蛋白质样品浓度测定方式选择法及测定方法与流程

1.本公开涉及生物分析领域，具体涉及一种快速准确的测定蛋白质样品浓度的方法，尤其是测定高浓度、高消光系数蛋白质样品浓度的方法。


背景技术：

2.在生物分析领域，蛋白质样品的浓度测定多采用传统的紫外分光光度法(uv)，其测定原理基于朗伯-比尔定律(lambert-beer law)：a＝ecl，式中a为吸光度，e为摩尔消光系数(与吸收物质的性质和入射光的波长λ有关)，c为吸光物质浓度(单位：mol/l)，l为透光液层厚度(单位：cm)。一般来说，当吸光度在0.3～0.7之间时，仪器具有较小的测定误差和较高的灵敏度。
3.然而，朗伯-比尔定律必须满足以下适用条件：a.入射光为单色平行光；b.吸收发生在均匀介质中；c.吸收物质及溶剂无相互作用。因此，在实际应用当中，偏离朗伯-比尔定律的情况很多，往往吸光物质浓度越高，测量误差越大，且绝大多数是向下偏离。
4.目前，对于浓度较高的蛋白质样品，多采用称重稀释法来获得较低浓度的样品，且需测定稀释前后样品溶液的密度来计算稀释倍数。这些过程繁琐，且易引入称量和稀释操作过程中的人为误差。这对于需要对蛋白质样品浓度进行精确计量的领域或过程，例如生物制药产品研发过程和质量控制体系，都造成了潜在风险。
5.可变光程分光光度法是光程可发生变化的分光光度测定方法。例如，其光程长度可为0.005mm～15mm。该领域中世界首台可变光程的uv-vis分光光度计是solovpe系统，由c technologies,inc提供。该仪器可为斜率光谱系统，其将光纤技术与传统的光谱技术相结合。光纤耦合器捕获来自agilent cary 60紫外分光光度计的光束，并将其带入光纤(fibrette
tm
)，光纤插入样品溶液使光束进入样品并到达样品池下方的检测器。光纤可相对样品池底部上下移动以精确控制光程的变化。该系统可通过变换不同的光程测得对应的吸光度，以吸光度对光程作图并进行线性回归分析，可得线性方程：a＝ml b，其中a为吸光度，m为斜率，l为光程，b为截距。根据朗伯-比尔定律，a＝ecl，经变换后即为：a/l＝ec＝m，在已知消光系数e的条件下，即可根据公式c＝m/e求出浓度c。
6.以solovpe为例，与传统的uv法相比，可变光程技术有着如下显著区别：
7.(1)solovpe的光程变化范围为0.005～15.000mm，而传统uv法为10mm；
8.(2)solovpe可设置多个光程，而传统uv的光程固定；
9.(3)solovpe测定无需稀释即可直接测定，传统uv法需通过称重稀释法将其稀释至合适的范围；
10.(4)solovpe一般情况下无需背景校正，而传统uv法需要。
11.由于solovpe不涉及天平称量、密度测定等繁琐操作，其尤其对于gmp实验室大大节省了人力和时间，具有高效率和高通量的显著优势，深受分析人员的青睐。
12.目前绝大部分关于solovpe的文献均突出solovpe测定快速、准确度高、精密度好等优点，认为其可以完全替代传统uv。然而，申请人在实际应用和研究中发现，事实上
solovpe在实际应用中存在一定的限制。
13.美国专利公开号us2019033208a1(发明名称：interactive variable path length device)描述了可变光程装置solovpe，其使用的模型蛋白质为牛血清白蛋白(bsa)，其消光系数为0.67，可测浓度范围高达330mg/ml。然而，生物制药领域涉及的大多数蛋白的消光系数普遍在1.3～1.8之间，几乎为bsa消光系数的两倍多，因此bsa并不具有代表性。
14.临床应用中，蛋白质类药物给药途径多为注射给药，且给药剂量通常较高，如赫赛汀(herceptin)为2～8mg/kg，西妥昔单抗爱必妥(erbitux)为250～400mg/m2。为了减小注射体积(皮下注射要求注射体积＜1.5ml)，提高病人依从性，很多蛋白质类药物需要制成浓度高于100mg/ml的高浓度制剂。然而，本技术人在实际应用中发现，对于高浓度高消光系数蛋白质样品，solovpe测得浓度结果往往较理论值有较大偏离。
15.可变光程分光光度法可通过快速斜率模式(quick slope mode)选择参数如目标吸光度(target abs)来优化数据的收集。如光程点个数(data points)设置为10，目标吸光度设置为1.00000，检测波长为280nm，仪器会自动搜索并锁定280nm吸光度为1.00000对应的光程，然后以固定间隔自动选取更小的9个光程点进行线性拟合。然而，当样品浓度和消光系数较高(浓度≥100mg/ml且消光系数≥1.3)时，受仪器最小光程的限制，仪器会选取更大的光程点以满足预设的光程点个数的数目要求，这往往导致线性拟合曲线中一个或多个光程点对应的吸光度过高，超过仪器耐受的吸光度范围，产生较大的线性偏差，从而导致测得浓度结果显著低于理论值。
16.由此，本领域中迫切需要开发出能够快速准确地测定高浓度、高消光系数蛋白质样品浓度的方法。


技术实现要素：

17.本公开正是提供了一种选择适应于蛋白质样品特点(例如高浓度、高消光系数蛋白质样品)的蛋白质浓度测定方式及参数的方法。本公开还提供了测定蛋白质样品(尤其是高浓度、高消光系数蛋白质样品)浓度的方法。
18.在本公开的第一方面中，提供了一种选择蛋白质样品测定方式及参数的方法，其包括以下步骤：
19.(1)使用可变光程分光光度法(例如solovpe)测定样品中的蛋白质浓度，其中测量模式为快速斜率模式(quick slope mode)，光程点个数(data points)为8～10个，目标吸光度(target abs)为0.7～1.5，测得结果c1；
20.若各光程点测得的最大吸光度a
max
≤1.5，则选择采用步骤(1)的可变光程分光光度法和参数来测定蛋白质浓度；若各光程点测得的最大吸光度a
max
＞1.5，则进行步骤(2)；
21.(2)采用蛋白质样品中蛋白质浓度测定的标准方法(例如使用紫外分光光度法通过称重稀释、经空白对照校正后测定蛋白质浓度)，测得结果c2；
22.(3)比较c1与c2的相对差异，根据以下公式计算d％值：
23.d％＝|c
1-c2|/c2×
100％
24.若d％不超过预设的阈值，例如d％≤2.0％，则选择采用步骤(1)的可变光程分光光度法和参数来测定蛋白质浓度；若d％超过了预设的阈值，例如d％＞2.0％，则进行步骤
(4)；
25.(4)调整可变光程分光光度法中所用参数设置，将快速斜率模式中的光程点个数设置为5～7，其他参数保持不变，再次测定蛋白质浓度，测得结果c3；
26.(5)比较c3与c2的相对差异，根据以下公式计算d％值：
27.d％＝|c
3-c2|/c2×
100％
28.若d％不超过预设的阈值，例如d％≤2.0％，则选择采用步骤(4)的可变光程分光光度法和参数来测定蛋白质浓度；如果d％超过了预设的阈值，例如d％＞2.0％，则采用步骤(2)的分光光度法来测定蛋白质浓度。
29.在一些实施方式中，通过以不同浓度标准样品重复所述方法来确定适于所选方式和参数的样品浓度范围。
30.在一些实施方式中，蛋白质为天然蛋白质或合成蛋白质，例如包括但不限于抗体、酶、激素、膳食蛋白或其片段。
31.在一些实施方式中，蛋白质包含修饰，例如包括但不限于糖基化、甲基化、磷酸化、乙酰化、羟基化修饰。
32.在一些实施方式中，蛋白质包含非天然氨基酸，例如包括但不限于d-氨基酸、吡咯赖氨酸。
33.在一些实施方式中，蛋白质样品中的蛋白质浓度≥100mg/ml，例如≥120mg/ml、≥150mg/ml、≥180mg/ml、≥200mg/ml、≥250mg/ml、≥300mg/ml、≥400mg/ml、≥500mg/ml或由这些端点组成的任何浓度范围，如100～200mg/ml、100～500mg/ml。
34.在一些实施方式中，蛋白质样品中蛋白质的消光系数值≥1.3，例如≥1.4、≥1.5、≥1.6、≥1.7、≥1.8、≥1.9、≥2.0。
35.在一些实施方式中，所述预设的阈值范围为d％≤5.0％、≤4.0％、≤3.0％、≤2.0％、≤1.5％、≤1.0％或≤0.5％。
36.在一些实施方式中，可变光程分光光度法测定中所用样品池为塑料或石英材质，例如型号选自下组的样品池：oc0009-1、oc0005-1、oc0005-2或oc0005-3。
37.在一些实施方式中，可变光程分光光度法测定中采用了solovpe仪器，例如所用光纤具有选自下组的一个或多个特征的solovpe仪器：
38.材质：二氧化硅和/或聚酰亚胺；长度：57.2mm；直径：＜1mm，例如0.7mm；波长：190nm～1100nm。
39.在一些实施方式中，所采用的分光光度法为紫外分光光度法，例如采用紫外分光光度计，如agilent cary 100、岛津uvmini-1240、普析tu-1810等。
40.在一些实施方式中，步骤(2)中所用样品池为塑料或石英材质。
41.在一些实施方式中，步骤(2)中校正所用空白对照为不含待测蛋白质的空白溶液，例如用于配制蛋白质样品的缓冲液或载剂等，如水、盐水、吐温、甘油、乙醇、缓冲液、培养基。
42.在一些实施方式中，步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)中，检测波长为200～300nm，例如280nm，可根据蛋白质的特点确定检测波长。
43.在本公开的另一方面中，还提供了一种测定蛋白质样品中蛋白质浓度的方法，所述方法包括：根据本公开选择蛋白质样品测定方式及参数的方法选择适于所述蛋白质的浓
度测定方式和参数；采用所选测定方式及参数测定所述蛋白质样品中蛋白质浓度。
44.本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本公开的发明构思和保护范围。本公开的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
45.下面结合附图对本公开作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本公开的实施方案，而不是为了局限本公开的范围。
46.图1：本公开示例性实施方式的流程图。
具体实施方式
47.本公开中提供了一种选择和/或高效简便检测蛋白质样品中蛋白质浓度的方法。在一些实施方式中，本公开针对现有技术中高浓度、高消光系数蛋白质样品浓度测定繁琐以及测定结果与理论值有较大偏差的问题，提供了一种选择蛋白质样品中蛋白质浓度的测定方式和参数，并以所选择的方式和参数快速准确的高浓度、高消光系数蛋白质样品浓度的测定方法。
48.具体而言，目前绝大部分关于solovpe的文献均突出solovpe测定快速，准确度高，精密度好的优点，可以完全替代传统uv。然而，在申请人却出乎意料地发现当solovpe测定样品的最大吸光度大于1.5时，存在测定结果不准确的现象；对于某些浓度特别高或消光系数特别高的蛋白分子，solovpe是无法替代传统uv方法的。
49.本公开结合传统紫外分光光度法和新型可变光程分光光度法，显著提高蛋白质浓度的测定速度；通过调整可变光程分光光度测试的参数设置，降低数据采集过程中光程点个数，使线性拟合曲线中的最大吸光度控制在≤1.5的范围内，以减小线性偏差，获得准确可靠的结果。
50.此外，申请人还进一步对通过本公开选择的检测方法和参数进行了方法学的进一步验证(例如针对本公开实施例部分所选定的方法)，证明了所选方法在专属性、线性、范围、精密度和中间精密度方面均符合要求。
51.本公开可产生例如但不限于如下的有益效果：本公开提供了一种快速准确的测定高浓度、高消光系数蛋白质浓度的方法，本方法充分利用了可变光程分光光度法(例如solovpe)操作简便的优势，改善了传统uv法样品制备繁琐、耗时费力的现状，尤其对于gmp实验室，避免了实验室调查过程中的诸多环节，如天平称量、密度测定、稀释操作等，大大缩短检测时间，有效提高分析效率。同时，本方法解决了高浓度、高消光系数蛋白质样品solovpe测定结果与理论值有较大偏差的问题，通过降低参数设置中data points的个数，使线性拟合曲线中的最大吸光度控制在仪器精密度的最佳范围内，从而有效减小线性偏差，得到准确可靠的浓度结果。本方法加强了对临床阶段高浓度蛋白药物的分析支持，有助于生物制药企业进一步提高蛋白类产品质量分析和控制的效率与效益。
52.如本文所用，术语“蛋白质样品”或“蛋白样品”可互换使用，均是指包含蛋白质或肽的样品，其中所述蛋白质或肽可包含2个或以上的连续氨基酸，可为小分子或大分子。在一些实施方式中，所述蛋白质或肽可为天然产物(例如纯化的天然产物)，或是化学合成的
产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。在一些实施方式中，本公开的蛋白质或多肽可以包括或不包括修饰，例如糖基化修饰、甲基化修饰、磷酸化修饰等。在一些实施方式中，本公开的蛋白质或多肽可包含非天然氨基酸。
53.本公开中的蛋白质样品可包含载剂，以蛋白质或多肽处于可用于本技术方法的状态下，例如形成蛋白质溶液。如本文所用，术语“载剂”可指用于承载蛋白质或肽的各种赋形剂和稀释剂。在一些实施方式中，所述载剂不会对本公开的方法产生不利影响，或有利于本公开方法的实施。可用于制备本公开蛋白质或肽样品的载剂包括但不限于：水、盐水、吐温、甘油、乙醇、缓冲液、培养基。
54.另外，这些载剂中还可能存在辅助性的物质，如ph缓冲物质等。通常，可将蛋白质配制于无毒的、惰性的水性载剂中，优选生理学或药学上可接受的水性载剂中。
55.在本文中，以标准分光光度法(例如紫外分光光度法)测得结果为参考值，用d％来评估测试方法的可行性，d％表示采用可变光程分光光度法测得的样品中蛋白质浓度与采用标准分光光度法(例如紫外分光光度法)测得的样品中蛋白质浓度之间差值与采用标准分光光度法(例如紫外分光光度法)测得的样品中蛋白质浓度之比，可以百分比计。可采用如下公式计算d％：
56.d％＝|cv-cs|/cs
×
100％
57.其中，cv表示采用可变光程分光光度法测得的样品中蛋白质浓度，cs表示采用标准分光光度法测得的样品中蛋白质浓度。
58.本公开方法中d％的阈值可根据测定所需精密度，或根据可变光程分光光度法和标准分光光度法所用仪器(例如solovpe与传统紫外分光光度计)的样品测定精密度来设定。d％的阈值范围可包括例如≤5.0％、≤4.0％、≤3.0％、≤2.0％、≤1.5％、≤1.0％或≤0.5％。
59.蛋白质浓度的标准分光光度法检测方法如本领域中所知。可参见例如《中国药典2015年版第四部》通则0401(紫外-可见分光光度法)中描述的吸收系数法。可采用例如传统uv法如cary100以传统uv法检测蛋白质浓度，其测定结果为业内公认的准确可靠的浓度测定方法。
60.本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本公开提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
61.如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”、和“由
……
构成”；“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”和“由
……
构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
62.实施例
63.下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。本领域技术人员可对本公开做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本公开的范围之内。
64.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法或按照供应商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本公开方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
65.实施例1
66.测试样品：蛋白分子a，消光系数1.631ml/(mg*cm)，目标浓度：100mg/ml。
67.使用solovpe厂家推荐默认参数直接测定蛋白质浓度，测量模式：快速斜率模式(quick slope mode)，光程点个数(data points)：10，目标吸光度(target abs)：1.00000，检测波长为280nm，测得平行3次读数10个光程点中最大吸光度a
max
分别为1.4、1.4、1.5(表1)，均≤1.5，可直接使用solovpe厂家推荐默认参数测定。测得结果分别为100.0、99.6、99.0mg/ml，平均值为99.5mg/ml(cary100(安捷伦)测得结果为100.7mg/ml)，rsd为0.5％。
68.表1.solovpe快速斜率模式测试结果
[0069][0070]
其中pl表示光程(pathlength)
[0071]
实施例2
[0072]
测试样品：蛋白分子b，消光系数1.496ml/(mg*cm)，目标浓度：157mg/ml。
[0073]
使用solovpe厂家推荐默认参数直接测定蛋白质浓度，测量模式：快速斜率模式(quick slope mode)，光程点个数(data points)：10，目标吸光度(target abs)：1.00000，检测波长为280nm，平行3次读数10个光程点中最大吸光度a
max
分别为1.8、1.8、1.8(表2)，均＞1.5，测得结果分别为153.4、153.6、153.2mg/ml，平均值c1为153.4mg/ml，rsd为0.1％。
[0074]
使用cary 100通过称重稀释步骤经空白校正后测定蛋白质浓度(稀释溶剂和空白校正溶液均为不含蛋白分子b的空白制剂处方溶液)，平行制备3份溶液，每份溶液测定1次，检测波长为280nm，测得结果分别为157.1、156.6、156.2mg/ml，平均值c2为156.6mg/ml，rsd为0.3％。
[0075]
根据公式d％＝|c
1-c2|/c2×
100％，计算c1与c2的d％为2.0％，二者浓度结果在精密度可接受范围内，可以使用solovpe厂家推荐默认参数直接测定。
[0076]
表2.solovpe快速斜率模式测试结果
[0077][0078]
实施例3
[0079]
测试样品：蛋白分子b(同实施例2)，消光系数1.496ml/(mg*cm)，目标浓度：178mg/ml。
[0080]
使用solovpe厂家推荐默认参数直接测定蛋白质浓度，测量模式：快速斜率模式(quick slope mode)，光程点个数(data points)：10，目标吸光度(target abs)：1.00000，检测波长为280nm，平行3次读数10个光程点中最大吸光度a
max
分别为2.0、2.0、2.0(表3)，均＞1.5，测得结果分别为170.5、170.5、170.2mg/ml，平均值c1为170.4mg/ml，rsd为0.1％。
[0081]
使用cary 100通过称重稀释步骤经空白校正后测定蛋白质浓度(稀释溶剂和空白校正溶液均为不含蛋白分子b的空白制剂处方溶液)，平行制备3份溶液，每份溶液测定1次，检测波长为280nm，测得结果分别为178.0、178.4、178.0mg/ml，平均值c2为178.2mg/ml，rsd为0.1％。
[0082]
计算c1与c2的d％为4.4％，>2.0％，二者浓度结果有较大偏差。
[0083]
调整solovpe仪器参数，将光程点个数(data points)改为5后再次测定，quick slope结果见表。测得3次结果分别为176.3、178.5、177.8mg/ml，平均值c3为177.5mg/ml，rsd为0.7％。
[0084]
计算c3与c2的d％为0.4％，＜2.0％，二者浓度结果一致。可使用solovpe直接测定，需调整光程点个数(data points)为5。
[0085]
表3.solovpe quick slope原始数据
[0086][0087]
实施例4
[0088]
测试样品：蛋白分子a(同实施例1)，消光系数1.631ml/(mg*cm)，目标浓度：170mg/ml。
[0089]
使用solovpe厂家推荐默认参数直接测定蛋白质浓度，测量模式：快速斜率模式(quick slope mode)，光程点个数(data points)：10，目标吸光度(target abs)：1.00000，检测波长为280nm，平行3次读数10个光程点中最大吸光度a
max
分别为1.9、2.1、2.0(表4)，均＞1.5，测得结果分别为162.1、158.4、161.3mg/ml，平均值c1为160.6mg/ml，rsd为1.2％。
[0090]
使用cary 100通过称重稀释步骤经空白校正后测定蛋白质浓度(稀释溶剂和空白校正溶液均为不含蛋白分子a的制剂处方溶液)，平行制备3份溶液，每份溶液测定1次，检测波长为280nm，测得结果分别为169.3、170.7、169.3mg/ml，平均值c2为169.8mg/ml，rsd为0.5％。
[0091]
计算c1与c2的d％为5.4％，>2.0％，二者浓度结果有较大偏差。
[0092]
调整solovpe仪器参数，将光程点个数(data points)改为5后再次测定，quick slope结果见表。测得3次结果分别为166.6、167.5、163.6mg/ml，平均值c3为165.9mg/ml，rsd为1.2％。
[0093]
计算c3与c2的d％为2.3％，>2.0％，二者浓度结果仍有较大偏差。solovpe无法准确
测定，应使用cary 100测定。
[0094]
表4.solovpe快速斜率模式测试结果
[0095][0096][0097]
综合以上实施例1～4的结果，本方法可快速准确的测定高浓度、高消光系数的蛋白质浓度，并可确定可用于不同蛋白质样品的适宜方法。
[0098]
在本公开提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本公开的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本公开作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。