一种冻存菌种快速复苏液及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种冻存菌种快速复苏液及其制备方法和应用。

背景技术：

1、近年来，活体微生物疗法作为一种极具潜力的新兴治疗手段，在医学领域引起了广泛关注。这种疗法的核心在于利用特定的细菌微生物，通过口服、静脉注射、腹腔注射等多种方式将它们引入人体内部，使其在体内发挥特定的药效。这些细菌微生物包括减毒沙门氏菌vnp20009、大肠杆菌益生菌ecn、减毒李斯特菌、卡介菌、嗜热链球菌（专利申请号：2024110944111）、屎肠球菌（专利申请号：2024110944516）、鼠李糖乳杆菌（专利申请号：2024110944520）、双歧杆菌（专利申请号：2024110944126）等。例如，在抗肿瘤治疗领域，已有大量临床前研究证实，减毒沙门氏菌等特定细菌可通过多种途径给药，在肿瘤局部高度富集。这是由于肿瘤局部乏氧以及相应的免疫抑制微环境为细菌的生长和定殖提供了有利条件。一旦细菌在肿瘤内富集，它们可以通过激活肿瘤内的免疫反应和/或表达分泌工程化的蛋白药物等多种策略，实现对肿瘤的有效治疗。此外，活体微生物疗法还在代谢性疾病治疗和肠道微生态重塑等方面展现出了广阔的应用前景。例如已可有效使用双歧杆菌菌剂防治脱髓鞘病（专利申请号：2024110948095；2024110948076），使用长双歧杆菌菌剂和嗜热链球菌菌剂预防糖尿病（专利申请号：2024110948108），使用长双歧杆菌菌剂预防和治疗帕金森症（专利申请号：2024110948080），使用长双歧杆菌菌剂、鼠李糖乳杆菌菌剂、屎肠球菌菌剂改善溃疡性结肠炎（专利申请号：2025102712456；2025102712441；2025102712437）。

2、随着合成生物学的不断进步以及细胞/细菌疗法的快速发展，活体微生物疗法的研究和应用正在迅速推进，大量的临床试验也在全球范围内快速开展。然而，在实际的临床应用中，为了节约使用、运输和操作等成本，同时保持药物剂型与剂量的稳定，微生物药物通常需要在中试或大规模生产后进行甘油冻存或冻干粉冻存。随后，这些冻存的微生物药物通过冷链运输，在需要的时间和地点，由医护人员取出复苏后再给药患者。这种冻存和复苏的流程虽然在一定程度上保证了药物的稳定性和可用性，但也带来了一些问题。

3、已有大量证据表明，多数细菌在处于不利环境条件时（如甘油或冻干粉状态下的长期冻存），会进入一种特殊的休眠状态。这种休眠状态是细菌为了抵御不利环境而采取的一种自我保护机制，但同时也伴随着细胞活性的显著降低，以削弱不良环境对菌体的影响。然而，这种低活性状态并不能通过简单地除去环境胁迫因素（如从冻存环境中取出）来快速恢复。当将这些低活性的微生物菌株直接用于临床治疗时，可能会因为菌株活性不足而削弱甚至丧失其最终的治疗效果。这无疑给活体微生物疗法的临床应用带来了巨大的挑战。

4、因此，为了最大化地获得微生物药物的临床药效，确保其在临床应用中的安全性和有效性，需要寻找一种能够快速、高效地恢复冻存菌种活性的方法。这种方法必须能够在短时间内显著提升冻存菌种的生物活性，使其恢复到接近新鲜菌种的水平，从而保证其在临床治疗中的有效性。同时，该方法还需要具备简单易行、成本低廉、安全性高以及与现有临床操作流程兼容等特点，以便能够在实际的临床环境中得到广泛应用。目前，虽然已有研究尝试通过添加一些营养物质来复苏冻存菌种，但这些方法大多存在操作复杂、成本高、复苏效果不理想或安全性不足等问题，难以满足临床快速复苏和使用的需求。

5、因此，目前亟需开发一种简单高效的供临床使用地冻存菌种快速复苏液及其制备方法和应用。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的问题，本发明的目的是提供一种简单高效的冻存菌种快速复苏液及其制备方法和应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：第一方面，本技术提供一种冻存菌种快速复苏液。

3、第二方面，本技术提供一种冻存菌种快速复苏液的制备方法。

4、第三方面，本技术提供一种冻存菌种快速复苏液在制备药物中的应用。

5、第四方面，本技术提供一种冻存菌种快速复苏液与其他常规药物或方法的联合应用。

6、第五方面，本技术提供一种冻存菌种快速复苏液在制备抗肿瘤药物以及其它疾病治疗药物中的应用。

7、第六方面，本技术提供一种冻存菌种快速复苏液与其他常规抗肿瘤或疾病治疗药物或方法的联合应用。

8、本技术第一方面提供一种冻存菌种快速复苏液，冻存菌种快速复苏液由如下组分组成：蛋黄卵磷脂：0.05-0.3 g/ml；葡萄糖：0.01-0.05g/ml；蔗糖：0.01-0.05g/ml，其余为无菌水。

9、进一步地，冻存菌种快速复苏液的液体体积范围为100 μl-10000 μl。

10、本技术第二方面提供一种冻存菌种快速复苏液的制备方法，包括如下步骤：将蛋黄卵磷脂、葡萄糖和蔗糖溶于无菌水，过滤除菌后分装。

11、本技术第三方面提供一种冻存菌种快速复苏液在制备药物中的应用。

12、进一步地，将冻存菌种快速复苏液与冻存菌株混合，在室温条件下静置培养；所述的冻存菌株为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性菌细菌，革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性菌细菌包括减毒沙门氏菌vnp20009、大肠杆菌益生菌ecn、减毒李斯特菌、卡介菌、嗜热链球菌、屎肠球菌、鼠李糖乳杆菌或双歧杆菌中的任意一种。

13、进一步地，室温静置温度为16-37℃，所述静置时长为10-60分钟；所述菌液中的菌浓度不低于10³cfu/ml。

14、更进一步地，复苏后的冻存菌液可连同复苏液直接用于后续治疗应用，包括但不限于混合于葡萄糖注射液后的静脉滴注、瘤内注射或瘤旁注射，口服给药。

15、本技术第四方面提供一种冻存菌种快速复苏液与其他常规药物或方法的联合应用。

16、本技术第五方面提供一种冻存菌种快速复苏液在制备抗肿瘤药物以及其它疾病治疗药物中的应用。

17、本技术第六方面提供一种冻存菌种快速复苏液与其他常规抗肿瘤或疾病治疗药物或方法的联合应用。

18、有益效果：本发明快速复苏液及其应用方法具有显著的创新性和实用性，能够有效解决现有技术中冻存菌种活性恢复缓慢、临床药效不足等问题，为活体微生物疗法的临床应用提供了有力支持，具有重要的临床价值和广阔的应用前景。

19、与现有技术相比，本发明具有如下优点：（1）本发明快速恢复菌株活性：本发明的快速复苏液能够在短时间内显著提升冻存菌种的生物活性，使其恢复到接近新鲜菌种的水平。通过添加蛋黄卵磷脂、葡萄糖和蔗糖等营养物质，能够有效促进冻存菌株的活性恢复，缩短复苏时间，提高复苏效率。

20、（2）提高临床药效：复苏后的菌株在体内外均表现出更高的生物活性，能够更有效地发挥其治疗作用。例如，在抗肿瘤治疗中，复苏后的菌株能够在肿瘤内更快速地富集和定殖，通过激活免疫反应或表达药物蛋白等方式实现对肿瘤的有效抑制，从而显著提升治疗效果。

21、操作简便：本发明的复苏方法简单易行，仅需将冻存菌株与快速复苏液混合后在室温下静置一段时间即可，无需复杂的操作步骤或特殊设备，便于施用人员快速实施，适合在临床、实验室等应用环境中广泛应用。

22、成本低廉：快速复苏液的制备成本低，所用的营养物质均为常见且价格实惠的成分，且生产过程简单，易于大规模生产。这使得最终的复苏液成本可控，有利于降低临床治疗、实验室应用等的整体费用。

23、安全性高：所选用的营养物质（如蛋黄卵磷脂、葡萄糖和蔗糖）均具有良好的生物相容性，可直接用于动物或人体注射，进入体内后可被快速代谢和吸收，不会对动物或人体产生不良影响，确保了使用的安全性。

24、适用范围广：本发明适用于多种可用于临床治疗、动物试验等的革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性菌细菌，包括减毒沙门氏菌vnp20009、大肠杆菌益生菌ecn、减毒李斯特菌、卡介菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、屎肠球菌、鼠李糖乳杆菌等，以及基于这些菌株的基因改造菌株和可表达产生药物蛋白的合成生物学改造工程菌株，具有广泛的应用前景。

25、扩展治疗窗口：通过快速恢复菌株的生物活性，本发明能够缩短治疗时间，扩展治疗窗口，提高治疗的灵活性和适应性，提供更及时有效的治疗方案。

26、联合应用潜力：本发明的快速复苏液不仅可以单独用于制备抗肿瘤及其他疾病，如脱髓鞘病、帕金森症、糖尿病、溃疡性结肠炎等，治疗药物，还可以与其他常规抗肿瘤及其他疾病（如脱髓鞘病、帕金森症、糖尿病、溃疡性结肠炎等）治疗药物或治疗方法联合应用，发挥协同作用，进一步提升治疗效果。