含细胞水凝胶微球的制备方法及制备装置

本发明属于凝胶材料制备领域，尤其涉及含细胞水凝胶微球的制备方法及制备装置。

背景技术：

1、近年来，生物、化学、医药、化妆品、食品及功能材料领域，均在开发各类基于微尺寸水凝胶颗粒的技术。该类水凝胶微球可应用于药物载体、细胞培养平台、功能材料、包封体系等多个领域，其中颗粒尺寸均一性与形态稳定性是核心关键指标。

2、此外，组织工程、再生医学、类器官制备、生物打印领域对三维细胞培养载体的需求大幅提升。尤其是载细胞水凝胶微球，可诱导细胞间、细胞-基质相互作用，相比传统二维培养体系，能更好模拟体内微环境。因此，批量制备粒径均一的载细胞微球的技术需求持续增长。

3、现有已知水凝胶微球主流制备方法分为以下几类：

4、第一种为微流控芯片制备法。该方法可在微通道内生成液滴，制备粒径相对均匀的颗粒，但设备结构复杂、维护难度大；微流控芯片加工工艺繁琐，使用油相后纯化工序繁琐，设备加工与运行成本高昂。同时设备复杂度高，难以适配常规生物打印系统；对于含细胞的粘弹性水凝胶，流量难以稳定控制，无法长时间量产。

5、第二种为喷墨/超声喷射法。该方法可生成微小液滴、喷射速度快，但难以适配高粘度水凝胶，工艺稳定性差；载细胞粘弹性水凝胶受粘度限制，无法稳定喷射，易出现喷嘴堵塞。且该方法难以使液滴直接接触固化液，空中成型的液滴接触固化液面瞬间极易发生颗粒变形。

6、第三种为油相乳化法/简单滴液法。该方法仅需简易设备即可实现，但颗粒粒径分布宽、尺寸可控性差；液滴成型后形态不稳定，成型与交联工序未分离，液滴接触交联溶液瞬间会因压力、界面差异造成颗粒变形、颗粒团聚，难以保证粒径均一。

7、现有水凝胶微球制备技术存在如下缺陷：

8、第一，成型与交联同步进行的结构性缺陷。多数技术中，水凝胶溶液接触交联液即刻发生固化，液滴尚未形成稳定球形就出现变形、塌陷。

9、第二，难以保证颗粒粒径均一。简单滴液法、乳化法的液滴成型过程易受外部搅拌、粘度波动影响，粒径分布区间宽。

10、第三，工艺可控性差。现有技术难以精准调控压力、时间、位置等工艺参数，同一条件下重复生产的重现性较差。

11、第四，适用材料范围受限。部分技术仅适配特定光固化材料或特定粘度区间的水凝胶，无法拓展至多种材料体系。

12、第五，工艺复杂、成本偏高。微流控设备加工与维护成本高；乳化法后处理流程繁琐。

13、综上，现有技术在形态稳定性、粒径均一性、生产重现性、工艺简易度、材料通用性方面均存在较大改良空间。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供含细胞水凝胶微球的制备方法及制备装置，采用一种新的微流控技术，即使使用最基础廉价的海藻酸钠（sodiumalginate）-明胶（gelatin）水凝胶，氯化钙交联固化液和传统的气压挤出式制备法，也能高效制备出微米级的标准水凝胶微球。

2、本发明的目的通过如下技术方案实现：

3、含细胞水凝胶微球的制备装置，该制备装置包括分层反应容器、生物3d打印设备以及水凝胶微球收集装置；

4、所述分层反应容器包括上部开口、底部排液口以及设置于排液口处的开关控制结构，作为水凝胶微球的反应发生容器；

5、所述生物3d打印设备包括打印管、打印喷头以及3d打印机，用于进行水凝胶微球的3d打印；

6、所述水凝胶微球收集装置用于收集制备完成的水凝胶微球。

7、含细胞水凝胶微球的制备方法，使用所述的制备装置进行含细胞水凝胶微球的制备，所述制备方法包括以下步骤：

8、步骤s1：构建双层液相反应体系；

9、在分层反应容器中加入氯化钙溶液和无毒生物油，静置分层后形成上层油相和下层水相，定义油相和上部空气之间的交界面第一交界面，油相和下层氯化钙溶液之间的交界面为第二交界面；

10、步骤s2：组装打印管和喷头；

11、将预先制备完成且均匀混合了细胞的水凝胶溶液注入打印管内，选取口径适配的打印喷头，将所述打印喷头与打印管对接相连，再将打印管装配于3d打印机上，控制机床将打印管喷头下沉并浸入油相至预设深度，且所述喷头不接触氯化钙溶液；

12、步骤s3：制备水凝胶微球；

13、采用间断式气压挤出式方法，控制微型气泵以预设出口气压值、释放时间以及释放气压次数，向打印管内通入气流，使喷嘴处挤出预设微量水凝胶；所述水凝胶体积未达到临界值前，保持油相中喷头端口连接；当油相内的水凝胶体积达到预设标准后，控制3d打印机将喷头垂直向上提升穿过所述第一交界面至空气内，所述水凝胶受第一交界面的截面阻力滞留在油相中，只有喷头继续上升进入了空气中，所述水凝胶依靠表面张力油相中形成标准的水凝胶微球；

14、步骤s4：水凝胶微球沉降后交联；

15、所述水凝胶微球在重力作用下自然沉降，穿越所述第二交界面，进入下层氯化钙溶液层，利用水凝胶微球与氯化钙溶液的密度差及交联反应，控制微球在穿越所述第二交界面时的沉降阻力与交联速率，待水凝胶微球完全穿越了第二交界面后，沉降速度回到正常，交联反应继续进行；所述微球沉降至容器底部时已具备充足结构强度，不会发生形变；

16、步骤s5：水凝胶微球的收集；

17、所述水凝胶微球沉降至分层反应容器的底部后，打开分层反应容器的开关控制结构，排出并收集水凝胶微球。

18、优选的，还需对收集的水凝胶微球进行清洗处理，并将清洗干净的水凝胶微球放入细胞培养基中进行培养。

19、优选的，在步骤s1中，所述无毒生物油为100cst二甲基硅油或食用油。

20、优选的，在步骤s2中，所述水凝胶溶液为海藻酸钠-明胶水凝胶；所述打印喷头为27-32g的针头；所述出口气压值为0.2-1.5mpa，释放时间设置为0.1-1s。

21、优选的，在步骤s3中，所述第一交界面的界面阻力用于实施水凝胶与喷头的脱离，在步骤s4中，所述水凝胶微球穿越第二交界面时即时开始交联，且受交联作用沉降速度减慢，待完全穿越后，恢复正常沉降速度；

22、下层水相中还可添加界面润滑剂，以降低第二交界面的界面张力，促进微球下落，同时减小微球的形变。

23、优选的，当所述水凝胶溶液包含光固化材料时，所述装置还配备光照单元，所述光照单元用于对沉降的水凝胶微球进行光照，使其固化。

24、优选的，所述分层反应容器的排液口用于排出交联后的水凝胶微球，并通过开关控制结构控制上层油相不被排出。

25、优选的，所述分层反应容器外部配备温度控制单元，调控容器内部温度。

26、优选的，所述分层反应容器外部还配备振动发生单元，当水凝胶微球沉降时向容器内部施加振动，加速微球穿过界面。

27、通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：

28、本发明的水凝胶微球制备方法及装置，将液滴成型工序与交联工序分离，可最大限度抑制水凝胶微球发生形态变形。可精准调控颗粒尺寸，稳定产出粒径均一的微球颗粒。适配多种类型水凝胶材料，适用范围广。同一工艺流程可重复执行，批量生产重现性优异。搭配喷嘴位置自动控制模块，可实现全自动化连续定量制备大批量水凝胶微球。微球可与上层油相分层排出，无油相残留问题，后处理工序简单。制备载细胞水凝胶微球时，细胞混合水凝胶仅在温和条件下加工；成型后通过离子交联完成稳定化，可减少热、光、机械应力对细胞的损伤；配合精准控温，可维持细胞均匀分散状态。无需高价光固化水凝胶、复杂微流控芯片，仅采用低成本生物相容性原料与常规点胶设备即可实现，设备结构简单、生产成本低、经济性好。

29、本发明制备的载细胞水凝胶微球可应用于组织工程、类器官构建、细胞治疗载体、药物评价三维细胞模型、生物打印基础单元等多个领域，兼具极高科研价值与产业化应用潜力。