一种用于痰液样本的保存液及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于痰液样本的保存液及其应用。


背景技术：

2.痰液性状粘稠，按其性状可分为黏液痰、脓性痰、泡沫痰、血丝痰。几乎每种类型的痰液均有粘液，而粘液包裹着细胞成份，若直接用于涂片，背景满篇都是粘液，使视野中的细胞密度小，导致阅片困难。同时痰液中大量的脱落细胞分散在粘液里，细胞容易遭受变形或破坏，导致检测阳性率低。痰液细胞保存时间短，新鲜的痰液样本若在1小时内无法进行制片固定，细胞容易发生自溶或长菌现象，影响结果判读。
3.痰液检验包括显微检查、涂片检查和病原微生物检查，可以辅助诊断或确诊某些呼吸系统疾病。痰检主要是通过对痰液涂片的检查来明确病人痰液中是否有致病微生物，所以如果痰液样本时间过长有可能会被污染而导致检验结果不准确，即使是放在冰箱中冷藏也不行，因为冰箱中也会有各种细菌的存在。


技术实现要素：

4.为此，本发明提供一种用于痰液样本的保存液及其应用。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供一种用于痰液样本的保存液，所述保存液组成如下：按照质量百分数计，粘液消化剂0.5％
‑
3％、细胞固定剂35％
‑
40％、磷酸盐0.10％
‑
0.15％、无机盐0.78％
‑
0.85％、防腐剂0
‑
0.05％，余量为水；
7.其中，所述粘液消化剂为二硫苏糖醇、n
‑
乙酰半胱氨酸、l
‑
半胱氨酸、s
‑
(羧甲基)
‑
l
‑
半胱氨酸、胰蛋白酶、硫代乙醇酸铵、硫代乙醇酸钠、2
‑
巯基乙烷磺酸钠的至少一种；
8.所述细胞固定剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇或丙三醇三种或三种以上；
9.所述无机盐为氯化钠、醋酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠或乙二胺四乙酸二钠中的两种或两种以上。
10.优选地，所述保存液组成如下：按照质量百分数计，粘液消化剂1.25％、细胞固定剂37％、磷酸氢二钾0.12％、无机盐0.81％、防腐剂0.03％，余量为水；
11.其中，所述粘液消化剂为二硫苏糖醇；
12.所述细胞固定剂为异丙醇15％，甲醇15％，丙三醇7％；
13.所述无机盐为氯化钠0.58％，醋酸钠0.23％；
14.所述防腐剂为proclin。
15.优选地，所述保存液组成如下：按照质量百分数计，粘液消化剂0.5％、细胞固定剂37％、磷酸氢二钾0.12％、无机盐0.81％、防腐剂0.03％，余量为水；
16.其中，所述粘液消化剂为s
‑
(羧甲基)
‑
l
‑
半胱氨酸；
17.所述细胞固定剂为异丙醇15％，甲醇15％，丙三醇7％；
18.所述无机盐为氯化钠0.58％，醋酸钠0.23％；
19.所述防腐剂为proclin。
20.优选地，所述保存液组成如下：按照质量百分数计，粘液消化剂1.5％、细胞固定剂37％、磷酸氢二钾0.12％、无机盐0.81％、防腐剂0.03％，余量为水；
21.其中，所述粘液消化剂为n
‑
乙酰半胱氨酸；
22.所述细胞固定剂为异丙醇15％，甲醇15％，丙三醇7％；
23.所述无机盐为氯化钠0.58％，醋酸钠0.23％；
24.所述防腐剂为proclin。
25.优选地，所述保存液组成如下：按照质量百分数计，粘液消化剂0.8％、细胞固定剂37％、磷酸氢二钾0.12％、无机盐0.81％、防腐剂0.03％，余量为水；
26.其中，所述粘液消化剂为n
‑
乙酰半胱氨酸；
27.所述细胞固定剂为异丙醇15％，甲醇15％，丙三醇7％；
28.所述无机盐为氯化钠0.58％，醋酸钠0.23％；
29.所述防腐剂为proclin。
30.优选地，所述保存液组成如下：按照质量百分数计，粘液消化剂3％、细胞固定剂37％、磷酸氢二钾0.12％、无机盐0.81％、防腐剂0.03％，余量为水；
31.其中，所述粘液消化剂为硫代乙醇酸铵；
32.所述细胞固定剂为异丙醇15％，甲醇15％，丙三醇7％；
33.所述无机盐为氯化钠0.58％，醋酸钠0.23％；
34.所述防腐剂为proclin。
35.优选地，所述保存液的ph值为6.80～7.20。
36.本发明还提供所述的用于痰液样本的保存液在保存生物样本中的应用。
37.优选地，所述生物样本为痰液样本。
38.本发明具有如下优点：
39.本发明痰液保存液可以降低浓稠痰液的表面张力，以降低痰液的粘稠度，能将大分子的蛋白质水解成多肽及氨基酸等产物，同时保护痰液细胞免受损伤，让其有效成分释放出来。极大程度地提高了采样质量和检测阳性率，降低了痰液粘稠，易于涂片、薄层液基以及镜检观察，而且提高了痰液细胞的保存时间。痰液样本经过使用保存液后，其粘稠的黏液能够液化成水状，而血丝状的痰液能够有效祛除红细胞，使得细胞从血丝中释放出来，故阳性率能有显著提高。经保存液处理后的痰液，无论是涂片还是薄层液基，其玻片背景干净，没有黏液与血样碎片，细胞分布均匀，具有足量的细胞成分，易于阅片，便于观察诊断。痰液样本在保存液中能够延长其保存时间，细胞无退化，放置7
‑
10天都仍可正常制片染色。
40.本发明的保存液不仅能够维持痰液样本稳定，还能快速液化痰液，使液化后的痰液样本可直接用于细胞学检测。
附图说明
41.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
42.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
43.图1为本发明实施例1保存液处理的样本编号a1制片染色图；
44.图2为本发明实施例1保存液处理的样本编号b1制片染色图；
45.图3为本发明实施例1保存液处理的样本编号c1制片染色图；
46.图4为本发明实施例2保存液处理的样本编号a2制片染色图；
47.图5为本发明实施例2保存液处理的样本编号b2制片染色图；
48.图6为本发明实施例2保存液处理的样本编号c2制片染色图；
49.图7为本发明实施例3保存液处理的样本编号a3制片染色图；
50.图8为本发明实施例3保存液处理的样本编号b3制片染色图；
51.图9为本发明实施例3保存液处理的样本编号c3制片染色图；
52.图10为本发明实施例4保存液处理的样本编号a4制片染色图；
53.图11为本发明实施例4保存液处理的样本编号b4制片染色图；
54.图12为本发明实施例4保存液处理的样本编号c4制片染色图；
55.图13为本发明实施例5保存液处理的样本编号a5制片染色图；
56.图14为本发明实施例5保存液处理的样本编号b5制片染色图；
57.图15为本发明实施例5保存液处理的样本编号c5制片染色图；
58.图16为本发明实施例6保存液处理的样本编号a6制片染色图；
59.图17为本发明实施例6保存液处理的样本编号b6制片染色图；
60.图18为本发明实施例6保存液处理的样本编号c6制片染色图；
61.图19为本发明实施例7保存液处理的样本编号a7制片染色图；
62.图20为本发明实施例7保存液处理的样本编号b7制片染色图；
63.图21为本发明实施例7保存液处理的样本编号c7制片染色图；
64.图22为本发明对比例1保存液处理的样本编号d1制片染色图；
65.图23为本发明对比例1保存液处理的样本编号d2制片染色图；
66.图24为本发明对比例1保存液处理的样本编号d3制片染色图。
具体实施方式
67.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
68.本实施例提供一种痰液样本保存液其主要成分为粘液消化剂、细胞固定剂、缓冲液、无机盐、防腐剂。其中，粘液消化剂主要为二硫苏糖醇、n
‑
乙酰半胱氨酸、l
‑
半胱氨酸、s
‑
(羧甲基)
‑
l
‑
半胱氨酸、胰蛋白酶、硫代乙醇酸铵、硫代乙醇酸钠、2
‑
巯基乙烷磺酸钠中的至少一种；其中，细胞固定剂主要有甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇中至少三种或三种以上，用于细胞固定的质量浓度百分比为30％
‑
50％之间；其缓冲液有pbs缓冲液、tris缓冲
液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液。酸碱缓冲体系对维持样本中的细胞形态起着重要作用。痰液样本保存液的ph值在6.80～7.20之间；无机盐用于调节无机离子浓度及渗透压，有氯化钠、醋酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠或乙二胺四乙酸二钠中的至少两种，细胞内外之间的平衡遵循渗透原理(即等渗定律)、电中性原则(即细胞内外溶液阴阳离子总数必须维持净电荷为零)。本发明痰液样本保存液，离子浓度在100mm～180mm之间；其防腐剂有proclin 300、叠氮化钠，质量百分比为0.01％～0.2％之间。
69.本发明的保存液的使用方法为：取得痰液后，加入10ml左右的保存液，并放于振荡器上进行震荡液化，1min内即可完成痰液液化，使得粘丝中的细胞得以释放出来。随后保存液中的固定剂根据极性分子的渗透性对每个细胞进行脱水固定，而保存液中的缓冲液与无机盐协同保护细胞的形态。若痰液中带有血丝，保存液中的固定剂不仅能对红细胞进行破除，而且对血红蛋白有稳定与保护作用，使制片的背景不会有血液碎片而影响阅片。
70.实施例1
71.本实施例提供一种痰液样本保存液，按照质量百分数计，该保存液的组成为：二硫苏糖醇1.25％，氯化钠0.58％，磷酸氢二钾0.12％，醋酸钠0.23％，异丙醇15％，甲醇15％，丙三醇7％，proclin 300 0.03％，纯化水补足，保存液的ph值为7.20。
72.本实施例的样本保存液的制备方法为：
73.按照上述比例取二硫苏糖醇，氯化钠，磷酸氢二钾，醋酸钠，异丙醇，甲醇，丙三醇，proclin 300。
74.先向烧杯中加入约一半体积的纯化水，加入磷酸氢二钾，搅拌溶解均匀后，加入氯化钠与醋酸钠，搅拌溶解均匀后，加入二硫苏糖醇，继续搅拌5min，依次加入异丙醇、甲醇、丙三醇，每加入一个物料时，需搅拌均匀后再加入下一个物料，最后加入proclin 300，并用纯化水补足。配制完成后用ph计测量溶液，并使用氢氧化钠或盐酸进行ph值调节。
75.实施例2
76.本实施例提供一种痰液样本保存液，按照质量百分数计，该保存液的组成为：n
‑
乙酰半胱氨酸1.5％，氯化钠0.58％，磷酸氢二钾0.12％，醋酸钠0.23％，异丙醇15％，甲醇15％，丙三醇7％，proclin 300 0.03％，纯化水补足，并使用氢氧化钠或盐酸进行ph值调节，保存液的ph值为6.80。
77.本实施例的样本保存液的制备方法为：
78.按照上述比例取n
‑
乙酰半胱氨酸，氯化钠，磷酸氢二钾，醋酸钠，异丙醇，甲醇，丙三醇，proclin 300；
79.在烧杯中加入约一半体积的纯化水，然后，加入磷酸氢二钾，搅拌溶解均匀后，加入n
‑
乙酰半胱氨酸，搅拌溶解均匀后，继续加入氯化钠与醋酸钠，搅拌5min，依次加入异丙醇、甲醇、丙三醇，每加入一个组分时，需搅拌均匀后再加入下一个组分，最后加入proclin 300，并用纯化水补足。配制完成后用ph计测量溶液，并使用氢氧化钠或盐酸进行ph值调节。
80.实施例3
81.本实施例提供的一种痰液样本保存液，按照质量百分数计，该保存液的组成为：l
‑
半胱氨酸0.65％，氯化钠0.58％，磷酸氢二钾0.12％，醋酸钠0.23％，异丙醇15％，甲醇15％，丙三醇7％，proclin 300 0.03％，纯化水补足，溶液ph值为6.80。
82.本实施例的样本保存液的制备方法为：
83.按照上述比例取l
‑
半胱氨酸，氯化钠，磷酸氢二钾，醋酸钠，异丙醇，甲醇，丙三醇，proclin 300。
84.在烧杯中加入约一半体积的纯化水，然后加入磷酸氢二钾，搅拌溶解均匀后，加入l
‑
半胱氨酸，搅拌溶解均匀后，继续加入氯化钠与醋酸钠，搅拌5min，依次加入异丙醇、甲醇、丙三醇，每加入一个组分时，需搅拌均匀后再加入下一个组分，最后加入proclin 300，并用纯化水补足。配制完成后用ph计测量溶液，并使用氢氧化钠或盐酸进行ph值调节。
85.实施例4
86.本实施例提供一种痰液样本保存液，按照质量百分数计，由该保存液的组成为：s
‑
(羧甲基)
‑
l
‑
半胱氨酸0.5％，氯化钠0.58％，磷酸氢二钾0.12％，醋酸钠0.23％，异丙醇15％，甲醇15％，丙三醇7％，proclin 300 0.03％，纯化水补足，溶液ph值为7.00。
87.本实施例的样本保存液的制备方法为：
88.按照上述比例取s
‑
(羧甲基)
‑
l
‑
半胱氨酸，氯化钠，磷酸氢二钾，醋酸钠，异丙醇，甲醇，丙三醇，proclin 300；
89.在烧杯中加入约一半体积的纯化水，然后，加入磷酸氢二钾，搅拌溶解均匀后加入s
‑
(羧甲基)
‑
l
‑
半胱氨酸，搅拌溶解均匀后，继续加入氯化钠与醋酸钠，搅拌5min，依次加入异丙醇、甲醇、丙三醇，每加入一个组分时，需搅拌均匀后再加入下一个组分，最后加入proclin 300，并用纯化水补足。配制完成后用ph计测量溶液，并使用氢氧化钠或盐酸进行ph值调节。
90.实施例5
91.本实施例提供一种痰液样本保存液，按照质量百分数计，该保存液的组成为：胰蛋白酶0.8％，氯化钠0.58％，磷酸氢二钾0.12％，醋酸钠0.23％，异丙醇15％，甲醇15％，丙三醇7％，proclin 300 0.03％，纯化水补足，溶液ph值为7.10。
92.本实施例的样本保存液的制备方法为：
93.按照上述比例取胰蛋白酶，氯化钠，磷酸氢二钾，醋酸钠，异丙醇，甲醇，丙三醇，proclin 300；
94.在烧杯中加入约一半体积的纯化水，然后，加入磷酸氢二钾，搅拌溶解均匀后，加入氯化钠与醋酸钠，搅拌溶解均匀后加入胰蛋白酶，继续搅拌5min，依次加入异丙醇、甲醇、丙三醇，每加入一个组分时，需搅拌均匀后再加入下一个组分，最后加入proclin 300，并用纯化水补足。配制完成后用ph计测量溶液，并使用氢氧化钠或盐酸进行ph值调节。
95.实施例6
96.本实施例提供一种痰液样本保存液，按照质量百分数计，该保存液的组成为：硫代乙醇酸铵3％，氯化钠0.58％，磷酸氢二钾0.12％，醋酸钠0.23％，异丙醇15％，甲醇15％，丙三醇7％，proclin 300 0.03％，纯化水补足，溶液ph值为7.00。
97.本实施例的样本保存液的制备方法为：
98.按照上述比例取：硫代乙醇酸铵，氯化钠，磷酸氢二钾，醋酸钠，异丙醇，甲醇，丙三醇，proclin 300。
99.在烧杯中加入约一半体积的纯化水，然后，加入磷酸氢二钾，搅拌溶解均匀后加入硫代乙醇酸铵，搅拌溶解均匀后继续加入氯化钠与醋酸钠，搅拌5min，依次加入异丙醇、甲醇、丙三醇，每加入一个组分时需搅拌均匀，后再加入下一个组分，最后加入proclin 300，
并用纯化水补足。配制完成后用ph计测量溶液，并使用氢氧化钠或盐酸进行ph值调节。
100.实施例7
101.本实施例提供一种痰液样本保存液，按质量百分数计，该保存液的组成为：硫代乙醇酸钠1.6％，氯化钠0.58％，磷酸氢二钾0.12％，醋酸钠0.23％，异丙醇15％，甲醇15％，丙三醇7％，proclin 300 0.03％，纯化水补足，溶液ph值为7.00。
102.本实施例的样本保存液的制备方法为：
103.按照上述比例取硫代乙醇酸钠，氯化钠，磷酸氢二钾，醋酸钠，异丙醇，甲醇，丙三醇，proclin 300。
104.在烧杯中加入约一半体积的纯化水，然后，加入磷酸氢二钾，搅拌溶解均匀后，加入硫代乙醇酸钠，搅拌溶解均匀后，继续加入氯化钠与醋酸钠，搅拌5min，依次加入异丙醇、甲醇、丙三醇，每加入一个组分时，需搅拌均匀后再加入下一个组分，最后加入proclin 300，并用纯化水补足。配制完成后用ph计测量溶液，并使用氢氧化钠或盐酸进行ph值调节。
105.试验例
106.本试验例为考察以上7个实施例的痰液样本保存液对痰液的处理效果。同时加入对比例1为阴性对照。
107.取24例痰液样本，按照每例痰液样本性状分为浓稠型与稀液型，其中浓稠型为16例，每个实施例保存液与对比例保存液均考察2例样本，实施例1～7的保存液处理的编号为a1～a7，b1～b7，对比例保存液处理的编号为d1、d2；
108.稀液型为8例，每个实施例的保存液与对比例的保存液考察1例样本实施例1～7的编号为c1～c7，对比例的编号为d3。
109.对比例1的配制方法：取纯化水50ml，加入氯化钠0.45g。
110.按照痰液样本液化方式：在每个痰液样本中加入分别对应加入实施例1～7的保存液，对比例1的处理液4ml，震荡摇匀5min，静置固定30min，观察每个实施例的液化时间。痰样本和处理液的加入方式，如表1所示
111.表1
[0112][0113][0114]
每个实施例与对比例均能完全液化痰液样本，待痰液样本液化固定后，进行制片染色，采用巴氏染色液对痰液样本进行染色，染色的镜检结果如图1
‑
图24所示。
[0115]
从制片染色图可以看出，对比例的黏液拉丝较多，3份样本中有2份样本黏液背景重，实施例1
‑
7的制片染色图背景都比较干净，没有大块的黏液拉丝，碎片状的黏液也较少，不影响阅片与诊断；实施例5有1份样本的细胞染色偏浅，实施例7有1份样本的细胞密度较
少。综合细胞形态、密度以及黏液背景来看，实施例6效果最好，而剩余的实施例效果相当。
[0116]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。