一种非芽孢固氮菌液体保护剂与应用

本发明涉及液体微生物制剂，具体涉及一种适用于喷雾、滴灌和灌根施用的非芽孢固氮菌液体菌剂及其保护剂，以及该菌剂的制备方法和在促进作物生长中的应用。

背景技术：

1、化学氮肥的长期大量施用虽保障了作物产量，但已造成土壤酸化、板结、水体富营养化及温室气体排放增加等严重生态问题。利用植物根际促生菌（pgpr），尤其是生物固氮菌，替代部分化学氮肥，是实现农业绿色可持续发展的重要途径。固氮菌通过固氮酶将大气中的分子态氮转化为植物可吸收的氨态氮，对于减少化肥依赖、降低环境污染具有重要价值。

2、然而，直接向土壤中施用固氮菌存在诸多挑战。非芽孢类固氮菌不产生抗逆芽孢，其细胞对水分、温度、紫外线及营养匮乏等环境胁迫极为敏感，导致货架期短、田间定殖率低，难以持续发挥促生效果。目前市场上登记的微生物肥料中，芽孢杆菌类产品占主导地位，同质化严重，而高效非芽孢固氮菌剂仍是行业空白。

3、为延长非芽孢固氮菌的保存期并提高其田间存活率，常在菌剂中添加保护剂。海藻酸钠作为一种天然多糖，可与钙离子交联形成三维凝胶网络，将菌体包埋其中，起到物理隔离和缓释作用。吐温系列非离子表面活性剂常用作乳化剂和分散剂，可改善包埋体系的均匀性。现有技术中，如cn106085864a公开了一种水产饲用微胶囊化复合微生态制剂，采用海藻酸钠作为壁材，吐温-80作为乳化剂，氯化钙作为交联剂，制备油包水型微胶囊。然而，该技术涉及复杂的油相乳化工艺和冷冻干燥步骤，成本高、操作繁琐；同时，该技术针对的是芽孢杆菌、乳酸菌等，并未涉及非芽孢固氮菌的特殊保护需求；此外，所得产品为固体微胶囊，不适用于农业系统大规模应用场景。

4、目前尚缺乏一种工艺简单、成本低廉、适用于非芽孢固氮菌、可直接喷雾、滴灌和灌根施用的液体保护剂，能够显著提高菌体在常温储存和灌根施用后的存活率。本发明正是基于此，通过大量筛选和优化，提供了一种以海藻酸钠-氯化钙-吐温-20为核心的保护剂，专门针对产酸克雷伯氏菌和褐球固氮菌，实现液体菌剂的高活性、长货架期及良好的灌根促生效果。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中非芽孢固氮菌液体菌剂活菌数低、货架期短、田间定殖困难的缺陷，提供一种适用于灌根施用的非芽孢固氮菌液体菌剂及其保护剂。该保护剂通过海藻酸钠与氯化钙的交联作用形成轻度凝胶网络，结合“吐温-20”的分散稳定功能，有效包埋和保护菌体，同时保持液体流动性，便于喷雾、滴灌和灌根施用。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种适用于非芽孢固氮菌液体菌剂的保护剂，所述保护剂由以下组分组成；

4、海藻酸钠：0.6%~1.0%（w/v），优选0.8%（w/v）；

5、氯化钙：0.05~0.10 mol/l，优选0.07 mol/l；

6、吐温-20：0.05%~0.3%（v/v），优选0.1%（v/v）；

7、余量为无菌水或生理盐水。

8、所述保护剂的制备方法为：将海藻酸钠溶于无菌水或生理盐水中，加热搅拌至完全溶解，冷却至室温后加入氯化钙和吐温-20，搅拌均匀，即得。

9、第二方面，本发明提供了一种非芽孢固氮菌液体菌剂，所述菌剂包括：

10、产酸克雷伯氏菌（

klebsiella oxytoca）、褐球固氮菌（

azotobacter

chroococcum）；

11、上述保护剂；

12、所述保护剂与菌体沉淀的体积比为1:1。

13、第三方面，本发明提供了所述液体菌剂的制备方法，包括以下步骤：

14、（1）菌株活化：从-80℃冰箱取出2ml产酸克雷伯氏菌、褐球固氮菌菌种冻存管，按照1%接种量接种于装液量10ml的液体lb培养基（蛋白胨10 g/l，酵母提取物5 g/l，氯化钠10 g/l，ph 7.0~7.2），于恒温摇床180rpm/min，28-30℃培养至对数生长期约10-12h。

15、（2）扩大培养：按1%（v/v）接种量将活化菌液转接至lb发酵培养基（蛋白胨10 g/l，酵母提取物5 g/l，氯化钠10 g/l，ph 7.0~7.2）中，30℃、180 rpm摇床培养14~18 h，直至有效活菌浓度大于109 cfu/ml。

16、（3）离心收集菌体：将步骤2获得的扩培菌液在4℃、5000xg的条件下离心5min，弃上清，收集泥状菌体沉淀。

17、（4）菌剂制备：将上述菌体沉淀与等体积的保护剂（0.8%海藻酸钠+0.07 mol/l氯化钙+0.1%吐温-20）均匀混合，重悬菌体，得到液体菌剂。

18、第四方面，本发明提供了所述液体菌剂在促进作物生长中的应用，具体为灌根施用方法：

19、将所述液体菌剂按照每株作物5~10 ml的用量，在作物苗期或移栽后，沿根部周围土壤浇灌，施用时将菌剂稀释或不稀释，保证菌剂与根际土壤充分接触。施后可覆盖薄土或正常浇水。

20、本发明中液体微生物菌剂的保护剂，优选通过以下技术方案制备得到：

21、（1）产酸克雷伯氏菌、褐球固氮菌液体菌剂最佳保护剂的筛选；

22、（2）产酸克雷伯氏菌、褐球固氮菌液体菌剂最佳保护剂浓度的筛选；

23、（3）产酸克雷伯氏菌、褐球固氮菌液体菌剂保护剂添加后的货架期实验；

24、（4）产酸克雷伯氏菌、褐球固氮菌液体菌剂保护剂添加后的保护剂作用机制。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明专门针对非芽孢固氮菌设计保护剂，有效解决了这类菌株不耐储存、易失活的瓶颈，海藻酸钠、氯化钙与吐温-20三者联用提高了菌株的存活率，显著高于任意单一组分或两两组合；本发明工艺简单、成本低廉，适合大规模工业化生产；本菌剂施用方便，菌剂为液体状，流动性好，可直接用于喷雾、滴灌和灌根，无需额外设备，且促生效果好。

1. 一种适用于非芽孢固氮菌菌剂的保护剂，其特征在于，所述保护剂由以下组分组成：海藻酸钠、氯化钙和吐温-20，其中所述海藻酸钠的浓度为0.6%~1.0%（w/v），所述氯化钙的浓度为0.05~0.10 mol/l，所述吐温-20的浓度为0.05%~0.3%（v/v）。

2.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，所述海藻酸钠的浓度为0.8%（w/v），所述氯化钙的浓度为0.07 mol/l，所述吐温-20的浓度为0.1%（v/v）。

3.一种非芽孢固氮菌液体菌剂，其特征在于，所述菌剂包括产酸克雷伯氏菌（klebsiella oxytoca）和/或褐球固氮菌（azotobacter chroococcum）的菌体，以及权利要求1或2所述的保护剂，所述保护剂与菌体沉淀的体积比为1:1。

4.根据权利要求3所述的液体菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体状，适用于喷雾、滴灌和灌根施用。

5.权利要求3或4所述的非芽孢固氮菌液体菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述扩大培养的培养基为lb培养基或发酵培养基，培养温度为28~30℃，摇床转速为180 rpm/min，培养时间为14~18 h。

7.权利要求3或4所述的非芽孢固氮菌液体菌剂在促进作物生长中的应用，其特征在于，所述应用为喷雾、滴灌和灌根施用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述喷雾、滴灌或灌根施用的用量为每株作物5~10 ml，施用时期为苗期或移栽后。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述作物为玉米、小麦、水稻或蔬菜。