层有炎症浸润，固有层破坏，但有少量不完全生长的隐窝和黏膜上皮。一般来说，dss dex治疗有一些改善，但与r
‑
对映体β2激动剂治疗相比，改善较少。
[0066]
在s
‑
对映体治疗的dss小鼠(dss s
‑
s或s
‑
b或s
‑
t)中，与未处理的dss小鼠相比没有改善的迹象。相反，炎性浸润在粘膜、粘膜下层和肌层更为严重(dss s
‑
b)，固有层完全破
坏(dss s
‑
s)。病理组织学有明显改变。s
‑
对映体处理的dss小鼠的组织学评分高于未处理的dss小鼠，并且远高于r
‑
对映体处理的dss小鼠。
[0067]
当使用外消旋体rs
‑
克伦特罗时，组织学评分比未经dss治疗的小鼠好，但比经r
‑
对映体治疗的小鼠差。用盐酸克伦特罗治疗dss小鼠，粘膜上皮消失，固有层破坏，粘膜、粘膜下层和肌层有炎性浸润，但有少量隐窝再生。rs
‑
克伦特罗小鼠的整体组织学和dai表现比用r
‑
克伦特罗治疗的dss小鼠的改善效果要小得多。
[0068]
实施例2r
‑
和s
‑
对映体β2激动剂对dss诱导的亚急性结肠炎的影响
[0069]
方法
[0070]
与实施例1相同，
[0071]
1)研究周期为三周，其中治疗期为一周。
[0072]
在第1周结束时，dss和所有的治疗都被移除并用饮用水代替。再给小鼠自由饮水和食物2周。在第23天按照实施例1进行评估和检查。
[0073]
2)仅r
‑
salbutamol(r
‑
s)(1mg/kg)、s
‑
沙丁胺醇(s
‑
s)(1mg/kg)，r
‑
bambutrol(r
‑
b,10mg/kg)、s
‑
班布特罗(s
‑
b)(10mg/kg)被使用。
[0074]
结果：
[0075]
r
‑
班布特罗对疾病活动指数和组织学评分的影响。
[0076]
在dss诱导的ibd小鼠中，停止dss一周后，第14天和第22天体重和粪便潜血仍有显著下降，但与第7天相比略有改善。dai明显增加。与未经治疗的dss动物相比，r
‑
沙丁胺醇治疗后疾病活动指数(dai)显著改善。小鼠体重与正常对照组相似，r
‑
沙丁胺醇和r
‑
班布特罗治疗后粪便潜血较dss小鼠明显减少。(表2)
[0077]
在dss诱导的结肠炎小鼠中，结肠长度显著缩短，组织学评分显著高于对照组。有明显的单核白细胞浸润，少量新生长的隐窝结构紊乱，上皮剥脱，粘膜异常，固有层破坏，肉芽肿形成。r
‑
沙丁胺醇和r
‑
班布特罗给药后组织学指标也明显改善。黏膜再生完整，隐窝排列正常，上皮生长正常。固有层正常。粘膜及粘膜下层均未见炎性浸润。
[0078]
表2.dss结肠炎不同治疗方法的疗效观察
[0079][0080]
dai.disease active index,fob.fecal occult blood,col.colon,hist.histological dai：疾病活动指数，fob：粪便潜血，col:结肠，hist:组织学。
[0081]
实施例3在dss诱导的亚急性结肠炎中延长治疗的效果
[0082]
方法
[0083]
1)在三周的实验周期里进行两周的治疗
[0084]
在第一周结束时，撤掉dss水溶液。给药治疗的时间从第一天开，连续给药14天。第
三周只饮用纯净水。按照实施例1的方法，在第23天对小鼠进行处死，对其结肠进行评估和检查。所用的治疗药物包括r
‑
salbutamol(r
‑
s)(1mg/kg),s
‑
salbutamol(s
‑
s)(1mg/kg),r
‑
bambuterol(r
‑
b)(10mg/kg),s
‑
bambuterol(s
‑
b)(10mg/kg)。
[0085]
结果：
[0086]
尽管在急性期有疾病状况存在一定的恢复，但未经治疗的dss组小鼠dai和组织学评分显著升高。在使用r
‑
salbutamol(dss r
‑
s)或r
‑
bambuterol(dss r
‑
b)治疗的dss小鼠中，dai和组织学评分均恢复正常。黏膜、上皮和隐窝均呈现出正常状态，经r
‑
b或r
‑
s治疗两周后，粘膜、粘膜下层和固有层均正常，无炎症浸润(图2,dss r
‑
b and dss r
‑
s)。相反，在s
‑
s和s
‑
b治疗的dss小鼠中，结肠炎症状加剧，dai和组织学评分均明显高于dss组。粘膜上皮有溃疡和病变，隐窝结构紊乱，固有层和黏膜肌层被破坏，各层可见炎性浸润及结构状态异常(图2,dss s
‑
s，dss s
‑
b)。总的来说，在dss诱导的慢性结肠炎中，与模型组相比，s
‑
s和s
‑
b治疗可导致疾病严重恶化。
[0087][0088]
图2.dss诱导结肠炎及r
‑
s、s
‑
s、r
‑
b、s
‑
b治疗2周的病理图
[0089]
实施例四r
‑
沙丁胺醇对银屑病(ibd的肠外表现)的治疗效果
[0090]
银屑病是ibd的主要肠外表现之一。由于在本发明中，银屑病只发生在dss或tnbs诱导的ibd小鼠的一部分。因此采用一个公认的银屑病小鼠模型：imq诱导的银屑病样皮肤病变，用于后续的研究。
[0091]
方法：
[0092]
将小鼠分为对照组、银屑病组和银屑病加治疗组(n＝8)，用咪喹莫特乳膏(62.5mg)连续7天涂抹于背部皮肤上，诱发银屑病。对照组则使用等量的凡士林。设4个治疗组：3个剂量的r
‑
沙丁胺醇(r
‑
sal)(0.5mg、1mg、2mg/kg)，地塞米松(1mg/kg)作为阳性对照。对照组灌胃给予等量的生理盐水。在一些实验中，r
‑
bambuterol(长效β2激动剂)被用作额外的治疗组(n＝3)。采用银屑病区域严重程度指数进行评价。分别测量红斑、鳞屑和皮肤厚度的每一项评分，然后合并计算分数(图2)。
[0093]
结果：
[0094]
(1)皮肤表现与银屑病区域严重程度评分
[0095]
采用咪喹莫特乳膏可诱发典型的银屑病病变。药物治疗后病灶明显改善(图3)。银屑病(pso)组银屑病区域严重程度评分最高。治疗后评分明显降低。对r
‑
沙丁胺醇存在着剂量依赖性。高剂量沙丁胺醇(2.0mg/kg)对各评分的效果最好，其效果与地塞米松(dex)相近(图2)。
[0096][0097]
图1.r
‑
沙丁胺醇(r
‑
sal)和地塞米松(dex)治疗8天后对imq诱导的银屑病样背部皮肤损伤的影响
[0098][0099]
图2分别给予地塞米松(dex)、0.5mg/kg(r1)、1.0mg/kg(r2)、2.0mg/kg(r3)治疗后，imq诱导的银屑病样背侧皮损的银屑病区严重程度评分。
[0100]
(2)组织学变化
[0101]
图3所示为采用r
‑
沙丁胺醇、s
‑
沙丁胺醇以及r
‑
班布特罗治疗银屑病后的组织学变化。经过imq诱导银屑病后，皮肤受损严重。病灶经r
‑
沙丁胺醇和r
‑
班布特罗治疗后基本
medicine(2018)18:215)。
[0110]
方法：dncb致过敏性接触性皮炎(湿疹)模型
[0111]
小鼠腹腔部位剃毛，溶解dncb(100μl0.5％)，涂抹在剃毛的皮肤上诱导特应性皮炎，连续2天。第8天，将dncb分别涂于耳内、外表面诱发湿疹。在第一天起采用灌胃给予r
‑
沙丁胺醇和吲哚美辛进行治疗，连续8天。在第9天对小鼠进行解剖并进行相应的评价。
[0112]
动物和治疗
[0113]
将小鼠分为4组(n＝8)，a组为对照组；b组为模型组(dncb)；c组为r沙丁胺醇0.05、0.1或0.2mg/kg治疗组；d组为吲哚美辛治疗组5mg/kg。根据双耳肿胀、红斑、划痕、厚度等进行炎症评分。
[0114]
评分标准
[0115][0116]
结果：
[0117]
(1)炎症评分变化
[0118]
双耳厚度和红斑积分作为湿疹的炎症指标，与对照组相比，模型组的双耳厚度和红斑积分明显增加。不同剂量r
‑
沙丁胺醇治疗后，厚度和红斑均得到明显减轻，而吲哚美辛的治疗作用较小。
[0119][0120]
(2)组织学变化
[0121]
经过dncb造模后，能够产生严重湿疹，给予r
‑
沙丁胺醇治疗后可显著改善湿疹组织学变化，减少炎症浸润，并呈现出剂量依赖性。而吲哚美辛则对湿疹的治疗作用较小(图a
‑
f)。
[0122][0123]
图.r
‑
沙丁胺醇治疗对dncb诱导的湿疹小鼠耳皮肤组织病理学的影响(400x)。
[0124]
(a)对照组；(b)湿疹组：(a)单核细胞浸润和(b)表皮角质化；(c)r
‑
沙丁胺醇(0.05mg/kg)治疗组：对湿疹影响不大；(d)r
‑
沙丁胺醇(0.1mg/kg)治疗组：单核细胞浸润明显减少；(e)r
‑
沙丁胺醇(0.1mg/kg)治疗组：单核细胞浸润和表皮角化进一步减少；(f)吲哚美辛治疗组(5mg/kg/day)
[0125]
实施例六r
‑
沙丁胺醇对荨麻疹(ibd的肠外表现)的治疗效果
[0126]
一个健康女性在她的脸部和眼睑区域患有荨麻疹，已经持续了一周。采用r
‑
沙丁胺醇(r
‑
sal)乳膏(5％)局部敷一夜，第2天上午症状明显缓解(下图)。
[0127]