一种凋亡相关斑点样蛋白（ASC）作为缺血性脑卒中标志物的应用的制作方法

一种凋亡相关斑点样蛋白(asc)作为缺血性脑卒中标志物的应用
技术领域
1.本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种具有胱天蛋白募集域(card)和热蛋白样结构域(pyd)的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain，简称asc)作为缺血性卒中检测标志物及其应用。


背景技术：

2.卒中是一种因脑血管阻塞或破裂所引起的脑部血液循环障碍和脑组织功能和结构损害的疾病。
3.卒中在我国的发病率正以每年近9％的速度上涨。根据《中国居民营养与慢性病状况报告(2015年)》，近年来我国居民每年因脑卒中死亡人数超过200万，占总死亡的22.8％。患有高血压、心脏病、糖尿病的人，是脑卒中的高危人群。世界卫生组织(who)对中国慢性疾病分析显示，如果维持现在的死亡率不变，预测到2030年，我国每年将有近400万人死于脑卒中；如果死亡率仅增长1％，到2030年我国每年将有600万人死于脑卒中。据《中国脑卒中防治报告2018》显示，我国40岁以上人群现患和曾患脑卒中人数为1242万，愈后存活人群中70％留有不同程度的伤残，带来庞大的愈后治疗陪护和康复市场需求。随着我国政府对卒中的全面重视，推行早预防、早治疗两手抓的积极做法，将逐渐改善脑卒中的现状和发展态势。
4.然而，长期以来可用于脑卒中的诊断的生物标志物并不多。包括脑震荡等轻度脑损伤、创伤性脑损伤、脑卒中等患者的诊断手段主要是电子计算机断层扫描(ct)和核磁共振成像(mri)。ct扫描常规用于辅助医生评估脑损伤，可迅速、简捷、准确排除脑出血、硬脑膜下血肿和瘤卒中。但ct扫描的使用具有局限性，尤其是对于症状轻微的重大创伤。在一些情况下，例如：脑梗塞发病，ct检测时脑部尚未形成病灶；病灶小于1cm，ct不容易发现；病灶所处的位置，不易被ct发现；受损脑组织密度和正常脑组织相似，普通ct容易诊断为阴性，这时需要增强扫描。文献报道的统计表明，去急诊就医的轻度脑损伤或脑震荡患者中，有较大比例的ct扫描结果为阴性，脑梗塞的诊断阳性率为60-84％。
5.为了更好的对脑损伤疾病早期预警、病程进展管理和治疗预后的监控以及辅助诊断，医学界越来越重视开发基于血液的脑损伤生物标记物的发现和应用。近年来的研究表明，脑损伤后，血液中很快出现2种脑特异性蛋白质生物标记物(胶质细胞原纤维酸性蛋白即gfap，以及泛素羧基末端水解酶-l1即uch-l1)。2018年，美国食品药品管理局(fda)将应对脑损伤诊断列为紧迫医疗需求，按突破性器械项目审理该脑损伤检测，简化了开发、加快创新性突破性技术的审理。fda核准基于gfap和uch-l1的banyan btitm(脑创伤指数)试剂盒的510k上市申请，允许该项诊断性检测用作确诊器械。这是首款获得fda核准的脑震荡血液检测，是转变脑损伤处治方式的重大里程碑，可为医生提供客观的可量化信息，以杜绝不必要的ct扫描，并指导患者医护。另外，血清s-100b检测是一项好的脑损伤筛查项目，被誉
为是”神经生物学上的crp”。因为它对头部ct扫描异常具有很高的敏感性，s-100b检测在临床上适合用于外伤性脑损伤(tbi)、急性脑卒中等疾病的早期评估。尽管如此，基于血液的脑损伤生物标记物还是太少，尤其是用于脑卒中诊断的生物标志物。
6.为了具有临床实用性，新的诊断标志物作为单一标志物通常应优于或至少是相当于本领域已知的其他标志物。新标记物价值表现在其敏感性和特异性上，寻找一种兼顾敏感性和特异性的血清学标志物，应用于脑卒中的临床检测，以期达到脑卒中早期诊断、术后监测及预后评估的目的是脑卒中诊治中迫切需要解决的课题。
7.本发明披露一种具有胱天蛋白募集域(card)和热蛋白样结构域(pyd)的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain，简称asc)作为缺血性卒中标志物及其应用，并且展示一种通过测定人体血液中凋亡相关斑点样蛋白含量用于评估缺血性卒中疾病的方法及相关体外诊断试剂盒的制备及应用。


技术实现要素：

8.为了弥补现有技术中对于脑损伤疾病检测方法的不足，尤其是对于缺血性脑卒中的检测，本发明提供了一种用于检测缺血性脑卒中的新的标志物。
9.优选的，本发明的目的是公开一种具有胱天蛋白募集域(card)和热蛋白样结构域(pyd)的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain，简称asc)作为缺血性卒中标志物及其应用，具体地为一种通过测定人体体液中凋亡相关斑点样蛋白含量用于评估缺血性卒中疾病的方法及相关体外诊断试剂盒的制备及应用。
10.为达到上述目的，本发明的第一个方面提供了一种具有胱天蛋白募集域(card)和热蛋白样结构域(pyd)的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain，简称asc)作为缺血性卒中标志物，用于缺血性卒中的早期检测和辅助诊断。其中asc的检测水平增高指示缺血性卒中。本发明所述具有胱天蛋白募集域(card)和热蛋白样结构域(pyd)的凋亡相关斑点样蛋白(简称asc)的氨基酸序列为：
[0011][0012]
本发明提供了所述蛋白的一种具体应用，既在体外检测建立测定包括血清、血浆等人体体液中胱天蛋白募集域(card)和热蛋白样结构域(pyd)的凋亡相关斑点样蛋白(asc)浓度的方法。
[0013]
本发明还提供了所述的测定人体体液凋亡相关斑点样蛋白(asc)浓度的技术方案。
[0014]
本发明公开了特异性测定蛋白质asc浓度的试剂在制备用于区分缺血性脑卒中的
试剂盒中的用途。
[0015]
优选的，所述区分包括：
[0016]
1)测定体液中蛋白质asc的浓度；
[0017]
2)将步骤1)中测定得到的蛋白质asc的浓度与蛋白质asc的参照浓度进行比较，其中高于参照浓度的蛋白质asc浓度指示为缺血性脑卒中。
[0018]
优选的，所述体液为血清、血浆或全血样品。
[0019]
优选的，通过免疫测定法测定蛋白质asc浓度。
[0020]
优选的，所述免疫测定法为磁微粒全自动化学发光免疫分析。
[0021]
本发明公开了一种检测缺血性脑卒中的试剂盒。
[0022]
优选的，所述试剂盒包括：包被fitc抗体的磁微粒，fitc标记的asc抗体，吖啶酯标记的asc检测抗体以及asc校准品和质控品。
[0023]
优选的，所述asc校准品的浓度分别为0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml。
[0024]
优选的，所述试剂盒还包括稀释液、清洗液、预激发液和激发液。
[0025]
优选的，所述包被fitc抗体的磁微粒母液浓度为10mg/ml。
[0026]
优选的，所述fitc标记的asc抗体母液的浓度为1.3mg/ml。
[0027]
优选的，所述包被fitc抗体的磁微粒，磁微粒母液浓度为10mg/ml，稀释20倍后的工作液的浓度为0.5mg/ml。
[0028]
优选的，所述fitc标记的asc抗体，母液的浓度为1.3mg/ml，稀释1000倍得到的工作液浓度为1.3μg/ml。
[0029]
优选的，所述吖啶酯标记的asc检测抗体，母液的浓度为1.3mg/ml，稀释4000倍得到的工作液浓度为0.33μg/ml。
[0030]
优选的，所述校准品的asc浓度分别为0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml。
[0031]
优选的，所述稀释液为tris缓冲液，其成分为50mmtris、150mm nacl，ph值为7.4。
[0032]
优选的，述清洗液为添加了体积分数为0.05％的tween-20的tris缓冲液。
[0033]
优选的，所述预激发液的成分为0.2m naoh溶液。
[0034]
优选的，所述激发液的成分为0.06％h2o2。
[0035]
优选的，该技术方案表现为一种磁微粒全自动化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有本公开的第一个方面所述方法涉及的试剂：包括以下组成：包被到磁微粒的fitc抗体，fitc标记的asc抗体，吖啶酯标记的asc检测抗体、校准品、质控品，所述校准品、质控品的主要成分为重组人asc蛋白。
[0036]
优选的，本发明所涉及的技术方案为：取20μl样本和50μl的fitc标记的asc抗体、50μl的吖啶酯标记的asc检测抗体混匀反应，37℃孵育30分钟；再加入50μl的包被fitc抗体的磁微粒，37℃继续孵育20分钟；经过清洗磁分离弃去上清；加入0.06％过氧化氢溶液和0.2m的氢氧化钠溶液各100μl，读取相对发光值(rlu)。asc浓度与rlu成一定的比例关系，测定仪自动拟合计算asc浓度。
[0037]
通过上述技术方案，本发明提供了一种通过测定人体体液中凋亡相关斑点样蛋白含量用于评估缺血性卒中疾病的方法及相关的一种磁微粒全自动化学发光免疫分析试剂
盒的制备及应用。
[0038]
本发明的技术具有以下优点：本发明提供的一种具有胱天蛋白募集域(card)和热蛋白样结构域(pyd)的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain，简称asc)作为缺血性卒中标志物，是一种兼顾敏感性和特异性的体液标志物，用于缺血性卒中早期诊断、术后监测及预后评估，克服卒中因缺乏体液标记物所致的诊断和随访困难的缺点。
[0039]
本发明提供了一种可选的评估缺血性卒中疾病的一种磁微粒全自动化学发光免疫分析试剂盒，具有良好的特异性、敏感性、稳定性以及使用时的便利性，适合临床检验使用。
附图说明
[0040]
图1.检测asc蛋白的校准曲线。
[0041]
图2.asc的受试者工作特征曲线(roc)。
[0042]
图3.缺血性卒中患者和正常人的asc蛋白浓度比较。
[0043]
图4.磁微粒全自动化学发光免疫asc分析试剂盒的健全性。
具体实施方式
[0044]
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0045]
实施例1构建以asc蛋白为脑卒中标志物的试剂盒
[0046]
用于测量人血清样品中asc含量的磁微粒全自动化学发光免疫分析试剂盒。包括以下组成：包被到磁微粒的fitc抗体，fitc标记的asc抗体，吖啶酯标记的asc检测抗体、校准品、质控品，校准品和质控品的主要成分是重组人asc蛋白。
[0047]
包被fitc抗体的磁微粒，磁微粒母液浓度为10mg/ml，稀释20倍后的工作液的浓度为0.5mg/ml；
[0048]
fitc标记的asc抗体，母液的浓度为1.3mg/ml，稀释1000倍得到的工作液浓度为1.3μg/ml。
[0049]
吖啶酯标记的asc检测抗体，母液的浓度为1.3mg/ml，稀释4000倍得到的工作液浓度为0.33μg/ml。
[0050]
校准品的asc浓度分别为0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml。
[0051]
稀释液为tris缓冲液，其成分为50mmtris、150mm nacl，ph值为7.4；
[0052]
清洗液为添加了体积分数为0.05％的tween-20的tris缓冲液；
[0053]
预激发液的成分为0.2m naoh溶液；
[0054]
激发液的成分为0.06％h2o2。
[0055]
实施例2测量人血清样品中asc含量的磁微粒全自动化学发光免疫分析试剂盒的使用方法
[0056]
取20μl校准品或样本和50μl的fitc标记的asc抗体、50μl的吖啶酯标记的asc检测抗体混匀反应，37℃孵育30分钟；再加入50μl的包被fitc抗体的磁微粒，37℃继续孵育20分
钟；经过清洗磁分离弃去上清；加入0.06％过氧化氢溶液和0.2m的氢氧化钠溶液各100μl，读取相对发光值(rlu)。asc浓度与rlu成一定的比例关系，测定仪拟合计算asc浓度。
[0057]
实施例3校准曲线的制备
[0058]
按照实施例2的步骤，分别添加不同浓度的校准品，校准品的浓度分别为0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml。其余步骤均同实施例2。根据校准品测定的相对发光值，利用统计学绘图软件根据测定的值绘制校准曲线，横坐标为待测样品中asc蛋白的浓度，纵坐标为相对发光值；测得校准曲线的线性拟合方程为：y＝44449x 4947.3，其中，y为样品孔的相对发光值，x为血清中asc蛋白的浓度(ng/ml)。校准曲线如图1所示，r-square(即校准曲线的回归系数)为0.9962。
[0059]
实施例4利用以血清标记物asc为缺血性卒中标志物的磁微粒全自动化学发光免疫分析试剂盒检测临床样品
[0060]
收集血液样本并按照常规血清分离方法处理，得到血清。按照实施例1所述的检测方法，对缺血性卒中患者血清样本(n＝101)，正常个体血清样品(n＝214)进行检测对照。检测结果如下表1。
[0061]
表1：214份正常样本测定的asc值
[0062]
[0063][0064]
表2：101份缺血性卒中患者中测定asc值
[0065]
[0066][0067]
对该检测结果进行利用软件spass16.0进行如下的统计学分析。
[0068]
最佳诊断界限值(cut off值)的确定：
[0069]
根据统计结果中各可能切点的灵敏度和特异度，计算youden指数，并选择其最大的切点为临界点，结果如下表。
[0070]
表3：阳性和阴性样本测定值的统计分析
[0071][0072]
因此，确定血清中asc含量≥0.29ng/ml为asc的受试者工作特征曲线(roc)上的最佳临界点，即cut off值(如图2所示)。asc含量诊断缺血性卒中的灵敏度为80.20％，特异度为71.03％。
[0073]
asc在缺血性卒中患者及正常人群血清中的差异：根据实施例1检测出的浓度比较如图2所示。浓度均值(正常个体)＝0.29ng/ml，浓度均值(缺血性卒中)＝0.78ng/ml，利用t检验，p＜0.0001，asc在缺血性卒中患者血清中含量高于正常个体，具有统计学差异(图3)。
[0074]
实施例5测量人血清样品中asc含量的磁微粒全自动化学发光免疫分析试剂盒的健全性
[0075]
健全性(validity)是免疫分析可靠性指标之一。免疫化学分析原则上要求校准试剂与被测物质的免疫化学性质相同，即使两者之间的结构有些差异，而它们的剂量-反应曲线不互相偏离平行。一般采用含被测物质的高值血清，按一定的比例稀释，然后测定其含量。如果稀释倍数与含量呈线性关系，那么这个分析具有良好的健全性。健全性好坏可以证明未知杂质或被测样品中是否存在交叉反应物质。
[0076]
本实施的健全性实验，采取asc高值样本，既95号缺血性卒中患者血清样本(asc＝4.45ng/ml)。另取asc近似0值的样本，既167号正常个体血清样品(asc＝0.05ng/ml)，按照以下比例稀释asc高值样本95号，配制得到系列稀释浓度的样本，使用本发明磁微粒全自动化学发光asc免疫分析试剂盒测定其asc含量。检测结果如下表4和图4。
[0077]
结果显示：稀释倍数与含量呈线性关系，相关性数为0.998，表明这个分析具有良好的健全性。
[0078]
表4：本发明试剂盒的健全性
[0079][0080]
实施例6利用以血清标记物asc和s100b为缺血性卒中标志物的比较
[0081]
对于50例缺血性卒中患者及49例正常人群血清，分别以s100b试剂盒测定血清中s100b和本发明试剂盒测定asc。结果如下表：
[0082]
表5：本发明试剂盒与s100b标志物试剂盒样本检测定值
[0083]
[0084][0085]
分别统计这99例样本测定数据，分析s100b和asc的roc曲线，如下表：
[0086]
表6：本发明试剂盒与s100b标志物试剂盒测定结果统计分析
[0087][0088]
asc的auc面积是0.7151，大于s100b的auc面积0.6831；这表明相对于s100b，asc区分缺血性卒中和正常人群更具优势。
[0089]
在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0090]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
[0091]
本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺
步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。