一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法与流程

1.本发明涉及用于组织或器官修复与再生的生物材料技术领域，更具体的说是涉及一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法。


背景技术：

2.目前随着中国逐步进入老龄化社会，骨关节炎及剧烈活动引起的软骨损伤及软骨缺损等疾病日益影响人类健康，对个人造成沉重的经济及身心负担，并造成了沉重社会负担，是骨科临床亟待解决的难题。而针对上述难题，目前传统的解决方案包括关节镜修复手术、骨关节置换术等仍存在诸多问题，如修复效果欠佳、手术创伤巨大等问题。近年来采用生物材料修复软骨组织缺损受到了广泛关注，但目前的生物材料除了可能存在的生物相容性不良和软骨修复再生不足，还存在着修复目标仅聚焦于单纯透明软骨的问题。众所周知，骨关节炎及软骨的损伤不仅累及透明软骨自身，还累及软骨下骨，因此在对骨关节炎和软骨缺损修复治疗中，需要综合修复透明软骨及软骨下骨。研发具有促进软骨联合骨再生的生物材料成为了当前治疗骨关节炎及软骨缺损亟需突破的瓶颈。
3.骺软骨在长骨的两端，二次骨化中心即在其中出现。环绕在二次骨化中心周围的骺软骨中间层，在正常生物体中，骺软骨最终分化成骨组织使得骨骺闭。但有研究发现，骺软骨贮备着一层软骨胚种细胞带，具有分化为软骨的潜力，因此骺软骨联合骨存在修复软骨联合骨缺损的能力。
4.天然组织来源的细胞外基质可以促进细胞粘附、生长、迁移并引导细胞向骨组织分化，是近年来骨组织工程研究的重点。天然组织脱细胞材料因其结构和组成成分与生物机体高度相似而具有独特的生物相容性，因此表现出优异的组织修复效果。运用脱细胞技术制备细胞外支架为组织修复再生材料的制备提供可行思路。而目前能用于修复软骨联合骨的生物材料较少见报道，而骺软骨联合骨修复骨关节炎及软骨缺损则未见报道。
5.因此，提供一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，制备得到的骺软骨联合骨脱细胞材料是一种具有良好材料特性、优越的生物相容性和优异的骨软骨修复效果的生物材料，为修复软骨缺损及治疗骨关节炎提供一种新的材料和途径。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，具体步骤如下：
9.(1)取新鲜3
‑
4月龄大白猪(雌雄不限)股骨远端骺软骨联合骨组织，在4℃低温环境下用无菌pbs反复漂洗5次，每次10min；去除材料上的血液、组织液；
10.(2)在有机溶剂中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂2
‑
6h；后用
无菌pbs冲洗12h；所述有机溶剂为质量浓度为50
‑
70％乙醇溶液或20
‑
40％丙酮溶液；
11.(3)置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；上述过程重复3次，最后用无菌pbs漂洗2次，每次5min；
12.(4)在体积浓度为1
‑
2％的含triton x
‑
100的pbs缓冲液中加入混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡24
‑
72h；再用无菌pbs冲洗12h；
13.(5)在质量浓度为2
‑
5％的含十二烷基醚硫酸钠磺酸(sles)的pbs缓冲液中加入混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡12
‑
48h；再用无菌pbs冲洗12h；
14.(6)在质量浓度为1
‑
2％的3
‑
烯丙氧基
‑2‑
羟基
‑1‑
丙烷磺酸钠盐(ht hops)的pbs缓冲液中加入混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡6
‑
12h；再用无菌pbs冲洗12h；
15.(7)在含0.01mg/ml dnaseⅰ的pbs缓冲液中，加入混合抗菌溶液，37℃恒温水浴6
‑
12h；
16.(8)在质量浓度为50
‑
70％的乙醇中，置于恒温25℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡24
‑
48h；
17.(9)在无菌生理盐水中，加入混合抗菌溶液，置于温度为37℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡12h，重复3次；得到天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料；
18.步骤(4)
‑
(7)中，所述混合抗菌溶液中青霉素和链霉素的浓度分别为100u/ml，100μg/ml；青霉素和链霉素的体积比为1:1；pbs缓冲液和混合抗菌溶液的体积比为10:1；
19.步骤(9)中，所述混合抗菌溶液中青霉素和链霉素的浓度分别为100u/ml，100μg/ml；青霉素和链霉素的体积比为1:1；无菌生理盐水和混合抗菌溶液的体积比为10:1。
20.上述步骤均尽可能保持相对无菌。
21.本发明针对目前用于软骨联合骨修复与再生材料的制备方法存在的问题，建立了一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，该方法将幼年大白猪股骨远端骺软骨联合骨组织经过反复漂洗、脱脂、反复冻融、含triton x
‑
100的pbs缓冲液、含sles的pbs缓冲液、含ht hops的pbs缓冲液、含dnaseⅰ的pbs缓冲液和生理盐水脱毒处理后，获得骺软骨联合骨脱细胞材料。
22.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，具有以下有益效果：
23.(1)本发明首次实现对骺软骨联合骨脱细胞材料的制备，并采用sles及ht hops替代十二烷基硫酸钠(sds)，sles及ht hops同为去垢剂，但相对于sds更温和且脱细胞效果可观，能在完全去除材料中细胞及其细胞内容物的同时，更大程度地保留原有的天然ecm成分和结构的完整性，且骺软骨联合骨结构与正常软骨联合骨的结构十分相似，能最大程度模拟正常软骨联合骨组织的成分和结构。
24.(2)本发明材料通过脱细胞后，再用乙醇及无菌生理盐水反复漂洗进行脱毒后，不具有细胞毒性和免疫原性，并拥有良好的生物相容性和优异的软骨联合骨缺损修复效果。
25.(3)本发明材料源于幼年大白猪股骨，原材料来源广泛，可用于批量生产。
26.(4)本发明可为大小及尺寸可定制的个体化骺软骨联合骨生物材料，以用于满足临床上复杂多样的修复软骨联合骨的需要。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
28.图1附图为本发明骺软骨联合骨取材部位示意图；
29.其中，左图为股骨远端骨骺软骨板大体图，方框内为取材部位；右图为将取材部位进行he染色，显示
△
区域为骺软骨区域；
30.图2附图为本发明脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料各区域dna定量检测图；***：p＜0.001；
31.图3附图为本发明脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料脱细胞效能评估图；其中，第2列图为第3、4、5列图的宏观图；比例尺大小为100μm；
32.图4附图为本发明脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料主要成分保留定性评估图；其中，第1列图为第2、3、4列图的宏观图；比例尺大小为100μm；
33.图5附图为本发明脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料主要成分保留定量评估图；其中，左图为胶原蛋白定量评估条形图；右图为糖胺聚糖(gag)定量评估条形图；ns：p＞0.05；*：p＜0.05；
34.图6附图为本发明脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料三维结构保留评估图；
35.图7附图为本发明正常组的单轴压缩曲线图；
36.图8附图为本发明脱细胞组的单轴压缩曲线图；
37.图9附图为本发明弹性模量统计图；ns：p＞0.05；
38.图10附图为本发明相对弹性极限统计图；*：p＜0.05；
39.图11附图为本发明脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料细胞毒性评估图；ns：p＞0.05；
40.图12附图为本发明脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料细胞毒性、细胞粘附评估图；其中，a、b、c分别表示在骺软骨，交界区和松质骨区中细胞，以表明支架的可粘附性和促进目标细胞的增殖迁移；方框内的图为低倍镜图，方框外的为低倍镜中选取特定目标的高倍镜图；比例尺大小为60μm；
41.图13附图为本发明脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料免疫原性评估图；
42.其中，第一列图“大体”为包埋的整体观图片，第2列和第3列分别是第1列图中骺软骨和骨的放大图；比例尺大小为100μm；
43.图14附图为本发明脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料体外成骨、成软骨诱导评估图；ns：p＞0.05；*：p＜0.05；**：p＜0.01；每组柱形图左侧为空白组，右侧为实验组；
44.图15附图为本发明脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料在体成骨、成软骨诱导组织评估图；比例尺大小为1mm；
45.图16附图为本发明软骨区域内软骨所占比例；*：p＜0.05；***：p＜0.001；
46.图17附图为本发明软骨下骨区域内软骨所占比例；ns：p＞0.05；***：p＜0.001；
47.图18附图为本发明软骨下骨区域内骨质所占比例；***：p＜0.001；。
具体实施方式
48.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
49.实施例1
50.一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，具体步骤如下：
51.(1)取材：取新鲜3月龄幼年大白猪股骨远端骺软骨联合骨，在4℃低温环境下用无菌pbs缓冲液漂洗5次，每次10min，去除表面的毛发、肌肉、筋膜、血液和组织液等杂质；取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为5mm，高度为5mm的圆柱体；
52.(2)脱细胞流程：
53.①
、在500ml有机溶剂溶液(20％丙酮溶液)中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂4h，后用无菌pbs冲洗12h；
54.②
、用无菌纱布将材料擦干后，置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；重复3次；最后用无菌pbs漂洗2次，每次5min；
55.③
、在500ml含有体积浓度为1％triton
‑
x100的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡48h；再用无菌pbs冲洗12h；
56.④
、在500ml含有质量浓度为2％sles的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡36h；再用无菌pbs冲洗12h；
57.⑤
、在500ml含有质量浓度为1％的3
‑
烯丙氧基
‑2‑
羟基
‑1‑
丙烷磺酸钠盐(ht hops)的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡6h；再用无菌pbs冲洗12h；
58.⑥
、在100ml含浓度为0.01mg/ml的dnaseⅰ的pbs缓冲液中，加入10ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温37℃水浴箱中12h；
59.⑦
、在500ml质量浓度为70％的乙醇中，置于恒温25℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡24h；
60.⑧
、在500ml无菌生理盐水中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于温度为37℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡12h，重复3次，即得到天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料。
61.以实施例1制备出的骺软骨联合骨脱细胞材料作为模板进行一系列检测和实验，具体如下：
62.骺软骨联合骨取材部位示意图见图1；图1显示，左图为股骨远端骨骺软骨板大体图，方框内为取材部位；右图为将该部位进行he染色，显示
△
区域为骺软骨区域。
63.图2为脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料各区域dna定量检测图；采用dna基因组提取试剂盒提取脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料中松质骨和骨骺区域dna并测定相应od值，测定各区域dna含量。结果显示脱细胞后骺软骨联合骨脱细胞材料细胞中dna较去细胞前支架减少95％以上，无明显dna残留。(***：p＜0.001)。
64.图3为脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料脱细胞效能评估图；脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料大体图显示脱细胞后支架由粉红色变成乳白色；he染色图显示脱细胞后支架无明显细胞及细胞内容物残留；dapi染色图显示脱下表后支架无明显细胞核及细胞核碎片残留。综上所述，表明骺软骨联合骨脱细胞材料脱细胞效果良好，支架已无明显细胞及其内容无残留。
65.图4为脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料主要成分保留定性评估图；第一和第二行图为masson三色染色图，结果表明脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料中胶原成分保留完好；第三和第四行图为番红o快绿染色，表明脱细胞后骺软骨糖胺聚糖丢失较多，而松质骨部分糖胺聚糖基本保留完好。
66.图5为脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料主要成分保留定量评估图；左图为胶原蛋白定量评估条形图，结果显示脱细胞后骺软骨联合骨脱细胞材料中胶原蛋白成分保留完好；右图为糖胺聚糖(gag)定量评估条形图，结果显示脱细胞骺软骨gag含量较正常组有明显下降，脱细胞后松质骨部分gag保留完好。
67.图6为脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料三维结构保留评估图；通过扫描电镜(sem)对脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料表面三维结构进行评估，结果显示支架各部分表面的三维结构未受到明显破坏，且脱细胞后支架的孔隙率明显增大。
68.图7
‑
图10为脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料力学保留定量评估图；采用单轴压缩试验对脱细胞前后骺软骨联合骨脱细胞材料力学性能进行测定，结果表明脱细胞后骺软骨联合骨脱细胞材料力学性能保留良好。
69.图11为脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料细胞毒性评估图；采用cck
‑
8法提取脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料浸提液，并稀释不同倍数后测定细胞代谢产物浓度od值，上述od值与普通培养基培养后测定细胞代谢产物浓度的od值对比，结果表明脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料无明显细胞毒性。
70.图12为脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料细胞毒性、细胞粘附评估图；用小鼠骨间充质干细胞(bmscs)种植在脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料上1周后，可见bmscs可正常粘附于支架上，并可向支架内部松质骨区域迁移(图c)，表明该支架无细胞毒性，且能作为介质让细胞正常粘附、迁移。
71.图13为脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料免疫原性评估图；将脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料埋植于大鼠背部皮肤皮下组织2、4周以评估支架免疫原性，结果显示2周时存在一定程度的炎症反应；但4周时炎症反应明显减弱，且可见支架出现降解迹象。
72.图14为脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料体外成骨、成软骨诱导评估图；将小鼠骨间充质干细胞种植在脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料上3、7、14天，收集细胞并提取rna后进行pcr试验后测定与空白组(间充质干细胞单纯种植于培养皿中)特定基因(runx2、collageni、alp为成骨基因，sox9、collagenп、aggrecan为成软骨基因)的相对表达量。结果显示脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料具有明显促进骨和软骨生成作用。
73.图15为脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料在体成骨、成软骨诱导组织评估图；将脱细胞骺软骨连骨埋置于成年新西兰大白兔股骨远端关节面缺损中4周和8周后，将实验部位取出后，行he染色及番红固绿染色以初步判断骨和软骨修复效果。结果显示第4周时，相对空白组，可见软骨及软骨下骨开始初步修复；第8周时软骨下骨基本修复完全，软骨部分除
缺损交界部位缺损虽未完全修复，但其余部位均基本修复完全。综上所述，脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料能促进骨软骨缺损的修复再生。
74.图16
‑
18为脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料在体成骨、成软骨诱导定量评估图；将图15中的关节面以下1mm内作为软骨区域，关节面以下1
‑
4mm作为软骨下骨区域，采用定量手法测定软骨区域内软骨所占面积、软骨下骨区域内软骨及骨所占面积，以定量评估缺损部位软骨及骨修复效果。结果显示在第8周时，脱细胞骺软骨联合骨脱细胞材料具有明显促软骨、促骨生成作用。
75.实施例2
76.(1)取材：取新鲜3月龄幼年大白猪股骨远端骺软骨联合骨，在4℃低温环境下用无菌pbs缓冲液漂洗5次，每次10min，去除表面的毛发、肌肉、筋膜、血液和组织液等杂质；取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为5mm，高度为5mm的圆柱体；
77.(2)脱细胞流程：
78.①
、在500ml有机溶剂溶液(20％丙酮溶液)中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂2h，后用无菌pbs冲洗12h；
79.②
、用无菌纱布将材料擦干后，置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；重复3次；最后用无菌pbs漂洗2次，每次5min；
80.③
、在500ml含有体积浓度为2％triton
‑
x100的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡48h；再用无菌pbs冲洗12h；
81.④
、在500ml含有质量浓度为5％sles的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡36h；再用无菌pbs冲洗12h；
82.⑤
、在500ml含有质量浓度为2％的3
‑
烯丙氧基
‑2‑
羟基
‑1‑
丙烷磺酸钠盐(ht hops)的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡6h；再用无菌pbs冲洗12h；
83.⑥
、在100ml含浓度为0.01mg/ml的dnaseⅰ的pbs缓冲液中，加入10ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温37℃水浴箱中6h；
84.⑦
、在500ml质量浓度为50％的乙醇中，置于恒温25℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡24h；
85.⑧
、在500ml无菌生理盐水中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于温度为37℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡12h，重复3次，即得到天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料。
86.实施例3
87.(1)取材：取新鲜3月龄幼年大白猪股骨远端骺软骨联合骨，在4℃低温环境下用无菌pbs缓冲液漂洗5次，每次10min，去除表面的毛发、肌肉、筋膜、血液和组织液等杂质；取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为5mm，高度为5mm的圆柱体；
88.(2)脱细胞流程：
89.①
、在500ml有机溶剂溶液(30％丙酮溶液)中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂6h，后用无菌pbs冲洗12h；
90.②
、用无菌纱布将材料擦干后，置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；重复3次；最后用无菌pbs漂洗2次，每次5min；
91.③
、在500ml含有体积浓度为1％triton
‑
x100的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡24h；再用无菌pbs冲洗12h；
92.④
、在500ml含有质量浓度为2％sles的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡12h；再用无菌pbs冲洗12h；
93.⑤
、在500ml含有质量浓度为1％的3
‑
烯丙氧基
‑2‑
羟基
‑1‑
丙烷磺酸钠盐(ht hops)的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡12h；再用无菌pbs冲洗12h；
94.⑥
、在100ml含浓度为0.01mg/ml的dnaseⅰ的pbs缓冲液中，加入10ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温37℃水浴箱中9h；
95.⑦
、在500ml质量浓度为50％的乙醇中，置于恒温25℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡48h；
96.⑧
、在500ml无菌生理盐水中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于温度为37℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡12h，重复3次，即得到天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料。
97.实施例4
98.(1)取材：取新鲜4月龄幼年大白猪股骨远端骺软骨联合骨，在4℃低温环境下用无菌pbs缓冲液漂洗5次，每次10min，去除表面的毛发、肌肉、筋膜、血液和组织液等杂质；取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为5mm，高度为5mm的圆柱体；
99.(2)脱细胞流程：
100.①
、在500ml有机溶剂溶液(40％丙酮溶液)中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂2h，后用无菌pbs冲洗12h；
101.②
、用无菌纱布将材料擦干后，置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；重复3次；最后用无菌pbs漂洗2次，每次5min；
102.③
、在500ml含有体积浓度为2％triton
‑
x100的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡24h；再用无菌pbs冲洗12h；
103.④
、在500ml含有质量浓度为5％sles的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡12h；再用无菌pbs冲洗12h；
104.⑤
、在500ml含有质量浓度为2％的3
‑
烯丙氧基
‑2‑
羟基
‑1‑
丙烷磺酸钠盐(ht hops)的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡12h；再用无菌pbs冲洗12h；
105.⑥
、在100ml含浓度为0.01mg/ml的dnaseⅰ的pbs缓冲液中，加入10ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温37℃水浴箱中12h；
106.⑦
、在500ml质量浓度为70％的乙醇中，置于恒温25℃、转速为120rpm的恒温摇床
中震荡48h；
107.⑧
、在500ml无菌生理盐水中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于温度为37℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡12h，重复3次，即得到天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料。
108.实施例5
109.(1)取材：取新鲜4月龄幼年大白猪股骨远端骺软骨联合骨，在4℃低温环境下用无菌pbs缓冲液漂洗5次，每次10min，去除表面的毛发、肌肉、筋膜、血液和组织液等杂质；取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为5mm，高度为5mm的圆柱体；
110.(2)脱细胞流程：
111.①
、在500ml有机溶剂溶液(40％丙酮溶液)中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂6h，后用无菌pbs冲洗12h；
112.②
、用无菌纱布将材料擦干后，置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；重复3次；最后用无菌pbs漂洗2次，每次5min；
113.③
、在500ml含有体积浓度为1％triton
‑
x100的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡72h；再用无菌pbs冲洗12h；
114.④
、在500ml含有质量浓度为2％sles的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡48h；再用无菌pbs冲洗12h；
115.⑤
、在500ml含有质量浓度为1％的3
‑
烯丙氧基
‑2‑
羟基
‑1‑
丙烷磺酸钠盐(ht hops)的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡9h；再用无菌pbs冲洗12h；
116.⑥
、在100ml含浓度为0.01mg/ml的dnaseⅰ的pbs缓冲液中，加入10ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温37℃水浴箱中12h；
117.⑦
、在500ml质量浓度为60％的乙醇中，置于恒温25℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡24h；
118.⑧
、在500ml无菌生理盐水中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于温度为37℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡12h，重复3次，即得到天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料。
119.实施例6
120.(1)取材：取新鲜4月龄幼年大白猪股骨远端骺软骨联合骨，在4℃低温环境下用无菌pbs缓冲液漂洗5次，每次10min，去除表面的毛发、肌肉、筋膜、血液和组织液等杂质；取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为5mm，高度为5mm的圆柱体；
121.(2)脱细胞流程：
122.①
、在500ml有机溶剂溶液(50％乙醇溶液)中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂2h，后用无菌pbs冲洗12h；
123.②
、用无菌纱布将材料擦干后，置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；重复3次；最后用无菌pbs漂洗2次，每次5min；
124.③
、在500ml含有体积浓度为2％triton
‑
x100的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别
为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡72h；再用无菌pbs冲洗12h；
125.④
、在500ml含有质量浓度为5％sles的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡48h；再用无菌pbs冲洗12h；
126.⑤
、在500ml含有质量浓度为2％的3
‑
烯丙氧基
‑2‑
羟基
‑1‑
丙烷磺酸钠盐(ht hops)的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡9h；再用无菌pbs冲洗12h；
127.⑥
、在100ml含浓度为0.01mg/ml的dnaseⅰ的pbs缓冲液中，加入10ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温37℃水浴箱中12h；
128.⑦
、在500ml质量浓度为60％的乙醇中，置于恒温25℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡48h；
129.⑧
、在500ml无菌生理盐水中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于温度为37℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡12h，重复3次，即得到天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料。
130.实施例7
131.(1)取材：取新鲜4月龄幼年大白猪股骨远端骺软骨联合骨，在4℃低温环境下用无菌pbs缓冲液漂洗5次，每次10min，去除表面的毛发、肌肉、筋膜、血液和组织液等杂质；取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为5mm，高度为5mm的圆柱体；
132.(2)脱细胞流程：
133.①
、在500ml有机溶剂溶液(50％乙醇溶液)中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂6h，后用无菌pbs冲洗12h；
134.②
、用无菌纱布将材料擦干后，置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；重复3次；最后用无菌pbs漂洗2次，每次5min；
135.③
、在500ml含有体积浓度为1％triton
‑
x100的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡48h；再用无菌pbs冲洗12h；
136.④
、在500ml含有质量浓度为3％sles的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡36h；再用无菌pbs冲洗12h；
137.⑤
、在500ml含有质量浓度为1％的3
‑
烯丙氧基
‑2‑
羟基
‑1‑
丙烷磺酸钠盐(ht hops)的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡6h；再用无菌pbs冲洗12h；
138.⑥
、在100ml含浓度为0.01mg/ml的dnaseⅰ的pbs缓冲液中，加入10ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温37℃水浴箱中12h；
139.⑦
、在500ml质量浓度为50％的乙醇中，置于恒温25℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡36h；
140.⑧
、在500ml无菌生理盐水中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于温度为37℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡12h，重复3次，
即得到天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料。
141.实施例8
142.(1)取材：取新鲜3月龄幼年大白猪股骨远端骺软骨联合骨，在4℃低温环境下用无菌pbs缓冲液漂洗5次，每次10min，去除表面的毛发、肌肉、筋膜、血液和组织液等杂质；取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为5mm，高度为5mm的圆柱体；
143.(2)脱细胞流程：
144.①
、在500ml有机溶剂溶液(70％乙醇溶液)中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂2h，后用无菌pbs冲洗12h；
145.②
、用无菌纱布将材料擦干后，置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；重复3次；最后用无菌pbs漂洗2次，每次5min；
146.③
、在500ml含有体积浓度为1％triton
‑
x100的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡48h；再用无菌pbs冲洗12h；
147.④
、在500ml含有质量浓度为4％sles的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡36h；再用无菌pbs冲洗12h；
148.⑤
、在500ml含有质量浓度为1％的3
‑
烯丙氧基
‑2‑
羟基
‑1‑
丙烷磺酸钠盐(ht hops)的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡6h；再用无菌pbs冲洗12h；
149.⑥
、在100ml含浓度为0.01mg/ml的dnaseⅰ的pbs缓冲液中，加入10ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温37℃水浴箱中12h；
150.⑦
、在500ml质量浓度为60％的乙醇中，置于恒温25℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡36h；
151.⑧
、在500ml无菌生理盐水中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于温度为37℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡12h，重复3次，即得到天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料。
152.实施例9
153.(1)取材：取新鲜3月龄幼年大白猪股骨远端骺软骨联合骨，在4℃低温环境下用无菌pbs缓冲液漂洗5次，每次10min，去除表面的毛发、肌肉、筋膜、血液和组织液等杂质；取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为5mm，高度为5mm的圆柱体；
154.(2)脱细胞流程：
155.①
、在500ml有机溶剂溶液(70％乙醇溶液)中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂6h，后用无菌pbs冲洗12h；
156.②
、用无菌纱布将材料擦干后，置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；重复3次；最后用无菌pbs漂洗2次，每次5min；
157.③
、在500ml含有体积浓度为1％triton
‑
x100的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡48h；再用无菌pbs冲洗12h；
158.④
、在500ml含有质量浓度为2％sles的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/
ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡36h；再用无菌pbs冲洗12h；
159.⑤
、在500ml含有质量浓度为1％的3
‑
烯丙氧基
‑2‑
羟基
‑1‑
丙烷磺酸钠盐(ht hops)的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡6h；再用无菌pbs冲洗12h；
160.⑥
、在100ml含浓度为0.01mg/ml的dnaseⅰ的pbs缓冲液中，加入10ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温37℃水浴箱中12h；
161.⑦
、在500ml质量浓度为70％的乙醇中，置于恒温25℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡36h；
162.⑧
、在500ml无菌生理盐水中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于温度为37℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡12h，重复3次，即得到天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料。
163.实施例10
164.(1)取材：取新鲜3月龄幼年大白猪股骨远端骺软骨联合骨，在4℃低温环境下用无菌pbs缓冲液漂洗5次，每次10min，去除表面的毛发、肌肉、筋膜、血液和组织液等杂质；取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为5mm，高度为5mm的圆柱体；
165.(2)脱细胞流程：
166.①
、在500ml有机溶剂溶液(60％乙醇溶液)中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂4h，后用无菌pbs冲洗12h；
167.②
、用无菌纱布将材料擦干后，置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；重复3次；最后用无菌pbs漂洗2次，每次5min；
168.③
、在500ml含有体积浓度为1％triton
‑
x100的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡48h；再用无菌pbs冲洗12h；
169.④
、在500ml含有质量浓度为2％sles的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡36h；再用无菌pbs冲洗12h；
170.⑤
、在500ml含有质量浓度为1％的3
‑
烯丙氧基
‑2‑
羟基
‑1‑
丙烷磺酸钠盐(ht hops)的pbs缓冲液中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡6h；再用无菌pbs冲洗12h；
171.⑥
、在100ml含浓度为0.01mg/ml的dnaseⅰ的pbs缓冲液中，加入10ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于恒温37℃水浴箱中12h；
172.⑦
、在500ml质量浓度为70％的乙醇中，置于恒温25℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡36h；
173.⑧
、在500ml无菌生理盐水中，加入50ml浓度分别为100u/ml，100μg/ml的青霉素和链霉素的混合抗菌溶液，置于温度为37℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡12h，重复3次，即得到天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料。
174.实施例2
‑
10均能制备出脱细胞完全、支架三维结构及活性成分保留完好、具有一定生物活性(如成骨及成软骨活性)的骺软骨联合骨脱细胞材料，相应结果与实施例1基本
一致。
175.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。