一种补气养血活性评价模型的建立方法与流程

1.本发明涉及一种补气养血活性评价模型的建立方法，并通过复方阿胶浆及其不同配伍的中药提取液验证该模型，属于中医药技术领域。


背景技术：

2.中药是一个成份复杂的体系，具有多效应、多成分、多靶点的作用特性，通常以有效部位、提取物甚至水煎剂为研究对象，且部分成分需在体内转化才能发挥药理活性。目前对中药活性评价通常采用体外细胞或大鼠、小鼠等模式生物。体外细胞模型评价对环境要求较高，而且不能反映体内细胞的自然环境。这些缺陷限制了细胞筛选体系的应用。采用大鼠、小鼠等模式生物进行实验时，由于实验动物数量多、体型较大、占用空间、饲养不方便、实验周期长、观察不直接、难以同时满足对大量样品的活性和毒性评价、需要进行解剖才能观察器官生长情况，同样也存在诸多不便。近年来，随着动物实验3r原则(reduction，refinement，replacement)的提出，各国对实验动物的使用进行了管制，更加限制了这些传统模式动物的大规模使用。
3.因此，有必要以一种新的模式生物弥补细胞培养和传统模式动物的不足。近年来，斑马鱼被越来越多的应用于中药活性和毒性研究。作为目前唯一适合高内涵、高通量、微孔板的脊椎动物模型，与常见的实验动物如大鼠、小鼠、兔子等相比，斑马鱼繁殖周期短，产卵数多，胚胎发育迅速，24h可完成体内器官的构建，且胚胎透明易于观察，适用于大规模的药物筛选。斑马鱼与人类基因具有同源性，可达87％。目前，不少学者证实斑马鱼活体动物实验比细胞实验准确率高，可以应用于化合物对复杂生命过程的影响观察，能更直观地评价药效、药毒等。在中医药研究中，斑马鱼模型发挥着重要作用。与细胞相比，斑马鱼对成分复杂的中药样品具有很好的适应性，可用于中药或方剂等复杂成分体系的药效评价及机制研究。
4.目前，斑马鱼被广泛用于心血管药物、调节血脂、保护肝功能、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗炎等多种活性药物的筛选和评价。近年来，对斑马鱼的应用也逐渐扩展到中药领域，研究对象包括传统的单味中药、中药复方、中成药。然而，由于中医证型复杂，有时仅凭单一的斑马鱼模型很难评价复杂中药体系的药效活性。以气血两虚证为例，中医认为气血是人体一切生命活动的物质基础，气血相互依存，相互滋生，两者在生理和病理上相互影响因果，研究时不能将两者完全区分开。关于气血两虚证的物质基础研究，中西医对于血的理解都是循行于经脉中的血液。“血虚”和“贫血”在概念上都是血液的减少；而中医学的“气”具有护卫肌表、抵御外邪侵入和驱除身体病邪的作用，与西医学的“免疫功能”相吻合。目前的研究也基本证实了血虚证和气虚证与机体造血功能和免疫功能有着密切的关系。
5.复方阿胶浆(fej)源自明代《景岳全书》中“两仪膏”，由动物药阿胶和四味植物药红参、熟地黄、党参、山楂组成。方中阿胶补血养血，为君药(a)；红参大补元气，熟地益精填髓，二者共为臣药(b)；党参补中益气，山楂活血行气，二者共为佐使药(c)。诸药合用，具有补气养血的功效。临床广泛用于气血两虚，头晕目眩，心悸失眠，食欲不振、白细胞减少症和
贫血等症，常用于癌症患者的治疗，能改善恶性肿瘤患者癌因性疲乏状态和体质。
6.针对斑马鱼在中药研究中的独特优势和复方阿胶浆的补气养血功效，本发明提供一种补气养血活性评价模型的建立方法，并通过复方阿胶浆及其不同配伍的中药提取液验证模型。其中，养血活性评价模型包括斑马鱼节间血管生成模型、斑马鱼红细胞生成模型，以斑马鱼节间血管面积、血红蛋白水平为评价指标；补气活性评价模型包括斑马鱼免疫细胞生成模型，以斑马鱼免疫细胞数量为评价指标。并以复方阿胶浆中不同配伍组合提取液(a、b、c、a b、a c、b c)验证该模型。本发明首次建立斑马鱼补气养血活性评价模型，具有快速、稳定可靠和重复性好的优点。


技术实现要素：

7.发明目的：本发明的目的是建立一种补气养血活性评价模型，并通过复方阿胶浆及其不同配伍的中药提取液验证该模型。为达到以上目的，本发明结合斑马鱼，建立斑马鱼节间血管生成模型、斑马鱼红细胞生成模型和斑马鱼免疫细胞生成模型，并通过复方阿胶浆及不同配伍的中药提取液的活性差异验证该模型的可靠性。本方法具有易于观察、快速、直接、真实准确等优势。
8.术语说明：尾静脉网对应的节间血管区域平均面积(intersegmental vessels average area，iaa)：是指泄殖孔画垂直后主动脉(da)的直线，直线尾尖侧的部分中，以da为界，背侧为节间血管(intersegmental vessels，isv)区。图1中实线圈定的范围为iaa，箭头所指为isv。
9.腹部卵黄囊区域铁锈色沉淀平均积分光密度(rust
‑
colored precipitates integrated optical density，rpi)：是指仰面体位下幼鱼卵黄囊部位的铁锈色沉淀区域。图2中实线圈定的范围为卵黄囊，箭头所指为rpi。
10.尾部区域免疫细胞平均积分光密度(immune cells integrated optical density，ici)；是指泄殖孔画垂直da的直线，直线至尾尖侧的部分中，为ici区。图3中实线圈定的范围为ici。
11.hpf(hours post fertilization)：生物学专用术语，指受精后的时间。如24hpf指受精后24小时的胚胎。
12.dpf(days post fertilization)：生物学专用术语，指受精后的天数。如1dpf指受精后1天的胚胎。
13.本发明的技术方案如下：(1)建立斑马鱼节间血管生成模型；(2)建立斑马鱼红细胞生成模型；(3)建立斑马鱼免疫细胞生成模型；(4)通过复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液的活性差异验证斑马鱼节间血管生成模型、斑马鱼红细胞生成模型以及斑马鱼免疫细胞生成模型的可靠性。
14.本发明所述建立斑马鱼节间血管生成模型，步骤如下：(1)将受精后20
‑
24h的发育正常的斑马鱼胚胎移入培养孔中，设立空白溶剂对照组(ctrl)、ptk787模型组(ptk787)及复方阿胶浆给药组(fej)；(2)麻醉孵育后的ctrl组、ptk787组、fej组的每条斑马鱼，采集每条斑马鱼的荧光
显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况；(3)定量分析：测量每组斑马鱼的尾静脉网对应的iaa，以表示，分析比较各组差异的显著性；当ctrl组斑马鱼的大于ptk787组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明造模成功；当fej组斑马鱼的大于ptk787组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明该浓度的fej对斑马鱼的血管生成具有促进作用。
15.根据本发明优选的，所述斑马鱼胚胎为血管荧光标记的转基因斑马鱼胚胎。血管荧光标记的转基因斑马鱼胚胎可采用本领域普通市售产品，本发明采用的血管荧光转基因斑马鱼tg(flk:egfp)，由山东省科学院斑马鱼药物筛选中心提供。
16.根据发明优选的，斑马鱼节间血管生成模型所用斑马鱼胚胎为20
‑
24h的斑马鱼胚胎，最为优选的，斑马鱼胚胎为20hpf的斑马鱼胚胎。20
‑
24hpf的斑马鱼幼鱼尾部血管网尚未形成，为理想的给药时间，发育至48hpf及以后观察结果。
17.根据本发明优选的，斑马鱼节间血管生成模型所述的给药方式为将斑马鱼幼鱼不间断浸泡在药液中，直至观察结果。
18.根据本发明优选的，斑马鱼节间血管生成模型中ctrl组、ptk787组、fej组每组斑马鱼胚胎总数不少于6枚，孵育温度为26℃
‑
30℃，优选的，孵育温度为28℃；明暗交替培养，光照14h避光10h，孵育时间为1天
‑
1天23h。
19.根据本发明优选的，斑马鱼节间血管生成模型中ptk787组造模药ptk787的浓度为0.15μg
·
ml
‑1‑
0.20μg
·
ml
‑1，优选的，ptk787的浓度为0.15μg
·
ml
‑1；fej组给药浓度为0.10μl
·
ml
‑1‑
0.30μl
·
ml
‑1。
20.根据本发明优选的，斑马鱼节间血管生成模型中斑马鱼的麻醉采用浓度为0.3
‰
的三卡因浸泡40
‑
90s进行麻醉。
21.根据本发明优选的，斑马鱼节间血管生成模型中采集图像为斑马鱼幼鱼固定侧面体位，在荧光显微镜下观察拍照，获得斑马鱼幼鱼侧位图像；采集的图像是在同一放大倍数下获得，图像格式为.jpg格式。
22.根据本发明优选的，斑马鱼节间血管生成模型中测量面积方法为，利用图像处理软件photoshop cc14.0
×
32对采集图像进行测量，得到准确的像素。
23.血管新生是涉及多种细胞如内皮细胞和血管平滑肌细胞的多步骤复杂生物过程，是相关细胞因子、细胞外基质与细胞之间相互作用的结果。在缺血刺激下，新的血管会逐渐生成达到改善缺血的目的。中医理论认为，气为血之帅，血为气之母；气能生血，血能载气。气血不足，运行不畅，淤血凝滞，脉络失去濡养，导致营养代谢失衡。益气补血药可增强五脏之气血，为血管新生提供保障。fej在临床上主要用于治疗气血两虚证，具有补气养血的功效，且治疗效果显著，因此可以采用血管生成模型评价fej的补气养血疗效。
24.isv是斑马鱼血管生成的评价指标，可以推测药物对血管生成的影响。当药物具有抑制血管生成的作用时，isv会出现数量缺失、长度缩短、发育畸形等现象；当药物具有促进血管生成的作用时，可以逆转isv数量缺失、长度缩短、发育畸形等现象。
25.本发明所述建立斑马鱼红细胞生成模型，步骤如下：(1)将发育正常的斑马鱼胚胎移入培养孔中，设立空白溶剂对照组(ctrl)、苯肼模
型组(phz)及复方阿胶浆给药组(fej)；(2)采用邻联茴香胺染色法对孵育后的ctrl组、phz组和fej组的每条斑马鱼进行染色并固定，采集每条斑马鱼的显微图像，记录斑马鱼腹部卵黄囊铁锈色沉淀情况；(3)定量分析：测量每组斑马鱼的对应rpi，以表示，分析比较各组差异的显著性；当ctrl组斑马鱼的大于phz组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明造模成功；当fej组斑马鱼的大于phz组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明该浓度fej对斑马鱼的红细胞生成具有促进作用；
26.根据本发明优选的，斑马鱼红细胞生成模型所述斑马鱼胚胎为野生型ab系斑马鱼胚胎，可采用本领域普通市售产品。本发明中所用的野生型ab系斑马鱼胚胎由山东省科学院斑马鱼药物筛选中心提供。
27.根据发明优选的，斑马鱼红细胞生成模型中斑马鱼胚胎为2
‑
4dpf的斑马鱼胚胎，最为优选的，斑马鱼幼鱼为2dpf的斑马鱼幼鱼。
28.根据本发明优选的，斑马鱼红细胞生成模型中，所述的给药方式为将斑马鱼幼鱼不间断浸泡在药液中，直至观察结果。
29.根据本发明优选的，ctrl组、phz组、fej组每组斑马鱼胚胎总数不少于6枚，孵育温度为26℃
‑
30℃，优选的，孵育温度为28℃；明暗交替培养，光照14h避光10h，孵育时间为1天
‑
1天23h。
30.根据本发明优选的，斑马鱼红细胞生成模型中phz组造模药浓度为0.10μg
·
ml
‑1‑
0.40μg
·
ml
‑1，优选的，phz的浓度为0.175μg
·
ml
‑1；fej组给药浓度为0.10μl
·
ml
‑1‑
0.30μl
·
ml
‑1。
31.根据本发明优选的，斑马鱼红细胞生成模型中邻联茴香胺染色液浓度为0.6mg
·
ml
‑1‑
1.4mg
·
ml
‑1，优选的，邻联茴香胺染色液的浓度为1.0mg
·
ml
‑1；多聚甲醛固定液的浓度为0.4％。
32.根据本发明优选的，斑马鱼红细胞生成模型中采集图像为斑马鱼幼鱼固定仰面体位，在显微镜下观察拍照，获得斑马鱼卵黄囊图像；采集的图像是在同一放大倍数下获得，图像格式为.jpg格式。
33.根据本发明优选的，斑马鱼红细胞生成模型中测量面积的方法为，利用图像处理软件image
‑
proa plus version 6.0对采集图像进行测量，得到rpi。
34.贫血或血红蛋白降低，通常以红细胞数量减少为特征。血红蛋白在联苯茴香胺和过氧化氢的体系中可以催化其反应在血红蛋白表面形成铁锈色沉淀，沉淀的面积和颜色的深浅可以用来指示斑马鱼体内血红蛋白的含量，进一步反映红细胞数量，可用来判断药物对红细胞的影响。fej临床上常用于治疗血虚证。因此可以通过该方法评价fej对贫血的治疗效果。
35.本发明所述建立斑马鱼免疫细胞生成模型，步骤如下：(1)将发育正常的斑马鱼胚胎移入培养孔中，设立空白溶剂对照组(ctrl)、长春瑞滨模型组(nvb)及复方阿胶浆给药组(fej)；(2)麻醉孵育后的ctrl组、nvb组和fej组的每条斑马鱼，采集每条斑马鱼的荧光显微图像，记录斑马鱼尾部免疫细胞荧光情况；
(3)定量分析：测量每组斑马鱼尾部免疫细胞对应的ici，以表示，分析比较各组差异的显著性；当ctrl组斑马鱼的大于nvb组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明造模成功；当fej组斑马鱼的大于nvb组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明该浓度fej对斑马鱼的免疫细胞生成具有促进作用。
36.根据本发明优选的，斑马鱼免疫细胞生成模型所述斑马鱼胚胎为免疫细胞荧光标记的转基因斑马鱼胚胎。免疫细胞荧光标记的转基因斑马鱼胚胎可采用本领域普通市售产品，本发明中采用的免疫细胞荧光转基因斑马鱼为tg(lyz:dsred2)，由山东省科学院斑马鱼药物筛选中心提供。
37.根据发明优选的，斑马鱼免疫细胞生成模型中，所用的斑马鱼胚胎为48hpf的斑马鱼胚胎。
38.根据本发明优选的，斑马鱼免疫细胞生成模型中，所述的给药方式为将斑马鱼幼鱼不间断浸泡在药液中，直至观察结果。
39.根据本发明优选的，ctrl组、nvb组和fej组每组斑马鱼胚胎总数不少于6枚，孵育温度为26℃
‑
30℃，优选的，孵育温度为28℃；明暗交替培养，光照14h避光10h，孵育时间为1天
‑
1天23h。
40.根据本发明优选的，斑马鱼免疫细胞生成模型中造模药nvb的浓度为140μg
·
ml
‑1‑
160μg
·
ml
‑1，优选的，nvb的浓度为150μg
·
ml
‑1；fej组给药浓度为0.10μg
·
ml
‑1‑
0.30μg
·
ml
‑1。
41.根据本发明优选的，斑马鱼免疫细胞生成模型中斑马鱼的麻醉采用浓度为0.3
‰
的三卡因浸泡40
‑
90s进行麻醉。
42.根据本发明优选的，斑马鱼免疫细胞生成模型中采集图像为斑马鱼幼鱼固定侧面体位，在荧光显微镜下观察拍照，获得斑马鱼幼鱼侧位图像；采集的图像是在同一放大倍数下获得，图像格式为.jpg格式。
43.根据本发明优选的，斑马鱼免疫细胞生成模型中测量面积方法为，利用图像处理软件plus version 6.0对采集图像进行测量，得到ici。
44.nvb是一种半合成长春花生物碱，具有光谱抗肿瘤活性，目前临床上用于治疗晚期乳腺癌和晚期/转移性非小细胞肺癌。然而，与其他大部分化疗药物一样，nvb具有严重的副作用，如粒细胞减少等，严重限制了在临床上的使用剂量。提示nvb可用于免疫损伤模型的构建。中医学的“气”有护卫肌表，防御外邪入侵和驱除体内病邪的作用，与现代医学的“免疫功能”的作用相吻合。因此可以认为nvb会导致“气虚证”。fej临床上常用于治疗气虚证。因此可以采用斑马鱼免疫细胞生成模型评价fej的补气功效。
45.斑马鱼的免疫细胞类型和形态与人类相同，其先天免疫细胞中的巨噬细胞和中性粒细胞的功能与哺乳动物高度保守。其单核巨噬细胞最早在22hpf产生于卵黄囊，成熟的中性粒细胞在34hpf出现。二者在对斑马鱼免疫功能的发挥有重要作用。
46.本发明通过复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液的活性差异验证斑马鱼节间血管生成模型、斑马鱼红细胞生成模型、斑马鱼免疫细胞生成模型的可靠性，步骤如下：(1)不同配伍组合的中药提取液的制备：本发明所述的不同配伍组合的中药提取
液可通过本领域已知的方法制备，例如，制备方法包括烊化和回流提取。阿胶采用烊化的方式，即将适量阿胶放入温水或药材提取液中溶化。其他四味中药材采用回流提取的方式，首先将药材提前浸泡，然后用纯水回流提取，将浸出液浓缩；具体地，浸泡时间≥30min，回流提取次数≥3次，每次回流提取时长≥40min，每次提取使用的水的体积为中药材质量的2
‑
5倍；(2)通过复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液验证斑马鱼节间血管生成模型：
①
将受精后20
‑
24h的发育正常的斑马鱼幼鱼移入培养孔中，设立空白溶剂对照组(ctrl)、ptk787模型组及a组、b组、c组、a b组、a c组、b c组和fej组，实验条件参考“斑马鱼节间血管生成模型”；
②
麻醉孵育后的ctrl组、ptk787组、a组、b组、c组、a b组、a c组、b c组和fej组的每条斑马鱼，采集每条斑马鱼的荧光显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况；
③
定量分析：测量每组斑马鱼的尾静脉网对应的iaa，以表示，分析比较各组差异的显著性；当ctrl组斑马鱼的大于ptk787组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明造模成功；当不同配伍组合的中药提取液组(或fej组)斑马鱼的大于ptk787组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明该中药提取物对斑马鱼的血管生成具有促进作用；(3)通过复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液验证斑马鱼红细胞生成模型：
①
将发育正常的斑马鱼幼鱼移入培养孔中，设立空白溶剂对照组(ctrl)、phz组及a组、b组、c组、a b组、a c组、b c组和fej组，实验条件参考“斑马鱼红细胞生成模型”；
②
采用邻联茴香胺染色法对孵育后的ctrl组、phz组、a组、b组、c组、a b组、a c组、b c组和fej组的每条斑马鱼进行染色并固定，采集每条斑马鱼的显微图像，记录斑马鱼腹部卵黄囊铁锈色沉淀情况；
③
定量分析：测量每组斑马鱼的尾静脉网对应的rpi，以表示，分析比较各组差异的显著性；当ctrl组斑马鱼的大于phz组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明造模成功；当不同配伍组合的中药提取液组(或fej组)斑马鱼的大于phz组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明该中药提取物对斑马鱼的红细胞生成具有促进作用；(4)通过复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液的补气活性差异验证斑马鱼免疫细胞生成模型：
①
将发育正常的斑马鱼幼鱼移入培养孔中，设立空白溶剂对照组(ctrl)、nvb组及a组、b组、c组、a b组、a c组、b c组和fej组，实验条件参考“斑马鱼免疫细胞生成模型”；
②
麻醉孵育后的ctrl组、nvb组、a组、b组、c组、a b组、a c组、b c组和fej组的每条斑马鱼，采集每条斑马鱼的荧光显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况；
③
定量分析：测量每组斑马鱼的尾静脉网对应的ici，以表示，分析比较各组差异的显著性；当ctrl组斑马鱼的大于nvb组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明造模成功；当不同配伍组合的中药提取液组(或fej组)斑马鱼的
大于nvb组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明该中药提取物对斑马鱼的免疫细胞生成具有促进作用。
47.根据发明优选的，复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液的给药浓度为0.1μl
·
ml
‑1‑
0.3μl
·
ml
‑1，最为优选的，给药浓度为0.2μl
·
ml
‑1。其他实验条件与各模型建立的条件相同。
48.与现有技术相比，本发明的优点是：1.本发明建立的斑马鱼节间血管模型，以斑马鱼节间血管面积(iaa)作为斑马鱼血管生成的评价指标，比以往常用的以节间血管长度为评价指标，统计面积能将血管宽度也纳入统计范围，使结果更加科学、客观，提高了准确性；2.本发明建立了斑马鱼红细胞生成模型。以往以苯肼为诱发斑马鱼血栓模型，并对斑马鱼尾静脉血流及血栓情况进行定性分析。本模型将苯肼用于贫血模型的建立，并以斑马鱼卵黄囊铁锈色沉淀面积作为活性评价指标。建立的方法具有稳定可靠、重复性好的优点；卵黄囊区面积大，利用其轮廓计算rpi，不局限于观察斑马鱼单侧的染色面积，受个体差异影响较小，实施更方便、更简单；3.本发明建立的斑马鱼免疫细胞生成模型，以斑马鱼尾部免疫细胞光密度(ici)为评价指标。与以往采用的统计尾部免疫细胞数量的方法相比，这种统计方法可以弥补免疫细胞数量聚集时，无法数清具体数量的不足，使统计结果更加科学、客观；4.本发明通过复方阿胶浆以及不同配伍组合的中药提取液的活性差异验证了斑马鱼补气养血活性评价模型的稳定可靠；建立的斑马鱼节间血管生成模型、斑马鱼红细胞生成模型和斑马鱼免疫细胞生成模型，也可用于具有补气活性、养血活性的中药或中药复方的活性评价，适用范围广。
附图说明
49.图1为正常斑马鱼节间血管区域的荧光图片；图中实线圈定的范围为节间血管区域；箭头所指为节间血管。
50.图2为正常斑马鱼卵黄囊区域的白光图片；图中实线圈定的范围为卵黄囊区域；箭头所指为铁锈色沉淀。
51.图3为正常斑马鱼尾部区域的荧光图片；图中实线圈定范围为免疫细胞荧光区域；箭头所指为免疫细胞。
52.图4为斑马鱼节间血管生成的荧光照片，并以不同剂量的fej考察血管生成活性；图中实线圈定的范围为节间血管区域；箭头所指为节间血管。
53.图5为不同剂量fej对斑马鱼节间血管生成作用的影响。
54.图6为斑马鱼红细胞生成的白光照片，并以不同剂量的fej考察红细胞生成活性；图中实线圈定的范围为卵黄囊区域；箭头所指为铁锈色沉淀。
55.图7为不同剂量fej对斑马鱼红细胞生成作用的影响。
56.图8为斑马鱼免疫细胞生成的荧光图片，并以不同剂量的fej考察免疫细胞生成活性；图中实线圈定范围为免疫细胞荧光区域；箭头所指为免疫细胞。
57.图9为不同剂量fej对斑马鱼免疫细胞生成作用的影响。
58.图10为不同配伍组合的中药提取液以及fej对斑马鱼节间血管生成作用的荧光图
片；图中实线圈定的范围为节间血管区域；箭头所指为节间血管。
59.图11为不同配伍组合的中药提取液以及fej对斑马鱼节间血管生成作用的影响。
60.图12为不同配伍组合的中药提取液以及fej对斑马鱼红细胞生成作用的白光图片；图中实线圈定的范围为卵黄囊区域；箭头所指为铁锈色沉淀。
61.图13为不同配伍组合的中药提取液以及fej对斑马鱼红细胞生成作用的影响。
62.图14为不同配伍组合的中药提取液以及fej对斑马鱼免疫细胞生成作用的荧光图片；图中实线圈定范围为免疫细胞荧光区域；箭头所指为免疫细胞。
63.图15为不同配伍组合的中药提取液以及fej对斑马鱼免疫细胞生成作用的影响。
具体实施方式
64.下面结合实施例及附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
65.一种补气养血活性评价模型的建立方法，并通过fej及不同配伍组合的提取液验证该模型。该方法包括建立斑马鱼节间血管生成模型、建立斑马鱼红细胞生成模型、建立斑马鱼免疫细胞生成模型、采用复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液验证模型的稳定性和可靠性。
66.具体内容如下：实施例中所用的实验动物包括：血管荧光标记的转基因斑马鱼tg(flk:egfp)、野生型ab系斑马鱼和免疫细胞荧光标记的转基因斑马鱼tg(lyz:dsred2)，由山东省科学院斑马鱼药物筛选中心提供。雌雄鱼在照明14h/黑暗10h，28℃标准条件下分开饲养，定时喂以颗粒状饵料和丰年虾。用卵时，取健康性成熟的斑马鱼，按照雌雄1:1或1:2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其产卵，半小时后将成鱼捞出，使排卵时间控制在半个小时内，次日9
‑
10时获得并收集受精卵。
67.实施例中所用的中成药及中药材均为东阿阿胶股份有限公司提供，其中，fej批号为1905075，阿胶、熟地、红参、党参、山楂均为生产此批fej所用的原料。其他原料均为常规市购产品，其中，ptk787购自sigma公司，cas号为212141
‑
51
‑
0，用二甲基亚砜配制；phz购自sigma公司，cas号为100
‑
63
‑
0，用乙醇配制；nvb购自solarbio公司，cas号为125317
‑
39
‑
7，用二甲基亚砜配制。
68.本发明所述建立斑马鱼节间血管生成模型，方法如下：(1)对收集的受精卵进行消毒和清洗，移入斑马鱼胚胎培养用水中，于28℃培养箱中培养。为减少斑马鱼体内黑色素对荧光定量的影响，需在收集鱼卵后加入适量n
‑
苯基硫脲以抑制黑色素的生成。将受精后20h的发育正常斑马鱼胚胎在体式显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，采用链酶蛋白酶pronase e溶液1mg
·
ml
‑1除去绒毛膜，移入24孔培养板中，每孔10枚。用斑马鱼培养水配制适量0.15μg
·
ml
‑1的ptk787溶液，用于ptk787组幼鱼孵育；用斑马鱼培养水配制适量含有0.15μg
·
ml
‑1的ptk787、0.10μl
·
ml
‑1(或0.20μl
·
ml
‑1、0.30μl
·
ml
‑1)fej溶液，用于fej组幼鱼孵育；设置0.5％dmso为ctrl组；(2)在斑马鱼幼鱼48hpf时(即斑马鱼幼鱼给药后继续发育1天)，将斑马鱼用质量浓度为0.3
‰
的三卡因麻醉1min，然后固定斑马鱼幼鱼于侧面体位，在荧光显微镜下观察，拍照，获得斑马鱼幼鱼荧光显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况；
(3)定量分析：利用图像处理软件photoshop cc14.0
×
32对每组斑马鱼荧光显微图像的iaa进行统计，以表示，分析比较ctrl组、ptk787组、fej组的差异显著性；(4)当ctrl组的大于ptk787组的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明此剂量的ptk787可对isv造成损伤；当fej组的大于ptk787组的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明此剂量的fej可以逆转ptk787对isv造成的损伤。结果如表1所示：(5)表1：不同剂量fej对斑马鱼节间血管生成促进作用的影响(6)实验结果显示，ptk787造模组尾部节间血管区域的血管面积及荧光强度明显降低(p＜0.001)，说明ptk787影响了斑马鱼体内的节间血管的生成和发育。随着不同剂量的fej的加入，节间血管的面积逐渐增加，且随着fej浓度的增加，节间血管面积也增加，呈现出明显的剂量依赖性，说明复方阿胶浆对ptk787造成的血管损伤具有恢复作用(p＜0.05)。
69.本发明所述建立斑马鱼红细胞生成模型，方法如下：(1)对收集的受精卵进行消毒和清洗，移入斑马鱼胚胎培养用水中，于28℃培养箱中培养。为减少斑马鱼体内黑色素对荧光定量的影响，需在收集鱼卵后加入适量n
‑
苯基硫脲以抑制黑色素的生成。将受精后48h的发育正常斑马鱼幼鱼在体式显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，采用链酶蛋白酶pronase e溶液1mg
·
ml
‑1除去绒毛膜，移入24孔培养板中，每孔10枚。用斑马鱼培养水配制适量0.175μg
·
ml
‑1的phz溶液，用于phz组幼鱼孵育；用斑马鱼培养水配制适量含有0.175μg
·
ml
‑1的phz、0.10μl
·
ml
‑1(或0.20μl
·
ml
‑1、0.30μl
·
ml
‑1)fej溶液，用于fej组幼鱼孵育；设置0.1％无水乙醇为ctrl组；(2)在斑马鱼幼鱼72hpf时(即斑马鱼幼鱼给药后继续发育1天)，将斑马鱼采用邻联茴香胺染色法对各实验组斑马鱼红细胞进行染色，锡纸包裹染色15min后，用斑马鱼培养水冲洗三次，洗去多余染液，使用组织固定液固定后，在显微镜下观察斑马鱼红细胞集中区域，然后固定斑马鱼幼鱼于仰面体位并拍照。(1mg
·
ml
‑1邻联茴香胺染液配置方法：精密称取邻联茴香胺50mg、醋酸钠41mg，置于50ml棕色容量瓶中，加30％的过氧化氢溶液1.1ml，最后用40％的乙醇定容。)(3)定量分析：利用图像处理软件plus version 6.0对每组斑马鱼显微图像的rpi进行统计，以表示，分析比较ctrl组、phz组、fej组的差异显著性；(4)当ctrl组的大于phz组的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明此剂量的phz可对红细胞造成损伤；当fej组的大于phz组的且达到
统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明此剂量的fej可以逆转phz对红细胞造成的损伤。结果如表2所示：(5)表2：不同剂量fej对斑马鱼红细胞生成促进作用的影响(6)实验结果显示，phz造模组卵黄囊区域铁锈色沉淀面积明显降低，颜色明显变浅(p
‑
value＜0.0001)，说明苯肼影响了斑马鱼体内的红细胞生成和发育。随着不同剂量的fej的加入，铁锈色沉淀的面积和颜色深度逐渐增加，且随着fej浓度的增加，铁锈色沉淀的面积和颜色深度也增加，呈现出明显的剂量依赖性，说明复方阿胶浆对phz造成的溶血性贫血具有恢复作用(p＜0.05)。
70.本发明所述建立斑马鱼免疫细胞生成模型，方法如下：(1)对收集的受精卵进行消毒和清洗，移入斑马鱼胚胎培养用水中，于28℃培养箱中培养。为减少斑马鱼体内黑色素对荧光定量的影响，需在收集鱼卵后加入n
‑
苯基硫脲以抑制黑色素的生成。将受精后48h的发育正常斑马鱼胚胎在体式显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，采用链酶蛋白酶pronase e溶液1mg
·
ml
‑1除去绒毛膜，移入24孔培养板中，每孔10枚。用斑马鱼培养水配制适量150μg
·
ml
‑1的nvb溶液，用于nvb组幼鱼孵育；用斑马鱼培养水配制适量含有150μg
·
ml
‑1的nvb、0.10μl
·
ml
‑1(或0.20μl
·
ml
‑1、0.30μl
·
ml
‑1)溶液，用于fej组幼鱼孵育；设置0.5％dmso为ctrl组；(2)在斑马鱼幼鱼72hpf时(即斑马鱼幼鱼给药后继续发育1天)，将斑马鱼用质量浓度为0.3
‰
的三卡因麻醉1min，然后固定斑马鱼幼鱼于侧面体位，在荧光显微镜下观察，拍照，获得斑马鱼幼鱼荧光显微图像，记录斑马鱼尾部免疫细胞荧光情况；(3)定量分析：利用图像处理软件plus version 6.0对每组斑马鱼显微图像的ici进行统计，以表示，分析比较ctrl组、nvb组、fej组的差异显著性；(4)当ctrl组的大于nvb组的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明此剂量的nvb可对免疫细胞造成损伤；当fej组的大于nvb组的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明此剂量的fej可以逆转nvb对免疫细胞造成的损伤。结果如表3所示：(5)表3：不同剂量fej对斑马鱼免疫细胞生成促进作用的影响
(6)实验结果显示，nvb造模组尾部免疫细胞的数量及荧光强度明显降低(p＜0.01)，说明nvb影响了斑马鱼体内免疫细胞的发育，在一定程度上损伤了斑马鱼的免疫系统。随着不同剂量的fej的加入，免疫细胞的数目逐渐增加，且随着fej浓度的增加，免疫细胞的数量也增多，呈现出明显的剂量依赖性，说明复方阿胶浆对nvb造成的免疫损伤具有恢复作用(p＜0.05)。
71.本发明通过复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液的活性差异验证斑马鱼节间血管生成模型、斑马鱼红细胞生成、斑马鱼免疫细胞生成模型，具体方法如下。
72.(1)不同配伍组合的中药提取液的制备方法为：共制备a、b、c、a b、a c、b c共6种中药提取液，以fej(1905075)的相对密度为指标控制各提取液的浓度。参考中国药典2020版0601相对密度测定法，在20℃时测定fej的相对密度ρ
相对
：用天平称出干燥空瓶子的质量m1(g)；在瓶子中灌满fej，塞上瓶塞，用滤纸擦干瓶子表面，再称其质量m2(g)；将瓶子中的液体倒出，并用清水清洗干净，将空瓶中灌满水，塞上瓶塞并擦干瓶子表面，称其质量m3。根据下式计算，20℃时fej相对于水的密度为ρ
相对
＝1.09；ρ
相对
＝(m2‑
m1)/(m3‑
m1)具体制备方法，包括以下内容：
①
a：将适量阿胶块放置在烧杯中，加入适量纯净水，与80℃水浴锅上加热搅拌至阿胶块完全烊化，并浓缩至相对密度1.09；
②
b：称取适量熟地、红参，浸泡30min后，分别5倍量、3倍量、2倍量体积的纯净水，煮沸并回流提取90min、60min、40min，合并水煎液并浓缩至相对密度1.09；
③
c：称取适量党参、山楂，浸泡30min后，分别5倍量、3倍量、2倍量体积的纯净水，煮沸并回流提取90min、60min、40min，合并水煎液并浓缩至相对密度1.09；
④
a b：称取适量熟地、红参，浸泡30min后，分别5倍量、3倍量、2倍量体积的纯净水，煮沸并回流提取90min、60min、40min，合并水煎液；将适量阿胶块放置在烧杯中，加入适量纯净水，与80℃水浴锅上加热搅拌至阿胶块完全烊化。合并水煎液和阿胶溶液，浓缩至相对密度1.09；
⑤
a c：称取适量党参、山楂，浸泡30min后，分别5倍量、3倍量、2倍量体积的纯净水，煮沸并回流提取90min、60min、40min，合并水煎液；将适量阿胶块放置在烧杯中，加入适量纯净水，与80℃水浴锅上加热搅拌至阿胶块完全烊化。合并水煎液和阿胶溶液，浓缩至相对密度1.09；
⑥
b c：称取适量熟地、红参、党参、山楂，浸泡30min后，分别5倍量、3倍量、2倍量体积的纯净水，煮沸并回流提取90min、60min、40min，合并水煎液，浓缩至相对密度1.09。
73.(2)采用复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液的验证斑马鱼节间血管生成模型：
①
对收集的受精卵进行消毒和清洗，移入斑马鱼胚胎培养用水中，于28℃培养箱中培养。为减少斑马鱼体内黑色素对荧光定量的影响，需在收集鱼卵后加入n
‑
苯基硫脲以抑制黑色素的生成。将受精后20h的发育正常斑马鱼胚胎在体式显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，采用链酶蛋白酶pronase e溶液1mg
·
ml
‑1除去绒毛膜，移入24孔培养板中，每孔12枚。用斑马鱼培养水配制适量0.15μg
·
ml
‑1的ptk787溶液，用于ptk787组幼鱼孵育；用斑马鱼培养水配制适量含有0.15μg
·
ml
‑1的ptk787、0.20μl
·
ml
‑1a(或b、c、a b、a c、b c、fej)溶液，用于a(或b、c、a b、a c、b c、fej)组幼鱼孵育；设置0.5％dmso为ctrl组；
②
在斑马鱼幼鱼48hpf时(即斑马鱼幼鱼给药后继续发育1天)，将斑马鱼用质量浓度为0.3
‰
的三卡因麻醉1min，然后固定斑马鱼幼鱼于侧面体位，在荧光显微镜下观察，拍照，获得斑马鱼幼鱼荧光显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况；
③
定量分析：利用图像处理软件photoshop对每组斑马鱼荧光显微图像的iaa进行统计，以表示，分析比较ctrl组、ptk787组、a组、b组、c组、a b组、a c组、b c组、fej组的差异显著性；
④
当ctrl组的大于ptk787组的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明此剂量的ptk787可对isv造成损伤；当a(或b、c、a b、a c、b c、fej)组的大于ptk787组的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明此剂量的中药提取液可以逆转ptk787对isv造成的损伤。结果如表4所示：
⑤
表4：复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液对斑马鱼节间血管生成的影响
⑥
通过比较单独使用a、b或c发现iaa
a
＞iaa
b
＞iaa
c
，说明a促血管生成活性大于b促血管生成活性大于c促血管生成活性。表明单独使用a、b或c时，a促血管生成活性最强；
⑦
通过比较组合使用a、b与c发现iaa
a b
＞iaa
a c
＞iaa
b c
，说明a b的促血管生成活性a c促血管生成活性强于b c促血管生成活性；
⑧
除fej外，其他6中组合的中药提取液均无治疗作用(p＞0.05)；fej对模型组有治疗作用(p＜0.05)；
⑨
综上，实验结果表明，复方阿胶浆中各中药之间有协同增效作用；复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液可以基本验证斑马鱼节间血管细胞生成模型的稳定性和可靠
性。
74.(3)采用复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液验证斑马鱼红细胞生成模型：
①
对收集的受精卵进行消毒和清洗，移入斑马鱼胚胎培养用水中，于28℃培养箱中培养。为减少斑马鱼体内黑色素对荧光定量的影响，需在收集鱼卵后加入n
‑
苯基硫脲以抑制黑色素的生成。将受精后48h的发育正常斑马鱼胚胎在体式显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，采用链酶蛋白酶pronase e溶液1mg
·
ml
‑1除去绒毛膜，移入24孔培养板中，每孔12枚。用斑马鱼培养水配制适量0.175μg
·
ml
‑1的phz溶液，用于phz组幼鱼孵育；用斑马鱼培养水配制适量含有0.175μg/ml的phz、0.20μl
·
ml
‑1a(或b、c、a b、a c、b c、fej)溶液，用于a(或b、c、a b、a c、b c、fej)组幼鱼孵育；设置0.1％乙醇为ctrl组；
②
在斑马鱼幼鱼72hpf时(即斑马鱼幼鱼给药后继续发育1天)，将斑马鱼采用邻联茴香胺染色法对各实验组斑马鱼红细胞进行染色，锡纸包裹染色15min后，用斑马鱼培养水冲洗三次，洗去多余染液，使用组织固定液固定后，在显微镜下观察斑马鱼红细胞集中区域，然后固定斑马鱼幼鱼于仰面体位并拍照。(1mg
·
ml
‑1邻联茴香胺染液配置方法：精密称取邻联茴香胺50mg、醋酸钠41mg，置于50ml棕色容量瓶中，加30％的过氧化氢溶液1.1ml，最后用40％的乙醇定容)；
③
定量分析：利用图像处理软件plus version 6.0对每组斑马鱼显微图像的rpi进行统计，以表示，分析比较ctrl组、phz组、a组、b组、c组、a b组、a c组、b c组、fej组的差异显著性；
④
当ctrl组的大于phz组的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明此剂量的phz可对红细胞造成损伤；当a(或b、c、a b、a c、b c、fej)组的说明此剂量的phz可对红细胞造成损伤；当a(或b、c、a b、a c、b c、fej)组的大于phz组的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明此剂量的中药提取液可以逆转phz对红细胞造成的损伤。结果如表5所示：
⑤
表5：复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液对斑马鱼红细胞生成的影响
⑥
通过比较单独使用a、b或c发现rpi
b
＞rpi
c
＞rpi
a
，说明b促红细胞生成活性c促红细胞生成活性大于a促红细胞生成活性。表明单独使用a、b或c时，b促血管生成活性最强；
⑦
通过比较组合使用a、b与c发现rpi
b c
＞rpi
a b
＞rpi
a c
，说明b c的促红细胞生成
活性大于a b促红细胞生成活性大于a c促红细胞生成活性；
⑧
除fej和a外其他5种中药组合物有治疗作用(p＜0.05)，但其他5种中药组合物疗效不及fej；
⑨
综上，实验结果表明，复方阿胶浆中各中药之间有协同增效作用。复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液可以基本验证斑马鱼红细胞生成模型的稳定性和可靠性。
75.(4)采用复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液验证斑马鱼免疫细胞生成模型：
①
对收集的受精卵进行消毒和清洗，移入斑马鱼胚胎培养用水中，于28℃培养箱中培养。为减少斑马鱼体内黑色素对荧光定量的影响，需在收集鱼卵后加入n
‑
苯基硫脲以抑制黑色素的生成。将受精后48h的发育正常斑马鱼胚胎在体式显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，采用链酶蛋白酶pronase e溶液1mg
·
ml
‑1除去绒毛膜，移入24孔培养板中，每孔12枚。用斑马鱼培养水配制适量150μg
·
ml
‑1的nvb溶液，用于nvb组幼鱼孵育；用斑马鱼培养水配制适量含有150μg
·
ml
‑1的nvb、0.20μl
·
ml
‑1a(或b、c、a b、a c、b c、fej)溶液，用于a(或b、c、a b、a c、b c、fej)组幼鱼孵育；设置0.5％dmso为ctrl组；
②
在斑马鱼幼鱼72hpf时(即斑马鱼幼鱼给药后继续发育1天)，将斑马鱼用质量浓度为0.3
‰
的三卡因麻醉1min，然后固定斑马鱼幼鱼于侧面体位，在荧光显微镜下观察，拍照，获得斑马鱼幼鱼荧光显微图像，记录斑马鱼尾部免疫细胞荧光情况；
③
定量分析：利用图像处理软件plus version 6.0对每组斑马鱼显微图像的ici进行统计，以表示，分析比较ctrl组、nvb组、a组、b组、c组、a b组、a c组、b c组、fej组的差异显著性；
④
当ctrl组的大于nvb组的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明此剂量的nvb可对免疫细胞造成损伤；当a(或b、c、a b、a c、b c、fej)组的大于nvb组的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明此剂量的中药提取液可以逆转nvb对免疫细胞造成的损伤。结果如表6所示：
⑤
表6：复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液对斑马鱼免疫细胞生成的影响
⑥
通过比较单独使用a、b或c发现ici
a
＞ici
b
＞ici
c
，说明a促免疫细胞生成活性大
于b促免疫细胞生成活性大于c促免疫细胞生成活性，表明单独使用a、b或c时，a促血管生成活性最强；
⑦
通过比较组合使用a、b与c发现ici
b c
＞ici
a c
＞ici
a b
，说明b c的促免疫细胞生成活性大于a c促免疫细胞生成活性强于a b促免疫细胞生成活性；
⑧
除fej外，其他6中组合的中药提取液均无治疗作用(p＞0.05)；fej对模型组有治疗作用(p＜0.05)；
⑨
综上，实验结果表明，复方阿胶浆中各中药之间有协同增效作用；复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液可以基本验证斑马鱼免疫细胞生成模型的稳定性和可靠性。