美白剂的筛选方法、骨形成蛋白4抑制剂、化妆品材料及化妆品材料的制造方法与流程

1.本发明涉及一种美白剂的筛选方法、以及通过美白剂的筛选方法而得到的美白剂及使用了美白剂的化妆品材料。


背景技术：

2.以往提供了一种美白化妆品材料，其中为了防止皮肤的色素沉着并保持白皙明亮的肌肤而配合有胎盘、鞣花酸、曲酸、氨甲环酸、十六烷基氨甲环酸、亚油酸等各种美白有效成分。例如，在下述专利文献1中公开了一种含有特定的半胱氨酸衍生物或半胱氨酸衍生物的盐及特定的美白剂的化妆品材料，作为特定的美白剂，公开了多种植物提取物。
3.皮肤的黑色色素即黑色素是由被称为黑色素细胞的色素产生细胞产生的。在下述专利文献2中，以治疗黑色素产生被异常抑制、或因缺乏黑色素细胞而引起的寻常性白斑、遗传性对称性色素异常症及白化病等疾病为目的，公开了一种促进黑色素细胞的分化诱导的方法。具体而言，公开了一种包括在将人多能干细胞诱导为表皮细胞的成分及诱导向角质细胞的终末分化的成分的存在下进行培养的方法。
4.另外，在下述专利文献3中公开了一种具有多能性的干细胞的分化诱导药的筛选方法，作为干细胞的分化诱导药，记载了属于所谓的tgf
‑
β(transforming growth factor
‑
β，转化生长因子β)超家族的多种因子，作为多种因子中的其中一种，记载了bmp
‑
4(bone morphogenetic protein
‑
4，骨形成蛋白4)。已报道，bmp
‑
4参与从干细胞向视网膜色素上皮的分化(下述专利文献4)及参与促进毛发生长(下述专利文献5)。并且，在下述专利文献6中报道了bmp
‑
4减少在黑色素细胞中生成黑色素。
5.专利文献1：国际公开第2013/081147号
6.专利文献2：日本特开2015
‑
146803号公报
7.专利文献3：日本特表2005
‑
500847号公报
8.专利文献4：日本特开2009
‑
226069号公报
9.专利文献5：日本特表2008
‑
534607号公报
10.专利文献6：日本特表2006
‑
508026号公报
11.皮肤的色素沉着起因于黑色素细胞从干细胞发生分化及增殖且因增殖的黑色素细胞而黑色素的产生增加。因此，认为能够抑制黑色素细胞的分化及增殖的物质作为美白剂而有用。


技术实现要素：

12.本发明的课题在于提供一种利用参与黑色素细胞的分化及增殖的抑制的机制来筛选作为美白剂而有用的物质，并提供通过筛选而确认到有用性的作为美白剂的bmp
‑
4抑制剂及含有通过筛选而确认到有用性的美白剂的化妆品材料及其制造方法。
13.用于解决上述课题的具体方案包括以下实施方式。
14.[1]一种美白剂的筛选方法，其以将美白剂候选物质暴露于细胞时的黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平相对于将美白剂候选物质未暴露于细胞的对照组中的黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平的下降作为指标。
[0015]
[2]根据[1]所述的美白剂的筛选方法，其中，黑色素细胞分化诱导促进因子为骨形成蛋白4。
[0016]
[3]根据[1]或[2]所述的美白剂的筛选方法，其中，细胞为人正常细胞。
[0017]
[4]根据[3]所述的美白剂的筛选方法，其中，人正常细胞为表皮角质细胞。
[0018]
[5]根据[3]所述的美白剂的筛选方法，其中，人正常细胞为成纤维细胞。
[0019]
[6]一种骨形成蛋白4抑制剂，其包含选自包括地榆提取物、库拉索芦荟叶提取物、豆浆发酵液、蛾豆种子提取物、欧洲七叶树提取物、甘草提取物及明日叶的叶/茎提取物的组中的至少一种。
[0020]
[7]根据[6]所述的骨形成蛋白4抑制剂，其中，所述骨形成蛋白4抑制剂含有包含地榆提取物的粒子，该粒子的中值粒径小于1μm。
[0021]
[8]一种化妆品材料，其含有[6]或[7]的骨形成蛋白4抑制剂作为美白剂。
[0022]
[9]一种化妆品材料，其含有通过[1]至[5]中任一项的美白剂的筛选方法确认到黑色素细胞分化诱导促进因子的基因表达水平的下降的美白剂候选物质作为美白剂。
[0023]
[10]一种化妆品材料的制造方法，其包括：将通过[1]至[5]中的任一项的美白剂的筛选方法确认到黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平的下降的美白剂候选物质确定为美白剂的工序；及将美白剂添加到化妆品材料成分中的工序。
[0024]
发明效果
[0025]
根据本发明的技术，利用参与黑色素细胞的分化及增殖的抑制的机制，能够筛选出作为美白剂而有用的物质。另外，能够提供通过筛选确认到有用性的作为美白剂的bmp
‑
4抑制剂及含有通过筛选确认到有用性的美白剂的化妆品材料及其制造方法。
附图说明
[0026]
图1是表示bmp
‑
4的黑色素产生效果的图表。
[0027]
图2是表示美白剂候选物质的筛选结果的图表。
[0028]
图3是表示地榆提取物的有无对黑色素产生的影响的图表。
[0029]
图4是表示地榆提取物的纳米化对黑色素产生的影响的图表。
具体实施方式
[0030]
(1)美白剂的筛选方法
[0031]
第1实施方式的美白剂的筛选方法以将美白剂候选物质暴露于细胞时的黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平相对于将美白剂候选物质未暴露于细胞的对照组中的黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平的下降作为指标。
[0032]
在本实施方式中，在将某一种物质作为美白剂候选物质的情况下，在将该物质暴露于细胞的实验组和将该物质未暴露于细胞的对照组中分别验证黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平。然后，将实验组的表达水平相对于对照组的表达水平是否下降作为美白剂的筛选指标。在此，“美白剂候选物质”是能够成为美白剂的候选物质，是指筛选的被验
物质。并且，“美白剂”是指美白剂候选物质中通过筛选能够确认到使黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平下降的功能的物质。
[0033]
黑色素细胞分化诱导促进因子是促进多能干细胞(例如，ips细胞(induced pluripotent stem cells))或黑色素细胞干细胞向黑色素细胞的分化诱导的蛋白。作为黑色素细胞分化诱导促进因子发挥作用的蛋白，例如有bmp
‑
2、bmp
‑
4、bmp
‑
7、干细胞因子(stem cell factor；scf)、内皮素1、内皮素3、wnt3a等。
[0034]
在此，黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平可以根据检测所产生的作为蛋白的黑色素细胞分化诱导促进因子本身来确认，或者，也可以根据检测产生黑色素细胞分化诱导促进因子时的对应的基因的表达来确认。即，黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平可以为基因表达水平或蛋白表达水平中的任一种或两种。
[0035]
作为基因表达水平的确认方法，例如能够采用：pcr(polymerase chain reaction：聚合酶链式反应)法、rt
‑
pcr(reverse transcription pcr：逆转录pcr)法、使用rna探针检测基因量的方法(微阵列法)、利用下一代定序器对rna序列进行测序并检测表达量的方法及使用核酸杂交来检测表达量的方法(原位杂交法)等。
[0036]
作为蛋白表达水平的确认方法，能够采用：使用蛋白质印迹法半定量检测蛋白的方法、使用elisa法定量检测蛋白的方法、测定实施了免疫染色的样本的图像中的荧光等的染色强度的方法及使用蛋白质组学分析来检测蛋白的方法等。
[0037]
实验组中的黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平的下降可以根据实验组的表达水平是否比对照组的表达水平下降(即使是微量也可)来判断，优选地，可以根据实验组的表达水平相对于对照组的表达水平的下降率(即，在将对照组的表达水平设为a、将实验组的表达水平设为x时，以“(a
‑
x)/a”求出的比率)为5％以上，优选为10％以上，更优选为20％以上，进一步优选为50％以上来判断。进而，期望与下降率的值无关地，实验组的表达水平与对照组的表达水平之差在统计学上显著。判断在统计学上显著时的显著水平能够设为5％以下。
[0038]
根据本实施方式，能够以作为参与黑色素细胞的分化及增殖的抑制的机制的黑色素细胞分化诱导促进因子的基因表达水平的下降作为指标，筛选有可能作为美白剂而有用的美白剂候选物质，并将通过筛选而得到的物质用作美白剂。
[0039]
根据第1实施方式，在第2实施方式的美白剂的筛选方法中，黑色素细胞分化诱导促进因子为骨形成蛋白4。
[0040]
通过以作为黑色素细胞分化诱导促进因子的在第1实施方式所涉及的美白剂的筛选方法中能够成为指标的因子中的骨形成蛋白4(bmp
‑
4)的基因表达水平的下降作为指标，能够明确筛选美白剂候选物质。
[0041]
根据第1实施方式或第2实施方式，在第3实施方式的美白剂的筛选方法中，细胞为人正常细胞。
[0042]
根据第3实施方式，在第4实施方式的美白剂的筛选方法中，人正常细胞为表皮角质细胞。
[0043]
根据第3实施方式，在第5实施方式的美白剂的筛选方法中，人正常细胞为成纤维细胞。
[0044]
产生黑色素的黑色素细胞从黑色素细胞干细胞发生分化。推测从在皮肤中存在于
黑色素细胞干细胞周边的细胞(例如，作为人正常细胞的表皮角质细胞、成纤维细胞、朗格汉斯细胞、神经细胞、t细胞、默克尔细胞及黑色素细胞等。以下，称为“边缘细胞”。)分泌的黑色素细胞分化促进因子参与从黑色素细胞干细胞向黑色素细胞的分化。因此，认为若能够抑制黑色素细胞分化诱导促进因子从边缘细胞分泌，则也能够抑制从黑色素细胞干细胞向黑色素细胞的分化，其结果，也能够抑制基于黑色素细胞的黑色素产生。因此，将美白剂候选物质暴露于人正常细胞，尤其是表皮角质细胞或成纤维细胞，更优选为表皮角质细胞，其结果，被暴露的细胞中的黑色素细胞分化诱导促进因子例如bmp
‑
4的表达水平下降是指，暴露于细胞的美白剂候选物质具有抑制黑色素细胞分化诱导促进因子的效果。然后，暴露于细胞的美白剂候选物质通过抑制黑色素细胞分化诱导促进因子的效果来抑制黑色素细胞干细胞向黑色素细胞的分化，其结果，抑制黑色素产生。即，在第3实施方式至第5实施方中，将美白剂候选物质暴露于人正常细胞，尤其是表皮角质细胞或成纤维细胞，更优选为表皮角质细胞，并观察黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平的过程视为美白效果的筛选。另外，作为认为表皮角质细胞更优选作为人正常细胞的原因，推测是由于表皮角质细胞位于黑色素细胞周边，因此容易对黑色素细胞带来影响。
[0045]
(2)骨形成蛋白4(bmp
‑
4)抑制剂
[0046]
第6实施方式的bmp
‑
4抑制剂包含选自包括地榆提取物、库拉索芦荟叶提取物、豆浆发酵液、蛾豆种子提取物、欧洲七叶树提取物、甘草根提取物及明日叶的叶/茎提取物的组中的至少一种。
[0047]
在将各种美白剂候选物质暴露于作为人正常细胞的表皮角质细胞时，地榆提取物、库拉索芦荟叶提取物、豆浆发酵液、蛾豆种子提取物、欧洲七叶树提取物、甘草根提取物及明日叶的叶/茎提取物显著抑制了bmp
‑
4的基因表达水平，因此判断为上述的各物质具有作为bmp
‑
4抑制剂的效果。如此，能够期待通过使bmp
‑
4的基因表达水平下降来抑制黑色素产生，且能够期待通过黑色素产生抑制的美白效果。另外，在所述专利文献6中，已报道bmp
‑
4在黑色素细胞中减少黑色素的生成，对此，第6实施方式中利用bmp
‑
4抑制剂使bmp
‑
4的表达水平下降来抑制黑色素产生。在此，bmp
‑
4抑制剂可以为上述的各物质其本身，也可以为将上述的各物质溶解于适当的溶剂而成的组合物。并且，也可以为包含将上述的各物质单独或组合两种以上并与适当的溶剂一同或与任意的添加剂一同微细化为任意大小的粒子的组合物。另外，也可以为包含上述的各物质并进行了乳化/分散的组合物。
[0048]
地榆提取物是从地榆(英文名：great burnet，学名：sanguisorba officinalis)的根及根茎中提取的提取物(extract)，例如能够以“地榆提取物粉末(maruzen pharmaceuticals co.,ltd.)”获得。库拉索芦荟叶提取物是从库拉索芦荟(学名：aloe vera)的叶子的液汁中提取的提取物，例如能够以“芦荟提取物bella miyakojima(ichimaru pharcos co.,ltd.)”获得。豆浆发酵液是将豆浆发酵并进行过滤而得到的溶液，例如能够以technoble co.,ltd.的产品获得。蛾豆种子提取物是从蛾豆(学名：vigna aconitifolia)的种子中提取的提取物，例如能够以“vit
‑
a
‑
like pw ls 9898(yamakawa&co.,ltd.)”获得。欧洲七叶树提取物是从欧洲七叶树(学名：aesculus hippocastanum)的种子中提取的提取物，例如能够以sabin japan corporation的产品获得。甘草根提取物是从甘草(学名：glycyrrhiza glabra)的根中提取的提取物，例如能够以“甘草提取液(maruzen pharmaceuticals co.,ltd.)”获得。明日叶的叶/茎提取物是从明日叶(学名：
angelica keiskei)的叶子及茎中的任一方或双方中提取的提取物，例如能够以“明日叶提取液b(maruzen pharmaceuticals co.,ltd.)”获得。另外，上述获得方法并不受限定。
[0049]
根据第6实施方式，在第7实施方式的bmp
‑
4抑制剂中，含有包含地榆提取物的粒子，该粒子为中值粒径小于1μm。
[0050]
以下，将第7实施方式的bmp
‑
4抑制剂称为纳米化地榆组合物。纳米化地榆组合物为包含地榆提取物的地榆组合物，并且包含地榆提取物的粒子的直径以中值粒径计小于1μm。
[0051]
在此，中值粒径定义为假设将粉体以粒径分为两部分时较大的一侧与较小的一侧成为等量的直径。作为中值粒径的测定例，应用动态光散射原理来求出。例如，能够使用粒径分析仪(fpar
‑
1000，otsuka electronics co.,ltd.)来测定分散粒子的中值粒径(d50)。
[0052]
与含有1μm以上的中值粒径的粒子的分散物相比，第7实施方式的纳米化地榆组合物能够提高黑色素产生抑制效果。另外，粒子的中值粒径优选小于200nm，更优选小于100nm，进一步优选小于80nm。粒子的中值粒径的下限可以设为10nm。
[0053]
第7实施方式中所使用的纳米化地榆组合物中所包含的粒子只要取中值粒径小于1μm的粒子的形态，则可以通过乳化工序、分散工序等任一工序来进行制造。纳米化地榆组合物中所包含的粒子除了地榆提取物以外，例如能够包含氢化聚异丁烯、角鲨烷、异壬酸异十三烷基酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯等油性物质。
[0054]
第7实施方式的纳米化地榆组合物例如能够通过将地榆提取物悬浮于油相之后，与水相一同乳化分散，来以水包油型乳液中的油滴的形式制造。
[0055]
作为纳米化地榆组合物的油相量，优选1质量％～20质量％，更优选5质量％～17.5质量％。若油相量为1质量％以上，则在发挥bmp
‑
4抑制效果的方面有利。并且，若油相量为20质量％以下，则在使地榆提取物分散于bmp
‑
4抑制剂中的方面有利。
[0056]
本发明的bmp
‑
4抑制剂例如能够添加到化妆品材料、准药品、医药品等中。
[0057]
(3)化妆品材料及其制造方法
[0058]
第8实施方式的化妆品材料含有第6实施方式或第7实施方式的bmp
‑
4抑制剂作为美白剂。
[0059]
若将第6实施方式或第7实施方式的bmp
‑
4抑制剂暴露于人正常细胞，尤其是表皮角质细胞或成纤维细胞，则与未暴露的对照组相比，bmp
‑
4的表达水平下降。因此，第6实施方式或第7实施方式的bmp
‑
4抑制剂具有作为抑制由bmp
‑
4抑制表达水平的下降引起的黑色素产生的美白剂的有用性。因此，通过使bmp
‑
4抑制剂含于化妆品材料中，能够提供具有美白效果的化妆品材料。
[0060]
第9实施方式的化妆品材料含有通过第1实施方式至第5实施方式中的任一项的美白剂的筛选方法确认到黑色素细胞分化诱导促进因子的基因表达水平的下降的美白剂候选物质作为美白剂。
[0061]
作为美白剂候选物质(例如，地榆提取物)在化妆品材料中的含量，优选0.0001质量％～0.05质量％，更优选0.001质量％～0.025质量％。若美白剂候选物质的含量为0.0001质量％以上，则在可显现出黑色素细胞分化诱导促进因子的基因表达水平的下降的方面有利。并且，若为0.05质量％以下，则在使美白剂候选物质分散于化妆品材料中的方面有利。
[0062]
本发明的化妆品材料的制造方法只要包括将经过了基于本发明的美白剂的筛选方法的筛选的美白剂候选物质作为美白剂而添加到化妆品材料中的工序，则不受特别限制。另外，关于化妆品材料成分，将在后面进行叙述。本发明的化妆品材料例如能够通过将特定量的增稠剂、特定量的保湿成分、特定量的表面活性剂、水及根据需要添加的其他成分进行混合而制成化妆品材料成分，进而添加特定量的作为美白剂的bmp
‑
4抑制剂，并按照公知的制造方法来得到。
[0063]
其中，本发明的化妆品材料优选通过第10实施方式的化妆品材料的制造方法来制造。第10实施方式的化妆品材料的制造方法包括：将通过第1实施方式至第5实施方式中的任一项的美白剂的筛选方法确认到黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平的下降的美白剂候选物质确定为美白剂的工序(以下，称为候选物质确定工序)；及将美白剂添加到化妆品材料成分中的工序(以下，称为添加工序)。
[0064]
在候选物质确定工序中，确定通过已叙述的第1实施方式至第5实施方式中的任一项的美白剂的筛选方法确认到黑色素细胞分化诱导促进因子的表达水平的下降的美白剂候选物质。关于第1实施方式～第5实施方式的详细内容，如已叙述，因此在此省略说明。
[0065]
在添加工序中，将美白剂候选物质添加到化妆品材料成分中。添加能够通过混合美白剂候选物质和化妆品材料成分来进行。混合例如能够通过乳化分散法等公知的方法来进行。
[0066]
当基于乳化分散法时且美白候选物质为油溶性分时，例如通过混合至少包含美白剂候选物质的油相和水相并进行乳化分散而以水包油型或油包水型乳液的形式得到。
[0067]
油相可以含有美白剂候选物质、根据需要添加的乳化剂以及其他添加剂、有机溶剂等。美白剂候选物质如已叙述，关于其他化妆品材料成分，将在后面进行叙述。
[0068]
作为乳化剂，能够举出卵磷脂、甘油脂肪酸酯(例如，聚甘油油酸酯等高级脂肪酸酯)、皂苷、蔗糖脂肪酸酯(例如，蔗糖硬脂酸酯等高级脂肪酸酯)等。
[0069]
水相可以含有水、乳化剂及有机溶剂以及根据需要添加的其他化妆品材料成分。美白剂候选物质如已叙述，关于其他化妆品材料成分，将在后面进行叙述。
[0070]
作为乳化剂，能够举出卵磷脂、甘油脂肪酸酯、皂苷、蔗糖脂肪酸酯等。
[0071]
作为有机溶剂，优选可溶于水的溶剂，例如能够举出乙醇、多元醇(丁二醇、二丙二醇、甘油等)等。
[0072]
乳化能够在20℃～90℃的温度区域中进行。
[0073]
乳化能够使用超高速均质机、超声波均质机(例如，nissei corporation的超声波均质机装置us
‑
600at)等搅拌装置来进行。
[0074]
所得到的本发明的化妆品材料的形态可以为乳剂、乳液、乳膏、凝胶、蜡、洁面霜、洁面泡沫等中的任一种。
[0075]
通过本发明的美白剂的筛选方法，以与黑色素细胞分化诱导促进因子(尤其是bmp
‑
4)的基因表达水平的下降等美白效果有关的现象作为指标，能够挑选出作为美白剂而有用的美白剂候选物质。并且，通过使利用本发明的美白剂的筛选方法挑选出的美白剂候选物质含于化妆品材料中，能够提供具有美白效果的化妆品材料。
[0076]
作为本发明的化妆品材料的用途，例如可以举出化妆品(例如，化妆水、美容液等护肤化妆品材料，尤其是美白用护肤化妆品材料)的用途。作为化妆品材料，尤其能够举出
护肤化妆品材料(化妆水、乳液、美容液等)、身体用化妆品材料(身体用乳剂等)、头皮用化妆品材料等。但是，本发明的化妆品材料的用途并不限于上述。
[0077]
本发明的化妆品材料可以适当包含在化妆品中通常使用的添加成剂作为化妆品材料成分。作为添加成剂，例如可以举出在化妆品材料中使用时显示出有用的美容效果(例如，保湿效果、肌肤护理效果等)的功能性成分(例如，γ
‑
谷维素、氢化聚异丁烯等)。作为其他添加成剂，例如可以举出聚氧乙烯聚氧丙烯癸基十四烷基醚(化妆品成分表示名称：ppg
‑
6癸基十四烷基
‑
20)、聚氧乙烯氢化蓖麻油等增溶剂、特定表面活性剂以外的表面活性剂、虾青素、虾青素以外的其他类胡萝卜素(例如，番茄红素、胡萝卜素)、苯氧乙醇、乙基己基甘油等防腐剂、着色剂、增稠剂、氢氧化钠、盐酸等ph调节剂、缓冲剂、香料、抗菌剂、紫外线吸收剂、活性氧清除剂、抗微生物剂、抗炎剂、矿物质等。
[0078]
实施例
[0079]
以下，利用实施例评价由bmp
‑
4产生的黑色素产生效果，并根据评价的结果筛选美白剂候选物质，对于候选物质中作为bmp
‑
4抑制剂而发挥最优异的效果的地榆提取物验证黑色素产生抑制效果，进而，验证通过将地榆提取物进行纳米化而产生的黑色素产生抑制效果。另外，下述实施例表示实施方式的一例，本发明并不受实施例的任何限制。
[0080]
(1)bmp
‑
4的黑色素产生效果的评价
[0081]
作为发挥黑色素细胞分化诱导促进因子的作用的蛋白，例如有bmp
‑
2、bmp
‑
4、bmp
‑
7、scf、内皮素1、内皮素3、wnt3a等。对于这些蛋白质中的bmp
‑
4验证了从ips细胞向黑色素细胞分化诱导时的黑色素产生效果。
[0082]
即，制作从ips细胞的黑色素细胞分化诱导系统，并验证了向黑色素细胞的分化诱导过程中由bmp
‑
4产生的效果。
[0083]
将ips细胞(cellular dynamics international,inc.)接种在6孔板上，在成为汇合状态时，切换为依照公知文献(cell reports 3,1140
‑
1152,april 25,2013)中所记载的方法制作的神经嵴细胞诱导培养基而得到了黑色素细胞干细胞(sox10及c
‑
kit阳性细胞)。为了维持ips细胞，使用mtesr1培养基(stemcell technology公司制造)，在37℃下在5体积％co2培养箱中进行了培养。将利用上述方法得到的黑色素细胞干细胞进一步在汇合状态下培养，并且将包含培养的黑色素细胞干细胞的培养基在分化诱导培养基中培养，诱导干细胞分化为黑色素细胞，该分化诱导培养基是在将n2及b27添加因子(gibco)以推荐浓度添加到neurobasal medium(gibco)之后添加了1质量％glutamax(gibco)的培养基中添加100ng/ml scf、100ng/ml wnt3a、250ng/ml edn3(endothelin
‑
3：内皮素
‑
3)、25ng/ml bmp
‑
4、3μmchir99021、500μm dbcamp(dibutylyl circlic adenocine monophosphate：二丁酰基环腺苷一磷酸)而得到的。
[0084]
通过显微镜观察确认到第12天前后在菌落周围出现了黑色素细胞。诱导后第21天为止，观察到出现的黑色素细胞进一步进行黑色素合成的情况。根据以上，确认到通过使用本诱导系统，能够再现从干细胞分化为黑色素细胞及合成黑色素。根据以上的结果，进行了在本诱导系统中bmp
‑
4的有无对最终的黑色素产生的影响。另外，作为对照组，未添加bmp
‑
4，除此以外，使用相同组成的分化诱导培养基在相同条件下进行了培养。
[0085]
使用上述分化诱导系统，在诱导后第21天，利用mtt(3
‑
(4,5
‑
dimethyl
‑2‑
thiazolyl)
‑
2,5
‑
diphenyltetrazolium bromide：3
‑
(4,5
‑
二甲基
‑2‑
噻唑基)
‑
2,5
‑
二苯基
溴化四唑)试剂(mtt
‑
100jp，kurabo)测定了活细胞数。测定活细胞数之后，向各孔中加入黑色素溶解液(含有1mol/l naoh及10质量％dmso(dimethyl sulfoxide：二甲基亚砜)的水溶液)，通过在50℃下进行20分钟加热超声波处理而使黑色素完全溶解。
[0086]
上述溶解后，将各孔中的黑色素溶解后的黑色素溶解液中的200μl转移到96孔板中，在室温下测定400nm的吸光度，将以活细胞数修正了通过测定所得到的吸光度后的值作为最终的黑色素量。将测定的结果示于图1。图1的纵轴表示将对照组中的黑色素产生量设为1时的相对黑色素产生量。并且，“(
‑
)”的条形图表示使用了未添加bmp
‑
4的分化诱导培养基的对照组，“( )”的条形图表示将bmp
‑
4浓度设为10ng/ml而使用了分化诱导培养基的实验组。另外，各组中的条形图表示3个被检体的平均值，误差条(errorbar)表示标准偏差。
[0087]
进行测定的结果，如图1所示，实验组显示出超过对照组的2倍的黑色素产生量。接着，在对照组和实验组中通过f检验进行同方差性检验，确认到是同方差之后，实施了student的t检验。在图1中，“**”表示student的t检验中的显著水平为1％以下。即，根据图1的结果能够得到如下结论：通过bmp
‑
4的存在，基于黑色素细胞的黑色素产生量显著增加。
[0088]
根据测定的结果可知，在分化过程中，bmp
‑
4促进黑色素产生增加。因此暗示，在黑色素细胞产生黑色素的系统中，通过抑制bmp
‑
4的基因表达水平，系统中的bmp
‑
4量变少，其结果，如相对于图1的实验组的对照组的结果所示，能够抑制黑色素产生。
[0089]
(2)美白剂候选物质的筛选
[0090]
接着，以bmp
‑
4的基因表达水平的下降作为指标，进行了美白剂候选物质的筛选。具体而言，将据说有美白效果的物质中的下述候选物质1～11作为筛选对象。
[0091]
候选物质1：枇杷叶提取物(商品名：枇杷叶提取物ca，maruzen pharmaceuticals co.,ltd.)
[0092]
候选物质2：丁香提取物(商品名：丁香提取液
‑
j，maruzen pharmaceuticals co.,ltd.)
[0093]
候选物质3：儿茶提取物(商品名：儿茶提取液，maruzen pharmaceuticals co.,ltd.)
[0094]
候选物质4：山金车花的花提取物(商品名：山金车花提取液bg，maruzen pharmaceuticals co.,ltd.)
[0095]
候选物质5：库拉索芦荟叶提取物(商品名：芦荟提取物bella miyakojima，ichimaru pharcos co.,ltd.)
[0096]
候选物质6：豆浆发酵液(technoble co.,ltd.)
[0097]
候选物质7：蛾豆种子提取物(商品名：vit
‑
a
‑
like pw ls 9898，yamakawa&co.,ltd.)
[0098]
候选物质8：欧洲七叶树提取物(sabin japan corporation)
[0099]
候选物质9：甘草根提取物(商品名：甘草提取液，maruzen pharmaceuticals co.,ltd.)
[0100]
候选物质10：明日叶的叶/茎提取物(商品名：明日叶提取液bg，maruzen pharmaceuticals co.,ltd.)
[0101]
候选物质11：地榆提取物(商品名：地榆提取物粉末，maruzen pharmaceuticals co.,ltd.)
[0102]
另外，候选物质1为从枇杷(学名：eriobotrya japonica)的叶子中提取的提取物，候选物质2为从丁香(学名：syzygium aromaticum)的花蕾中提取的提取物，候选物质3为从儿茶钩藤(学名：uncaria gambir)的叶子及嫩枝中提取的提取物，候选物质4为从山金车花(学名：arnica montana)的花中提取的提取物。
[0103]
上述候选物质分别通过按以候选物质的固体成分量计成为1mg/ml的方式溶解或悬浮于如下溶液而制成候选物质液，该溶液是将dmso和以milli
‑
q(merck millipore)得到的超纯水以体积比1:1混合而成。
[0104]
通过胰蛋白酶处理回收源自人胚胎的原代表皮角质细胞(nhek，thermo fisher scientific)之后，将其悬浮于含有1％psn(青霉素
‑
链霉素
‑
新霉素)的培养基(epilife，gibco)中。进行离心(300g，3分钟，室温)以去除上清液，再次悬浮于上述培养基之后，以每一孔成为1.5
×
105cells/cm2的方式接种在12孔板上。各孔的培养基量设为1.0ml。接种后的第二天，加入上述各候选物质液10μl并充分混合，将其静放于co2培养箱(37℃)内。各候选物质的最终浓度设为10ppm。
[0105]
另外，还制备出除了未放入任何候选物质以外在相同的条件下培养了nhek的对照组。对于各候选物质的组及对照组，分别制作3个被检体并进行了下述测定。
[0106]
添加候选物质后1天之后，在各孔中去除上清液，用磷酸缓冲生理盐水(pbs)进行2次清洗，并按照实验方案，利用rna提取试剂(rneasy mini kit，quiagen)提取了所有rna。利用吸光光度计测定rna浓度之后，将30μg/μl作为rna模板，对于bmp
‑
4利用rt
‑
pcr系统(mx3000p，agilent technologies)测定ct值，根据所测定的ct值，利用使用了rt
‑
pcr(primescript one step rt
‑
pcr kit，takara bio inc.)的相对定量法(δδct法)测定了bmp
‑
4的mrna量。
[0107]
对于此次的rt
‑
pcr的靶物质即bmp
‑
4基因的正向引物的碱基序列设为下述碱基序列1，反向引物的碱基序列设为下述碱基序列2。
[0108]
碱基序列1：5'
‑
gtcctgctaggaggcgcgag
‑
3'
[0109]
碱基序列2：5'
‑
gttctccagatgttctttcg
‑
3'
[0110]
并且，作为基于rt
‑
pcr的相对定量时的管家基因，对于甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶(gapdh：glyceraldehyde
‑3‑
phosphate dehydrogenase)基因的正向引物的碱基序列设为下述碱基序列3，反向引物的碱基序列设为下述碱基序列4。
[0111]
碱基序列3：5'
‑
gcaccgtcaaggctgagaac
‑
3'
[0112]
碱基序列4：5'
‑
tggtgaagacgccagtgga
‑
3'
[0113]
针对对于各候选物质定量的bmp
‑
4基因的表达量(每种候选物质测定3个被检体，示出3个被检体的平均值和标准偏差。)，将未暴露候选物质的对照组中的bmp
‑
4的基因的表达量设为1的相对值示于图2的图表。图表的纵轴表示bmp
‑
4基因的相对表达量，横轴的数表示各候选物质的编号。各条形图表示每种候选物质的3个被检体的平均值，还用误差条示出标准偏差。其中，左端的“none”的条形图表示对照组的平均值，还用误差条示出标准偏差。并且，对于对照组和暴露各候选物质的组，分别通过f检验进行同方差性检验，验证两者的分散不能说不相等之后，实施了student的t检验。在图2中，“*”表示上述t检验中的显著水平超过1％且5％以下，“**”表示该t检验的显著水平超过0.5％且1％以下，“***”表示该t检验的显著水平为0.1％以下。
[0114]
根据图2的结果，相对于对照组，bmp
‑
4的基因表达水平显著下降的是候选物质5库拉索芦荟叶提取物、候选物质6豆浆发酵液、候选物质7蛾豆种子提取物、候选物质8欧洲七叶树提取物、候选物质9甘草提取物、候选物质10明日叶的叶/茎提取物及候选物质11地榆提取物。因此，候选物质5～11作为降低正常细胞的表皮角质细胞中的bmp
‑
4基因表达水平的bmp
‑
4抑制剂而有用。候选物质5～候选物质11相对于对照组的bmp
‑
4基因表达水平的下降率分别为38.7％、46.0％、48.5％、48.8％、51.3％、53.0％及84.7％。其中，候选物质11地榆提取物相对于对照组，抑制了80％以上的bmp
‑
4的基因表达水平，由此也暗示在候选物质5～11之中bmp
‑
4抑制作用最优异，作为bmp
‑
4抑制剂也最有用。
[0115]
(3)地榆提取物的黑色素产生抑制效果
[0116]
接着，对于在上述(2)中bmp
‑
4抑制作用最优异的地榆提取物，验证了在实际细胞中是否发挥黑色素产生抑制效果。
[0117]
通过胰蛋白酶处理回收小鼠黑素瘤细胞(b
‑
16，ds pharma animal health co.,ltd.)之后，悬浮于含有1％psn的培养基中。进行离心(300
×
g，3分钟，室温)以去除上清液，再次悬浮于上述培养基之后，以每一孔成为5
×
104cells/cm2的方式接种在12孔板上。各孔的培养基量设为1ml。第二天，去除所有培养基之后，加入包含目标浓度的地榆提取物的培养基1.0ml，将其静放于co2培养箱(37℃)中。
[0118]
上述目标浓度设为1ppm及5ppm，对培养基1ml以10μl的比例添加了将各目标浓度的100倍浓度的地榆提取物溶解于dmso而成的原液(stock solution)。1％dmso的最终浓度为1％。作为对照组，使用了赋予了不包含地榆提取物的1％dmso的培养基。使用地榆提取物浓度1ppm组及5ppm组以及浓度0的对照组共计3个组(各n＝4)来进行了试验。
[0119]
接种后3天之后，在各孔中去除上清液，用pbs进行2次清洗，利用wst试剂(cell counting kit，d
ō
jindo laboratories)检测了活细胞数。测定活细胞数之后，利用pbs对各孔进行2次清洗，并加入黑色素溶解液(1mol/lnaoh、10％dmso、水溶液)，在50℃下进行20分钟超声波处理而使其完全溶解。
[0120]
上述溶解后，将各孔中的黑色素溶解后的黑色素溶解液中的200μl转移到96孔板中，在室温下测定400nm的吸光度，将以活细胞数修正了通过测定所得到的吸光度后的值作为最终的黑色素量。将测定的结果示于图3。图的纵轴表示将对照组中的黑色素产生量设为100％时的相对黑色素产生量。并且，左端的条形图表示对照组(浓度0)的黑色素产生量，中央的条形图表示地榆提取物浓度1ppm组，右端的条形图表示浓度5ppm组。另外，各组中的条形图为4个被检体的平均值，误差条为标准偏差。
[0121]
进行测定的结果，如图3所示，可知地榆提取物浓度5ppm组相比于对照组显示出约76％的黑色素产生量，1ppm组显示出82％的黑色素产生量。接着，在对照组和实验组中通过f检验进行同方差性检验，确认到是同方差之后，实施了student的t检验。在图3中，“*”表示student的t检验中的显著水平超过1％且5％以下。即，根据图3的结果能够得到如下结论：通过被暴露于5ppm及1ppm地榆提取物，基于黑色素细胞的黑色素产生量显著减少。
[0122]
(4)纳米化地榆组合物的黑色素产生抑制效果
[0123]
(4
‑
1)纳米化地榆组合物的制备
[0124]
以下，对包含将作为bmp
‑
4抑制剂的地榆提取物纳米化而成的分散物作为美白剂的化妆品材料的实施例进行说明。在此，在本发明中，“纳米化”定义为使粒子的中值粒径小
于1μm。
[0125]
(4
‑1‑
1)纳米化组合物及非纳米化组合物的制备
[0126]
[纳米化组合物1]
[0127]
(油相的制备)
[0128]
将下述成分加热至80℃，并在维持80℃的温度的状态下搅拌1小时而得到了油相。
[0129]
γ
‑
谷维素：0.5质量％
[0130]
地榆提取物：1.0质量％
[0131]
氢化聚异丁烯：12.5质量％
[0132]
卵磷脂(乳化剂)：1.0质量％
[0133]
(水相的制备)
[0134]
将下述成分加热至80℃，并在维持80℃的温度的状态下搅拌1小时而得到了水相。
[0135]
聚甘油
‑
10油酸酯(乳化剂)：6.7质量％
[0136]
蔗糖硬脂酸酯(乳化剂)：3.3质量％
[0137]
甘油(多元醇)：40.0质量％
[0138]
水：35.0质量％
[0139]
在将所得到的油相15质量％保持为80℃的状态下加入水相85质量％，并使用超声波均质机装置(us
‑
600at，nissei corporation)进行了1分钟超声波分散。使用starburst mini(sugino machine limited co.,ltd.)，对所得到的分散物以245mpa的压力反复进行了总共3次高压乳化分散。高压乳化分散之后，使用平均孔径1μm的微滤器进行过滤，制备出作为乳化组合物的化妆品材料的纳米化组合物1。纳米化组合物1中的地榆提取物的含量为1.0质量％。
[0140]
[纳米化组合物2]
[0141]
作为乳化组合物的化妆品材料的纳米化组合物2除了将纳米化组合物1的氢化聚异丁烯替换为相同量的角鲨烷以外，通过与纳米化组合物1相同的工序进行了制备。
[0142]
[纳米化组合物3]
[0143]
作为乳化组合物的化妆品材料的纳米化组合物3除了将纳米化组合物1的氢化聚异丁烯替换为相同量的异壬酸异十三烷基酯以外，通过与纳米化组合物1相同的工序进行了制备。
[0144]
[纳米化组合物4]
[0145]
作为乳化组合物的化妆品材料的纳米化组合物4除了将纳米化组合物1的氢化聚异丁烯替换为相同量的三(辛酸/癸酸)甘油酯以外，通过与纳米化组合物1相同的工序进行了制备。
[0146]
[非纳米化组合物]
[0147]
向与纳米化组合物1同样地制备的水相组合物中加入油相组合物之后，使用螺旋桨式搅拌机(as one)搅拌1分钟，制备出作为化妆品材料的非纳米化组合物。
[0148]
(4
‑1‑
2)纳米化物的评价
[0149]
利用以下的方法对纳米化组合物1～4及非纳米化组合物进行了评价。
[0150]
[粒径的评价]
[0151]
将所得到的化妆品材料用milli
‑
q水进行稀释而使其浓度成为1质量％，并使用粒
径分析仪(fpar
‑
1000、otsuka electronics co.,ltd.)测定了分散粒子的平均粒径(中值粒径(d50))。
[0152]
[经时稳定性的评价]
[0153]
所得到的化妆品材料的刚制备后及制备后立即在50℃环境下放置3天后，将各化妆品材料用水稀释100倍，并利用分光光度计(v
‑
630，jasco corporation)测定了浊度。关于制备后3天后的浊度，根据以下的评价标准，从评价良好的一方以a、b、c及d这4个阶段进行了评价。
[0154]
a：浊度为0.025以下。
[0155]
b：浊度超过0.025且0.2以下。
[0156]
c：浊度超过0.2且0.5以下。
[0157]
d：浊度超过0.5。
[0158]
将纳米化组合物1～4及非纳米化组合物中的中值粒径及经时稳定性的评价结果示于下述表1。
[0159]
[表1]
[0160][0161]
根据上述表1可知，非纳米化组合物的中值粒径为5.6μm，相对于此，纳米化组合物1～4的化妆品材料的中值粒径在最小的纳米化组合物1中为51nm，在最大的纳米化组合物4中也达到115nm，均被纳米化。化妆品材料的经时稳定性在纳米化组合物1及纳米化组合物2中为良好评价a。但是，随着平均粒径变大，在纳米化组合物3中为b，在纳米化组合物4中为c，经时稳定性的评价变差。在平均粒径为5.6μm的未被纳米化的非纳米化组合物中为最差的评价d。认为纳米化组合物1～纳米化组合物4中的具有各中值粒径的粒子以包含地榆提取物的油滴形式作为bmp
‑
4抑制剂发挥作用。
[0162]
(4
‑
2)地榆提取物的纳米化对黑色素产生的影响评价
[0163]
使用含有黑色素细胞的皮肤模型，对将显现出bmp
‑
4基因表达水平的抑制效果的地榆提取物进行了纳米化时的美白效果进行了验证。地榆提取物是包含大量单宁或皂苷且不易溶于水的疏水性的材料，因此通过纳米尺寸化，向皮肤的渗透得到提高，能够期待与未纳米化的处方相比更高的美白效果。在本研究中，将在上述(4
‑
1)中平均粒径最小且经时稳定性评价最高的纳米化组合物1用作实验组，通过与使用了非纳米化组合物的对照组进行对比来评价了美白效果。
[0164]
含有黑色素细胞的皮肤模型(mel
‑
300b，kurabo公司)到达研究室之后，立即将培养杯(culture cup)转移到netwell中，使用维持培养基预培养了1天。预培养之后，涂布纳米化例1及非纳米化例的化妆品材料，每3天更换1次维持培养基之后，涂布化妆品材料，并
培养了1周。
[0165]
培养1周之后，取出皮肤模型的培养杯，使用pbs清洗之后，利用在(1)项中所提及的mtt试剂检测了活细胞数。测定活细胞数之后，对于各皮肤模型，利用异丙醇完全去除在mtt试剂中反应而得到的产物，并加入在(1)项中所提及的黑色素溶解液，通过在80℃下进行1小时加热处理而使其完全溶解。
[0166]
上述溶解后，将各孔中的黑色素溶解后的黑色素溶解液中的200μl转移到96孔板中，在室温下测定400nm的吸光度，根据通过测定所得到的吸光度计算出黑色素量。最终黑色素量采用了利用上述活细胞数校正后的值。
[0167]
在图4中记载了结果。图4的纵轴表示将非纳米化组合物中的黑色素产生量设为100％时的黑色素产生量。并且，“non
‑
nano
‑
sized component”的条形图表示对照组，“nano
‑
sized component”的条形图表示实验组。各组中的条形图表示3个被检体的平均值，误差条表示标准偏差。并且，对于非纳米化组合物和纳米化组合物1，分别通过f检验进行同方差性检验，确认到是同方差之后，实施了student的t检验。在图4中，“*”表示上述t检验中的显著水平超过1％且5％以下。
[0168]
根据图4的结果，通过涂布包含作为bmp
‑
4抑制剂的纳米化地榆提取物来作为美白剂的化妆品材料，黑色素产生量相对于非纳米化例减少了28％。因此，显示出通过地榆提取物的纳米化而皮肤渗透性得到提高，从而黑色素产生抑制效果增强。
[0169]
(5)化妆品材料的制造方法
[0170]
以下，对具体的化妆品材料的制造方法的例子进行说明。
[0171]
(5
‑
1)美白剂
[0172]
将(2)中所描述的作为美白剂候选物质的候选物质1～候选物质11用于(2)中所记载的筛选方法。然后，将确认到作为黑色素细胞分化诱导促进因子的bmp
‑
4的表达水平的下降的候选物质5～候选物质11中bmp
‑
4抑制作用最优异的候选物质11地榆提取物确定为美白剂。通过(4
‑1‑
1)中所描述的方法，对该地榆提取物实施纳米化而制作出纳米化组合物。在(4
‑1‑
1)中所揭示的纳米化组合物之中，将纳米化组合物1用作美白剂。
[0173]
(5
‑
2)含有虾青素的乳化组合物
[0174]
作为下述化妆品材料1～6及9的成分的含有虾青素的乳化组合物以如下方式进行了制备。
[0175]
[水相组合物a]
[0176]
将下述成分一边在70℃下进行加热一边溶解1小时而得到了水相组合物a。
[0177]
蔗糖硬脂酸酯(hlb＝16)：33.0g
[0178]
单油酸十甘油酯(hlb＝12)：67.0g
[0179]
甘油：450.0g
[0180]
纯水：300.0g
[0181]
[油相组合物a]
[0182]
将下述成分一边在70℃下进行加热一边溶解1小时而得到了油相组合物a。
[0183]
磷虾提取物：15.0g
[0184]
混合生育酚(riken vitamin.co.,ltd.，riken e oil 800)：32.0g
[0185]
中链脂肪酸甘油酯(kao corporation制造，coconard mt)：93.0g
[0186]
卵磷脂(riken vitamin.co.,ltd.制造，lecion p，源自大豆)：10.0g
[0187]
将上述中所得到的水相组合物a在保持为70℃的状态下用均质机(型号名：hp93，smt corporation)进行搅拌(10000rpm)，并向水相组合物a中添加油相组合物a而得到了预乳化物。
[0188]
随后，将所得到的预乳化物冷却至约40℃，并使用ultimaizer hjp
‑
25005(sugino machine limited co.,ltd.制造)以200mpa的压力进行了高压乳化。然后，用平均孔径1μm的微滤器进行过滤而制备出含有虾青素的乳化组合物(虾青素含有率：0.3质量％)。
[0189]
将所得到的含有虾青素的乳化组合物利用milli
‑
q水稀释为1质量％，并使用粒径分析仪fpar
‑
1000(otsuka electronics co.,ltd.)测定了分散粒子的粒径，其结果为58nm。
[0190]
另外，即使将上述磷虾提取物替换为产品名：astax
‑
st(marine daiou co.,ltd.制造)或产品名：astots
‑
s(雨生红球藻提取物，fujifilm corporation制造)，也能够得到相同的乳化组合物。
[0191]
(5
‑
3)含有番茄红素的乳化组合物的制备
[0192]
作为下述化妆品材料1、2及9的成分的含有番茄红素的乳化组合物以如下方式进行了制备。
[0193]
[水相组合物b]
[0194]
将下述成分称量到容器中，一边在70℃的恒温槽中进行搅拌一边加热混合，确认充分混合，并保持在70℃，便得到水相组合物b。
[0195]
聚甘油
‑
10油酸酯(hlb＝12.0，nikko chemicals co.,ltd.制造，decaglyn 1
‑
ov)：8.0g
[0196]
蔗糖硬脂酸酯(ryoto sugar ester s
‑
1670，mitsubishi chemical foods制造)：2.0g
[0197]
甘油：45.0g
[0198]
纯净水：余量(最大为100g)
[0199]
[油相组合物b]
[0200]
将下述成分称量到容器中，一边在150℃的热板上进行搅拌一边加热混合5分钟，确认充分混合，得到了油相组合物b。
[0201]
番茄油树脂(lyc
‑
o
‑
mato 15％(含有番茄红素15质量％)，sunbright co.,ltd.制造)：1.14g
[0202]
卵磷脂(lecion p(源自大豆)，riken vitamin.co.,ltd.制造)：1.0g
[0203]
中链脂肪酸甘油酯(coconard mt，kao corporation制造)：12.8g
[0204]
将上述中所得到的水相组合物b加入到油相组合物b中并进行搅拌混合，并使用超声波均质机使其分散规定的时间，从而得到了粗分散液。然后，进一步使用超高压乳化装置(ultimaizer，sugino machine limited co.,ltd.制造)对所得到的粗分散物进行200mpa的高压乳化，从而制备出含有番茄红素的组合物(番茄红素含有率：0.17质量％)。
[0205]
将所得到的含有番茄红素的乳化组合物利用milli
‑
q水稀释为1质量％，并使用粒径分析仪fpar
‑
1000(otsuka electronics co.,ltd.)测定了分散颗粒的粒径，其结果为52nm。
[0206]
(5
‑
4)化妆品材料的制备
[0207]
通过将(5
‑
1)中所得到的美白剂添加到下述的各化妆品材料成分中而制造出下述化妆品材料1～化妆品材料9。
[0208]
(5
‑4‑
1)化妆品材料1(化妆水)
[0209]
作为化妆品材料1，将(5
‑
1)中所得到的美白剂0.1质量％添加到下述组成的化妆品材料成分中，通过常规方法制备出化妆水(总量100质量％)。
[0210]
熊果：2.0质量％
[0211]
甘草酸二钾：1.0质量％
[0212]
二丙二醇：4.0质量％
[0213]
聚氧乙烯甲基葡萄糖苷：1.0质量％
[0214]
1,3
‑
丁二醇：4.0质量％
[0215]
聚乙二醇：1.0质量％
[0216]
乙醇：2.0质量％
[0217]
聚氧乙烯氢化蓖麻油(60e.o.)：0.2质量％
[0218]
苯氧乙醇：0.3质量％
[0219]
甘油单
‑2‑
乙基己基醚：0.2质量％
[0220]
谷维素：0.01质量％
[0221]
聚氧乙烯植物甾醇(nikkol bps
‑
20，nikko chemicals co.,ltd.制造)：0.03质量％
[0222]
n
‑
乙酰
‑
l
‑
羟基脯氨酸：1.0质量％
[0223]
水溶性胶原蛋白：1.0质量％
[0224]
水解胶原蛋白：1.0质量％
[0225]
海藻提取物(1)：1.0质量％
[0226]
含有虾青素的乳化组合物：0.2质量％
[0227]
含有番茄红素的乳化组合物：0.1质量％
[0228]
l
‑
抗坏血酸磷酸酯镁：1.0质量％
[0229]
透明质酸钠：0.2质量％
[0230]
柠檬酸：1.0质量％
[0231]
柠檬酸钠：适量
[0232]
水：余量
[0233]
(5
‑4‑
2)化妆品材料2(美容液)
[0234]
作为化妆品材料2，将(5
‑
1)中所得到的美白剂0.1质量％添加到下述组成的化妆品材料成分中，通过常规方法制备出美容液(总量100质量％)。
[0235]
l
‑
抗坏血酸磷酸酯镁：2.0质量％
[0236]
甘草酸二钾：1.0质量％
[0237]
二丙二醇：4.0质量％
[0238]
甘油：5.0质量％
[0239]
二甘油：2.0质量％
[0240]
1,2
‑
戊二醇：2.0质量％
[0241]
苯氧乙醇：0.5质量％
[0242]
对羟基苯甲酸甲酯：0.1质量％
[0243]
肥大产碱杆菌(alcaligenes latus)b
‑
16聚合物：0.05质量％
[0244]
谷维素：0.01质量％
[0245]
聚氧乙烯植物甾醇(nikkol bps
‑
20：nikko chemicals co.,ltd.制造)：0.03质量％
[0246]
聚氧乙烯氢化蓖麻油(60e.o.)：0.2质量％
[0247]
积雪草提取物：0.01质量％
[0248]
卵磷脂：0.05质量％
[0249]
柠檬酸：0.7质量％
[0250]
柠檬酸钠：适量
[0251]
n
‑
乙酰
‑
l
‑
羟基脯氨酸：1.0质量％
[0252]
水溶性胶原蛋白：1.0质量％
[0253]
水解胶原蛋白：1.0质量％
[0254]
酵母提取物(1)：1.0质量％
[0255]
含有虾青素的乳化组合物：0.2质量％
[0256]
含有番茄红素的乳化组合物：0.2质量％
[0257]
水：余量
[0258]
(5
‑4‑
3)化妆品材料3(乳膏)
[0259]
作为化妆品材料3，将(5
‑
1)中所得到的美白剂0.1质量％添加到下述组成的化妆品材料成分中，通过常规方法制备出乳膏(总量100质量％)。
[0260]
熊果：2.0质量％
[0261]
甘草酸二钾：1.0质量％
[0262]
l
‑
抗坏血酸磷酸酯镁：0.1质量％
[0263]
1,2
‑
戊二醇：3.0质量％
[0264]
二丙二醇：7.0质量％
[0265]
浓甘油：5.0质量％
[0266]
聚乙二醇6000(分子量：6000)：1.0质量％
[0267]
透明质酸钠：0.5质量％
[0268]
三甲基甘氨酸：0.5质量％
[0269]
1,3
‑
丁二醇：3.0质量％
[0270]
黄原胶：0.5质量％
[0271]
丙烯酸/甲基丙烯酸烷基酯共聚物：0.7质量％
[0272]
角鲨烷：0.5质量％
[0273]
乳油木果脂：1.0质量％
[0274]
白蜂蜡：1.0质量％
[0275]
山嵛醇：1.0质量％
[0276]
单硬脂酸甘油酯：2.0质量％
[0277]
聚氧乙烯甘油异硬脂酸酯：1.0质量％
[0278]
生育酚：0.5质量％
[0279]
虾青素：0.2质量％
[0280]
水溶性胶原蛋白：1.0质量％
[0281]
水解胶原蛋白溶液(源自鱼)：1.0质量％
[0282]
n
‑
乙酰
‑
l
‑
羟基脯氨酸：1.0质量％
[0283]
谷维素：0.01质量％
[0284]
聚氧乙烯植物甾醇(nikkol bps
‑
20：nikko chemicals co.,ltd.制造)：0.03质量％
[0285]
聚氧乙烯氢化蓖麻油(60e.o.)：0.2质量％
[0286]
积雪草提取物：0.01质量％
[0287]
卵磷脂：0.1质量％
[0288]
蔗糖脂肪酸酯：0.1质量％
[0289]
聚甘油单油酸酯：0.1质量％
[0290]
柠檬酸：0.7质量％
[0291]
柠檬酸钠：适量
[0292]
苯氧乙醇：0.3质量％
[0293]
纯净水：余量
[0294]
(5
‑4‑
4)化妆品材料4(防晒霜)
[0295]
作为化妆品材料4，将(5
‑
1)中所得到的美白剂0.1质量％添加到下述组成的化妆品材料成分中，通过常规方法制备出防晒霜(总量100质量％)。
[0296]
环五硅氧烷：20.0质量％
[0297]
聚二甲基硅氧烷：10.0质量％
[0298]
氧化钛：5.0质量％
[0299]
叔丁基甲氧基苯甲酰基甲烷：1.0质量％
[0300]
hxmt
‑
100za(tayca corporation制造，平均一次粒径15nm)：6.0质量％
[0301]
氢氧化铝：1.0质量％
[0302]
异硬脂酸：0.5质量％
[0303]
脱水山梨醇倍半油酸酯：1.0质量％
[0304]
甘草酸二钾：0.5质量％
[0305]
l
‑
抗坏血酸磷酸酯镁：0.1质量％
[0306]
磷虾提取物：0.5质量％
[0307]
水溶性胶原蛋白：1.0质量％
[0308]
柠檬酸：0.7质量％
[0309]
柠檬酸钠：适量
[0310]
生育酚：0.5质量％
[0311]
谷维素：0.01质量％
[0312]
聚氧乙烯植物甾醇(nikkol bps
‑
20：nikko chemicals co.,ltd.制造)：0.03质量％
[0313]
聚氧乙烯氢化蓖麻油(60e.o.)：0.2质量％
[0314]
积雪草提取物：0.01质量％
[0315]
卵磷脂：0.1质量％
[0316]
香料：微量
[0317]
对羟基苯甲酸甲酯：0.15质量％
[0318]
纯净水：余量
[0319]
(5
‑4‑
5)化妆品材料5(乳液)
[0320]
[油相组合物c]
[0321]
将(5
‑
1)中所得到的美白剂0.1质量％添加到下述组成的化妆品材料成分中而制备出油相组合物c。
[0322]
雨生红球藻抽取物：0.2质量％
[0323]
含有虾青素的乳化组合物：0.4质量％
[0324]
角鲨烷：8.0质量％
[0325]
霍霍巴油：7.0质量％
[0326]
鲸蜡醇：1.5质量％
[0327]
[水相组合物c]
[0328]
并且，混合下述组成的化妆品材料成分而制备出水相组合物c。
[0329]
单硬脂酸甘油酯：2.0质量％
[0330]
聚氧乙烯十六烷基醚：3.0质量％
[0331]
聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯：2.0质量％
[0332]
1,3
‑
丁二醇：1.0质量％
[0333]
甘油：2.0质量％
[0334]
蔗糖硬脂酸酯：0.1质量％
[0335]
聚甘油
‑
10油酸酯：0.1质量％
[0336]
聚甘油
‑
2硬脂酸酯：0.1质量％
[0337]
苯氧乙醇：0.2质量％
[0338]
胶原蛋白：1.0质量％
[0339]
谷维素：0.01质量％聚氧乙烯植物甾醇(nikkol bps
‑
20，nikko chemicals co.,ltd.制造)：0.03质量％
[0340]
聚氧乙烯氢化蓖麻油(60e.o.)：0.2质量％
[0341]
积雪草提取物：0.01质量％
[0342]
卵磷脂：0.05质量％
[0343]
熊果苷：0.5质量％
[0344]
甘草酸二钾：0.5质量％
[0345]
柠檬酸：1.0质量％
[0346]
柠檬酸钠：适量
[0347]
香料：微量
[0348]
纯净水：余量
[0349]
将上述油相组合物c及水相组合物c分别加热至70℃，并一边乳化一边搅拌，由此制备出作为化妆品材料5的乳液(总量100质量％)。
[0350]
(5
‑4‑
6)化妆品材料6(胶状美容液)
[0351]
作为化妆品材料6，将(5
‑
1)中所得到的美白剂0.1质量％添加到下述组成的化妆品材料成分中，通过常规方法制备出胶状美容液(总量100质量％)。
[0352]
雨生红球藻抽取物：0.1质量％
[0353]
含有虾青素的乳化组合物：0.2质量％
[0354]
神经酰胺iii、vi混合物：1.0质量％
[0355]
水解胶原蛋白：1.0质量％
[0356]
乙酰羟基脯氨酸：1.0质量％
[0357]
乙基己基甘油：0.1质量％
[0358]
油酸：0.5质量％
[0359]
1,3
‑
丁二醇：1.0质量％
[0360]
甘油：2.0质量％
[0361]
蔗糖：0.1质量％
[0362]
聚甘油
‑
10油酸酯：0.1质量％
[0363]
聚甘油
‑
2硬脂酸酯：0.1质量％
[0364]
苯氧乙醇：0.2质量％
[0365]
胶原蛋白：1.0质量％
[0366]
谷维素：0.01质量％
[0367]
聚氧乙烯植物甾醇(nikkol bps
‑
20：nikko chemicals co.,ltd.制造)：0.03质量％
[0368]
聚氧乙烯氢化蓖麻油(60e.o.)：0.2质量％
[0369]
积雪草提取物：0.01质量％
[0370]
卵磷脂：0.1质量％
[0371]
柠檬酸：1.0质量％
[0372]
柠檬酸钠：适量
[0373]
(peg
‑
240/癸基十四醇聚醚
‑
20/hdi)共聚物：0.3质量％
[0374]
大马士革玫瑰花油：微量
[0375]
香料：微量
[0376]
纯净水：余量
[0377]
(5
‑4‑
7)化妆品材料7(湿式粉底)
[0378]
将(5
‑
1)中所得到的美白剂0.1质量％添加到下述组成的化妆品材料成分中而制备浆料，并将其填充于规定的容器中并进行干燥，由此制作出作为化妆品材料7的固体粉末化妆品材料(湿式粉底)(总量100质量％)。
[0379]
滑石(ots
‑
2talk ja
‑
46r，daito kasei kogyo co.,ltd.制造)：18质量％
[0380]
氧化钛(ots
‑
2tio2 cr
‑
5，daito kasei kogyo co.,ltd.制造)：9.0质量％
[0381]
氧化铁黄(ots
‑
2yellow llxlo，daito kasei kogyo co.,ltd.制造)：2.3质量％
[0382]
氧化铁红(ots
‑
2red r
‑
516l，daito kasei kogyo co.,ltd.制造)：0.15质量％
[0383]
氧化铁黑(ots
‑
2black bl
‑
100，daito kasei kogyo co.,ltd.制造)：0.3质量％
[0384]
珠光颜料(金色)
[0385]
(ronaflair balance gold，merck制造)：13质量％
[0386]
珠光颜料(红色)
[0387]
(trans prisma red，merck制造)：7.0质量％
[0388]
复合粉体颜料(hnb red7，daito kasei kogyo co.,ltd.制造)：1.0质量％
[0389]
聚二甲基硅氧烷
·
三甲基硅烷氧基硅酸酯(dc593，dow corning toray co.,ltd.制造)：3.0质量％
[0390]
聚二甲基硅氧烷(sh200c
‑
20cs，dow corning toray co.,ltd.制造)：7.0质量％
[0391]
苯氧乙醇：0.5质量％
[0392]
绢云母(ots
‑
2sericite fse，daito kasei kogyo co.,ltd.制造)：余量
[0393]
(5
‑4‑
8)化妆品材料8(粉底液)
[0394]
作为化妆品材料8，将(5
‑
1)中所得到的美白剂0.1质量％添加到下述组成的化妆品材料成分中，通过常规方法制备出粉底液(w/o乳化物)(总量100质量％)。
[0395]
甘草酸二钾：0.2质量％
[0396]
特定红色复合颜料(hnb red7，daito kasei kogyo co.,ltd.制造)：0.5质量％
[0397]
体质颜料(将ots
‑
2sericite pse及ots
‑
2talk ja
‑
46r(均为daito kasei kogyo co.,ltd.制造)以7:3的比例混合而成的颜料)：15.0质量％
[0398]
色材(color material)颜料(将ots
‑
2tio2 cr
‑
50、ots
‑
2yellow llxlo、ots
‑
2red r
‑
516l及ots
‑
2black bl
‑
100(均为daito kasei kogyo co.,ltd.制造)以78:19:1:2的比例混合而成的颜料)：2.0质量％
[0399]
珠光颜料(将ronaflair balance gold与trans prisma red(均为merck制造)以7:3的比例混合而成的颜料)：3.0质量％
[0400]
环聚二甲基硅氧烷(cyclomethicone)：25.0质量％
[0401]
聚二甲基硅氧烷多元醇：5.0质量％
[0402]
月桂基peg
‑
9聚二甲基硅氧乙基聚二甲基硅氧烷：3.0质量％
[0403]
peg
‑
9聚二甲基硅氧乙基聚二甲基硅氧烷：1.2质量％
[0404]
角鲨烷：0.1质量％
[0405]
脱水山梨醇倍半异硬脂酸酯：1.0质量％
[0406]
二硬脂二甲铵锂蒙脱石：0.8质量％
[0407]
甲氧基肉桂酸乙基己酯：2.5质量％
[0408]
雨生红球藻油：0.1质量％
[0409]
生育酚：0.1质量％
[0410]
大马士革玫瑰花油：微量
[0411]
香料：适量
[0412]
苯氧乙醇：0.3质量％
[0413]
甘油：10.0质量％
[0414]
二丙二醇：4.0质量％
[0415]
1,3
‑
丁二醇：3.0质量％
[0416]
水溶性胶原蛋白：0.1质量％
[0417]
蜂王浆提取物：0.1质量％
[0418]
谷维素：0.01质量％
[0419]
聚氧乙烯植物甾醇(nikkol bps
‑
20：nikko chemicals co.,ltd.制造)：0.03质量％
[0420]
聚氧乙烯氢化蓖麻油(60e.o.)：0.2质量％
[0421]
积雪草提取物：0.01质量％
[0422]
卵磷脂：0.1质量％
[0423]
氯化钙：1.0质量％
[0424]
柠檬酸：1.0质量％
[0425]
柠檬酸钠：适量
[0426]
离子交换水：余量
[0427]
(5
‑4‑
9)化妆品材料9(洗面奶)
[0428]
作为化妆品材料9，将(5
‑
1)中所得到的美白剂0.1质量％添加到下述组成的化妆品材料成分中，通过常规方法制备出洗面奶(总量100质量％)。
[0429]
肉豆蔻酸钾：2.0质量％
[0430]
棕榈酸钾：0.5质量％
[0431]
硬脂酸钾：0.5质量％
[0432]
月桂酰胺/肉豆蔻酰胺dea：1.0质量％
[0433]
椰油酰甘氨酸钠：10.0质量％
[0434]
月桂酰两性基钠：13.0质量％
[0435]
peg
‑
32：3.0质量％
[0436]
丁二醇：15.0质量％
[0437]
甘油：10.0质量％
[0438]
山梨糖醇：5.0质量％
[0439]
氢氧化钾：适量
[0440]
硬脂酸甘油酯：1.5质量％
[0441]
雨生红球藻油：0.05质量％
[0442]
含有虾青素的乳化组合物：0.05质量％
[0443]
含有番茄红素的乳化组合物：0.1质量％
[0444]
水溶性胶原蛋白：1.0质量％
[0445]
生育酚：0.5质量％
[0446]
柠檬酸：1.0质量％
[0447]
柠檬酸钠：适量
[0448]
乳油木果脂：1.0质量％
[0449]
聚季铵盐
‑
7：0.5质量％
[0450]
聚季铵盐
‑
39：0.5质量％
[0451]
月桂酰谷氨酸钠：1.0质量％
[0452]
谷维素：0.01质量％
[0453]
聚氧乙烯植物甾醇(nikkol bps
‑
20，nikko chemicals co.,ltd.制造)：0.03质量％
[0454]
聚氧乙烯氢化蓖麻油(60e.o.)：0.2质量％
[0455]
积雪草提取物：0.01质量％
[0456]
苯氧乙醇：0.5质量％
[0457]
大马士革玫瑰花油：微量
[0458]
香料：微量
[0459]
(5
‑4‑
10)化妆品材料10(美容液)
[0460]
作为化妆品材料10，将(5
‑
1)中所得到的美白剂0.1质量％添加到下述组成的化妆品材料成分中，通过常规方法制备出美容液(总量100质量％)。
[0461]
l
‑
抗坏血酸磷酸酯镁：2.0质量％
[0462]
甘草酸二钾：1.0质量％
[0463]
二丙二醇：4.0质量％
[0464]
地榆提取物(商品名：地榆提取物粉末，maruzen pharmaceuticals co.,ltd.)：0.001质量％
[0465]
甘油：5.0质量％
[0466]
二甘油：2.0质量％
[0467]
1,2
‑
戊二醇：2.0质量％
[0468]
苯氧乙醇：0.5质量％
[0469]
对羟基苯甲酸甲酯：0.1质量％
[0470]
肥大产碱杆菌(alcaligenes latus)b
‑
16聚合物：0.05质量％
[0471]
谷维素：0.01质量％
[0472]
聚氧乙烯植物甾醇(nikkol bps
‑
20：nikko chemicals co.,ltd.制造)：0.03质量％
[0473]
聚氧乙烯氢化蓖麻油(60e.o.)：0.2质量％
[0474]
积雪草提取物：0.01质量％
[0475]
卵磷脂：0.05质量％
[0476]
柠檬酸：0.7质量％
[0477]
柠檬酸钠：适量
[0478]
n
‑
乙酰
‑
l
‑
羟基脯氨酸：1.0质量％
[0479]
水溶性胶原蛋白：1.0质量％
[0480]
水解胶原蛋白：1.0质量％
[0481]
酵母提取物(1)：1.0质量％
[0482]
含有虾青素的乳化组合物：0.2质量％
[0483]
含有番茄红素的乳化组合物：0.2质量％
[0484]
烟酰胺：5.0质量％
[0485]
水：余量