一种除虫菊TcGRF4基因、其编码蛋白及应用的制作方法

本发明属于植物基因工程，具体涉及一种除虫菊tcgrf4基因、其编码蛋白及应用。

背景技术：

1、除虫菊（tanacetum cinerariifolium）为菊科菊蒿属多年生植物，其花序能够合成天然除虫菊酯，在卫生害虫防治和农业害虫防治等领域具有应用价值。利用遗传转化、基因编辑等技术开展除虫菊基因功能研究和种质改良，是提高除虫菊育种效率及开展除虫菊酯合成调控研究的重要手段。

2、目前，植物遗传转化通常采用农杆菌介导法，将含有目的基因的重组载体导入植物外植体，并依次经过预培养、农杆菌侵染、共培养、抗性筛选、不定芽诱导、生根和移栽等步骤，获得遗传转化植株。该方法能否获得阳性植株，不仅与农杆菌侵染和筛选条件有关，还受到外植体愈伤组织形成能力和不定芽再生能力的影响。

3、除虫菊属于再生能力相对较弱的植物。在现有遗传转化过程中，叶片外植体存在愈伤组织诱导率较低、不定芽分化能力不足以及部分抗性愈伤组织难以继续再生等问题，导致阳性再生芽和遗传转化植株的获得效率较低。通过调整培养基中植物生长调节剂的种类和含量、农杆菌侵染时间、共培养时间及筛选剂浓度等条件，虽然能够对遗传转化效果进行一定改善，但仍难以有效解决外植体再生能力不足的问题。

4、生长调控因子grf（growth-regulating factor）是一类植物特异性转录因子，参与植物细胞增殖、器官生长和组织再生等生物学过程。现有技术已将grf基因、grf与gif形成的嵌合基因或其他促再生基因用于植物遗传转化，以促进愈伤组织增殖和不定芽形成。然而，不同来源和不同类型的促再生基因在不同植物中的作用效果存在差异，异源促再生基因与受体植物内源调控体系之间的适配性也可能影响其促再生效果，因而现有促再生基因及其应用方案对除虫菊遗传转化效率的提高仍然有限。

5、因此，需要提供一种适用于除虫菊遗传转化体系的内源促再生基因及其应用，以促进除虫菊外植体愈伤组织形成和不定芽分化，提高阳性再生材料及遗传转化植株的获得效率，为除虫菊基因功能研究和遗传改良提供技术基础。

技术实现思路

1、针对现有除虫菊遗传转化过程中外植体愈伤组织诱导率较低、不定芽分化能力不足以及阳性再生材料获得效率较低的问题，本发明提供一种除虫菊tcgrf4基因、其编码蛋白及应用。所述tcgrf4基因能够促进除虫菊外植体形成愈伤组织和不定芽，提高阳性再生芽的获得效率，可用于除虫菊再生和遗传转化。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

3、第一方面，本发明提供了一种除虫菊tcgrf4基因，所述tcgrf4基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。

4、第二方面，本发明提供了一种由所述除虫菊tcgrf4基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no:2所示。

5、第三方面，本发明提供了一种植物重组表达载体，所述植物重组表达载体含有所述除虫菊tcgrf4基因。

6、在一些实施方案中，所述植物重组表达载体还包括绿色荧光蛋白报告元件和潮霉素抗性筛选元件。

7、在本发明中，所述绿色荧光蛋白报告元件用于通过荧光信号观察和鉴定导入所述植物重组表达载体的植物组织或再生芽，所述潮霉素抗性筛选元件用于对导入所述植物重组表达载体的植物细胞或组织进行抗性筛选。

8、第四方面，本发明提供了一种农杆菌工程菌，所述农杆菌工程菌含有所述植物重组表达载体。

9、在一些实施方案中，所述农杆菌工程菌的宿主菌为根癌农杆菌gv3101。

10、第五方面，本发明提供了所述tcgrf4基因、所述tcgrf4蛋白、所述植物重组表达载体或所述农杆菌工程菌在促进除虫菊再生和遗传转化中的应用。

11、在一些实施方案中，所述促进除虫菊再生和遗传转化包括促进除虫菊外植体的愈伤组织诱导、不定芽分化和阳性再生芽获得中的至少一种。

12、第六方面，本发明提供了一种促进除虫菊再生和遗传转化的方法，包括如下步骤：

13、（1）将除虫菊外植体进行预培养；

14、（2）采用所述农杆菌工程菌侵染预培养后的除虫菊外植体；

15、（3）将侵染后的除虫菊外植体依次进行共培养、筛选培养和再生培养，获得阳性再生芽。

16、在一些实施方式中，步骤（2）中，将预培养后的除虫菊外植体浸入所述农杆菌工程菌菌液中，在0.07～0.09mpa的负压条件下处理5min，解除真空后继续浸泡侵染10min。

17、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

18、（1）本发明提供了seq id no:1所示除虫菊内源tcgrf4基因及其编码蛋白，为除虫菊组织再生和遗传转化提供了新的促再生基因材料。

19、（2）同条件比较结果表明，tcgrf4组的愈伤诱导率为76.67%，不定芽分化率为68.95%，均高于ck、atbbm、tcgrf4-gif1和atgrf5处理组，说明tcgrf4能够有效促进除虫菊外植体的愈伤组织形成和不定芽分化。

20、（3）tcgrf4组获得30个gfp阳性芽，按gfp阳性芽数占总侵染外植体数的比例计算，其gfp阳性芽获得率为12.50%，高于atgrf5组、tcgrf4-gif1组、atbbm组、和ck组，表明tcgrf4适用于提高除虫菊阳性再生材料的获得效率。

1.一种除虫菊tcgrf4基因，其特征在于，所述tcgrf4基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。

2.一种由权利要求1所述除虫菊tcgrf4基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no:2所示。

3.一种植物重组表达载体，其特征在于，所述植物重组表达载体含有权利要求1所述除虫菊tcgrf4基因。

4.根据权利要求3所述的植物重组表达载体，其特征在于，所述植物重组表达载体还包括绿色荧光蛋白报告元件和潮霉素抗性筛选元件。

5.一种农杆菌工程菌，其特征在于，所述农杆菌工程菌含有权利要求3或4所述植物重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的农杆菌工程菌，其特征在于，所述农杆菌工程菌的宿主菌为根癌农杆菌gv3101。

7.权利要求1所述除虫菊tcgrf4基因、权利要求2所述蛋白质、权利要求3所述植物重组表达载体或者权利要求5所述农杆菌工程菌在促进除虫菊再生和遗传转化中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进除虫菊再生和遗传转化包括促进除虫菊外植体的愈伤组织诱导、不定芽分化和阳性再生芽获得中的至少一种。

9.一种促进除虫菊再生和遗传转化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，将预培养后的除虫菊外植体浸入所述农杆菌工程菌菌液中，在0.07～0.09mpa的负压条件下处理5min，解除真空后继续浸泡侵染10min。