一种温敏响应型分子印迹固载酶及其制备方法和应用

本技术涉及环境功能材料与生物催化，具体涉及一种温敏响应型分子印迹固载酶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、现有技术中，co2基超支化聚炔酯作为一种以co2为原料制备的超支化聚合物，具有丰富的官能团位点、分子内空腔及可正交修饰的侧链炔酯基和末端炔基，已被公开报道可作为功能载体材料（参见song b等人，adv. sci. 2020, 7(17), 2000465）。该材料通过多官能度炔单体、co2和二卤代物单体的超支化聚合反应制备，其侧链炔酯基与末端炔基可实现正交功能化修饰。然而，该已知载体材料尚未被应用于酶的固定化，更未与分子印迹技术和温敏响应技术结合以实现污染物的选择性识别与智能降解。 在环境污染治理与生物催化领域，酶催化技术因其高效性和特异性而备受关注。然而，游离酶稳定性差、难以回收重复使用，限制了其实际应用。现有的酶固定化技术多采用硬质多孔材料或传统高分子载体，虽然提高了酶的稳定性，但往往存在传质阻力大、异相催化结合率低的问题。此外，现有技术中的分子印迹聚合物（如对比文件1（申请号202110075870.5）公开的含二硫键超支化聚合物印迹材料）主要侧重于吸附分离或药物缓释，缺乏对酶活性中心的有效保护及催化微环境的精准调控；而部分温敏型固相萃取材料（如对比文件2（申请号202511640644.1）公开的聚n-异丙基丙烯酰胺（pnipam）改性磁性微球）虽实现了温控释放，但其温敏机制主要用于洗脱而非酶催化状态的智能切换，且载体结构缺乏针对特定底物的选择性富集能力与亲水生物相容性的正交构建。因此，亟需开发一种兼具底物选择性识别、高传质效率及智能相分离回收性能的固载酶体系。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的固载酶传质效率低、缺乏底物选择性识别且难以实现高效智能回收的问题，本技术通过温敏响应型分子印迹固载酶及其制备方法和应用，实现底物选择性富集、均相高效催化与异相便捷回收的协同。

2、为实现上述目的，本技术采用如下技术方案：

3、一种温敏响应型分子印迹固载酶，包括：超支化聚合物载体，具有侧链和末端，所述侧链上具有侧链反应基团，所述末端上具有末端反应基团；分子印迹空穴，位于所述超支化聚合物载体的侧链，所述分子印迹空穴为含有目标底物特征子结构的模板分子与所述侧链反应基团结合并被洗脱后形成的空腔；亲水链段，连接于所述超支化聚合物载体的所述末端反应基团；温敏酶前体，包含酶分子以及与所述酶分子结合的温敏性聚合物片段，所述温敏酶前体连接于所述超支化聚合物载体；其中，所述超支化聚合物载体与所述温敏酶前体自组装形成聚集体，所述聚集体具有温敏相变特性。

4、上述方案通过超支化聚合物载体的三维立体结构提供丰富的官能团位点和分子内空腔，有利于降低传质阻力；利用侧链上的分子印迹空穴实现对目标底物的特异性识别与富集，提高局部底物浓度；通过末端连接的亲水链段构建生物相容性微环境，维持酶活性；借助温敏酶前体与载体的自组装形成具有温敏相变特性的聚集体，从而在不同温度下实现均相催化与异相分离的状态切换，解决了传统固载酶催化效率与回收性能难以兼顾的难题。

5、优选的，所述侧链反应基团和所述末端反应基团为正交反应基团对；所述亲水链段包括聚乙二醇或其衍生物。

6、此优选方案通过正交反应基团对的设计，使得侧链的分子印迹构建与末端的亲水化修饰互不干扰，保证了功能化修饰的精准度和产率；聚乙二醇或其衍生物的引入进一步提升了载体的水溶性和抗蛋白非特异性吸附能力，优化了酶促反应的微环境。

7、优选的，所述侧链反应基团为炔酯基，所述末端反应基团为炔基或炔酯基；所述模板分子为端氨基模板分子，所述目标底物特征子结构包括磷酸酯基团和/或苯环结构；所述侧链反应基团与所述端氨基模板分子通过炔-胺点击反应结合。

8、此优选方案利用炔-胺点击反应的高效性和专一性，在温和条件下将含有目标底物特征子结构的模板分子定向引入侧链，形成结构匹配度高的印迹空穴，显著增强了对特定底物（如有机磷阻燃剂）的选择性识别能力；同时明确了末端基团的转化形式，为后续温敏酶前体的连接提供了稳定的化学接口。

9、优选的，所述温敏性聚合物片段由亲水性温敏单体与疏水性共聚单体共聚形成；所述酶分子与所述温敏性聚合物片段通过动态共价键结合。

10、此优选方案通过亲水与疏水单体的共聚调节温敏片段的相变温度和亲疏水平衡，使其适应特定的催化与分离温度窗口；动态共价键的结合方式既保证了酶分子在催化过程中的稳定性，又赋予了其在特定条件下的可逆性或柔性，有利于维持酶的天然构象和活性。

11、优选的，所述亲水性温敏单体包括n-丙烯酰甘氨酰胺，所述疏水性共聚单体包括十一烯醛；所述动态共价键为亚胺键；所述酶分子包括角质酶、水解酶或双加氧酶中的至少一种。

12、此优选方案具体化了温敏单体的组成，n-丙烯酰甘氨酰胺与十一烯醛的共聚物具有优异的生物相容性和敏锐的温度响应性；亚胺键作为动态共价键，在生理ph范围内稳定，便于酶的固定化操作；所选用的酶种类针对有机磷类污染物的降解具有高度特异性，确保了实际应用效果。

13、优选的，所述聚集体为胶束态或凝胶态；所述温敏相变特性包括：在第一温度区间内所述聚集体处于溶胀或解组装状态以呈现均相催化活性，在第二温度区间内所述聚集体处于收缩或组装状态以呈现异相沉淀；所述第一温度区间的温度值高于所述第二温度区间的温度值。

14、此优选方案明确了聚集体的微观形态及其随温度变化的宏观行为，实现了“高温均相催化、低温异相沉淀”的智能响应模式：在高温催化阶段，聚集体溶胀或解组装，暴露出更多活性位点并降低传质阻力，模拟均相催化的高效率；在低温回收阶段，聚集体收缩或组装沉淀，便于通过简单的物理分离手段回收再利用，大幅降低了应用成本。

15、优选的，所述超支化聚合物载体由多官能度炔单体、二氧化碳和二卤代物单体通过超支化聚合反应制备；所述超支化聚合物载体的主链和/或支链中包含碳酸酯键和/或炔酯键。

16、此优选方案中，超支化聚合物载体采用已知的co2基超支化聚炔酯（参见背景技术中引用的文献），其主链中的碳酸酯键赋予材料良好的生物降解性和柔韧性，为后续功能化修饰提供适宜的载体基质。

17、此外，本技术还提供了一种如上述方案所述的温敏响应型分子印迹固载酶的制备方法，包括：提供具有侧链和末端的超支化聚合物载体，所述侧链上具有侧链反应基团，所述末端上具有末端反应基团；使含有目标底物特征子结构的模板分子与所述侧链反应基团发生反应，随后洗脱所述模板分子，在所述超支化聚合物载体的侧链形成分子印迹空穴；将亲水链段连接至所述超支化聚合物载体的所述末端反应基团；将酶分子与温敏性聚合物片段结合，制备温敏酶前体；将所述温敏酶前体连接至所述超支化聚合物载体，诱导自组装形成聚集体。

18、上述制备方法通过分步正交修饰策略，依次构建分子印迹空穴、亲水微环境和温敏酶前体，避免了各功能化步骤之间的相互干扰，确保了产物结构的精确可控；最后的自组装步骤在水相中温和进行，最大程度地保护了酶的活性，适合规模化制备。

19、优选的，所述使含有目标底物特征子结构的模板分子与所述侧链反应基团发生反应的过程中，使用缚酸剂和惰性气体保护；所述洗脱所述模板分子采用稀酸溶液处理；所述将酶分子与温敏性聚合物片段结合的条件为ph 5~7、温度25~30℃。

20、此优选方案通过严格控制反应条件，如使用缚酸剂中和副产物、惰性气体防止氧化、稀酸温和洗脱模板以及适宜的ph和温度进行酶结合，有效提高了点击反应的转化率和印迹空穴的完整性，同时避免了强酸强碱或高温对酶活性和聚合物骨架的破坏，保证了最终产品的性能。

21、此外，本技术还提供了一种如上述方案所述的温敏响应型分子印迹固载酶在降解有机磷阻燃剂中的应用。

22、上述应用充分利用了该固载酶对有机磷阻燃剂的特异性识别能力和温敏相分离特性，在污染治理过程中能够实现污染物的高效定向降解和催化剂的便捷回收循环使用，具有显著的环境效益和经济效益。

23、本发明有益效果：本技术提供的温敏响应型分子印迹固载酶，通过超支化聚合物载体的正交功能化设计，在同一载体上集成了底物选择性识别、亲水生物相容性微环境和温敏智能响应三大功能模块。分子印迹空穴通过侧链点击反应精准构建，实现了对目标底物的特异性富集，显著提高了局部底物浓度和催化效率；末端亲水链段的修饰改善了载体的水溶性和生物相容性，减少了非特异性吸附，有利于维持酶的高活性；温敏酶前体通过动态共价键间接固载并自组装形成聚集体，赋予了体系独特的温敏相变特性，使其能够在较高温度下呈现溶胀或解组装的均相催化状态，克服传统固载酶传质限制，而在较低温度下呈现收缩或组装的异相沉淀状态，实现简便高效的分离回收。该技术方案巧妙融合了分子印迹技术、点击化学、温敏高分子与酶工程，有效解决了现有固载酶在选择性、催化效率与回收性能之间难以平衡的技术瓶颈，同时，本技术将已知的co2基超支化聚合物载体与分子印迹技术、温敏响应技术相组合，拓展了该载体材料在环境催化领域的应用。