一种用于外源基因定点整合的SPMIP3基因座及其在重组蛋白生产中的应用

本发明涉及生物，具体地涉及一种用于外源基因定点整合的spmip3基因座及其在重组蛋白生产中的应用。

背景技术：

1、随着生物医药行业的迅速发展，重组治疗性蛋白在肿瘤治疗、自身免疫性疾病干预及疫苗研发等领域中的应用日益广泛，市场对高品质蛋白药物的需求持续增长。与此同时，监管部门对生物制品的安全性、有效性以及生产一致性提出了更高要求。治疗性蛋白不仅需要保持良好的生物学功能，还应具备稳定可控的生产性能。因此，建立高效且稳定的蛋白表达体系，已成为当前生物制药领域的重要研究方向之一。目前，哺乳动物细胞因其具备完整的翻译后修饰机制，可高效完成蛋白折叠、二硫键形成及糖基化修饰等关键过程而成为重组蛋白生产的主要宿主之一。在哺乳动物表达系统中，cho 细胞因培养工艺成熟、产业化应用广泛，长期占据工业生产的主导地位，但cho是非人源细胞，其部分蛋白修饰模式与人体天然蛋白仍存在一定差异，可能影响重组蛋白的体内药效与安全性。hek293 细胞源自人胚肾组织，能够提供更贴近人体生理状态的蛋白加工环境，因此在病毒包装、复杂糖蛋白及膜蛋白表达等特殊领域展现出独特且不可替代的优势。其中，hek293f细胞可适配无血清悬浮培养体系，且具有生长速率快、转染效率高、易于规模化放大等特点，近年来已逐步发展成为人源重组蛋白表达的重要宿主细胞。

2、目前，hek293f细胞中外源基因的稳定表达仍以随机整合方式为主。该方法操作简便、成本较低，但存在明显局限性：整合位点的随机性导致不同细胞克隆间的外源蛋白表达水平差异显著；同时，外源基因的表达易受宿主染色质状态及邻近调控元件的影响，常出现表达波动，甚至在长期传代培养后发生表达沉默现象。此外，随机整合还可能破坏宿主内源基因结构，进而影响细胞生长特性与生产稳定性。因此，要获得符合工业化要求的稳定高表达细胞株，通常需经过长时间药物筛选及大量单克隆筛查，严重制约细胞株的快速开发与工业化转化应用。

3、因此，本领域迫切需要开发一种适用于hek293f细胞兼具高表达能力、良好遗传稳定性及细胞生长兼容性的整合位点，对于提升重组蛋白表达水平、构建高稳定性工程细胞株具有重要的理论价值与应用意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种适用于hek293f细胞兼具高表达能力、良好遗传稳定性及细胞生长兼容性的整合位点，对于提升重组蛋白表达水平、构建高稳定性工程细胞株具有重要的理论价值与应用意义。

2、本发明第一方面提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含位于人1号染色体的spmip3基因座的至少一部分序列，所述序列能够作为外源基因定点整合的靶标区域。

3、在另一优选例中，所述核酸分子包含spmip3基因的内含子1、内含子2和/或内含子4区域的全部或部分核苷酸序列。

4、在另一优选例中，所述基因座包含spmip3基因的内含子1、内含子2和/或内含子4区域。

5、在另一优选例中，所述内含子1区域包含位于人1号染色体第244,364,757位点至第244,375,371位点之间的整合位点。

6、在另一优选例中，所述内含子1区域包含位于人1号染色体第244,368,461位点至第244,371,733位点附近的整合位点。

7、在另一优选例中，所述内含子2区域包含位于人1号染色体第244,375,468位点至第244,378,466位点之间的整合位点。

8、在另一优选例中，所述内含子4区域包含位于人1号染色体第244,378,640位点至第244,388,950位点之间的整合位点。

9、在另一优选例中，所述内含子4区域包含位于人1号染色体第244,382,147位点至第244,386,070位点之间的整合位点。

10、在另一优选例中，所述内含子1区域包含选自下组的一个或多个整合位点：

11、（a）对应于seq id no: 1所示sgrna靶向的整合位点；

12、（b）对应于seq id no: 2所示sgrna靶向的整合位点。

13、在另一优选例中，所述内含子2区域包含对应于seq id no: 3所示sgrna靶向的整合位点。

14、在另一优选例中，所述内含子4区域包含选自下组的一个或多个整合位点：

15、（a）对应于seq id no: 4所示sgrna靶向的整合位点；

16、（b）对应于seq id no: 5所示sgrna靶向的整合位点。

17、在另一优选例中，所述外源基因编码目标蛋白，所述目标蛋白包括多肽、抗体、抗原、融合蛋白、酶、激素、细胞因子或其他功能性蛋白质；

18、在另一优选例中，所述外源基因编码的蛋白为病毒样颗粒或重组病毒颗粒的组成蛋白。

19、在另一优选例中，所述组成蛋白在细胞内表达后能够进一步组装形成病毒样颗粒或重组病毒颗粒。

20、在另一优选例中，所述核酸分子包含选自seq id no: 1-5中任一项所示的sgrna靶向的核苷酸序列；较佳地为选自seq id no: 1-2、4-5中任一项所示的sgrna靶向的核苷酸序列

21、在本发明第二方面，提供了一种重组载体或载体组合，所述载体或载体组合包含：

22、（a）用于靶向本发明第一方面所述的核酸分子的核酸引导序列；和/或

23、（b）含有外源基因的表达盒，所述表达盒两侧设有与所述核酸分子同源的臂序列。

24、在另一优选例中，所述载体或载体组合还包含编码定点核酸酶的序列。

25、在另一优选例中，所述定点核酸酶为crispr相关核酸酶、锌指核酸酶或转录激活样效应因子核酸酶。

26、在另一优选例中，所述crispr相关核酸酶包括cas9核酸酶或其变体。

27、在另一优选例中，所述核酸引导序列为向导rna（grna）或单向导rna（sgrna）。

28、在另一优选例中，所述核酸引导序列为如seq id no:1-5任一所示。

29、在本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第一方面所述的分离的核酸分子，且所述spmip3基因座的至少一部分区域内整合有外源基因。

30、在另一优选例中，所述区域包含所述spmip3基因座的内含子1、内含子2和/或内含子4区域。

31、在另一优选例中，所述外源基因定点整合于所述spmip3基因座的内含子1、内含子2和/或内含子4区域。

32、在另一优选例中，所述内含子1区域包含选自下组的一个或多个整合位点：

33、（a）对应于seq id no: 1所示sgrna靶向的整合位点；

34、（b）对应于seq id no: 2所示sgrna靶向的整合位点。

35、在另一优选例中，所述内含子2区域包含对应于seq id no: 3所示sgrna靶向的整合位点。

36、在另一优选例中，所述内含子4区域包含选自下组的一个或多个整合位点：

37、（a）对应于seq id no: 4所示sgrna靶向的整合位点；

38、（b）对应于seq id no: 5所示sgrna靶向的整合位点。

39、在另一优选例中，所述宿主细胞为人胚肾细胞。

40、在另一优选例中，所述宿主细胞包括hek293细胞或其衍生细胞。

41、在另一优选例中，所述宿主细胞为hek293f细胞。

42、在本发明第四方面，提供了一种生产目标蛋白的方法，所述方法包括：

43、（a）提供本发明第三方面所述的宿主细胞；

44、（b）在适于所述目标蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞；以及

45、（c）从培养体系中分离或回收所述目标蛋白。

46、在另一优选例中，所述目标蛋白为igg抗体。

47、在另一优选例中，所述培养为fed-batch培养。

48、在本发明第五方面，提供了一种构建重组细胞株的方法，所述方法包括：

49、将外源基因通过定点整合方式插入所述spmip3基因座的内含子1、内含子2和/或内含子4区域中，获得整合有所述外源基因的宿主细胞。

50、在另一优选例中，所述方法还包括对所述宿主细胞进行单克隆化筛选的步骤。

51、在另一优选例中，所述定点整合通过选自下组的系统来实现的：crispr/cas系统、talen系统、zfn系统和/或重组酶介导的整合系统。

52、在另一优选例中，所述crispr/cas系统为crispr/cas9系统。

53、在本发明第六方面，提供了如本发明第一方面所述的核酸分子、或如本发明第三方面所述的宿主细胞在制备重组蛋白或构建重组细胞株中的应用。

54、在另一优选例中，所述重组蛋白选自下组：抗体、融合蛋白、细胞因子、酶、或病毒样颗粒（vlp）的组成蛋白。

55、在另一优选例中，所述重组细胞株为用于生产目标蛋白的hek293细胞或hek293f细胞。

56、在本发明第七方面，提供了如本发明第一方面所述的核酸分子、或如本发明第三方面所述的宿主细胞在生产目标蛋白或药物中的应用。

57、在另一优选例中，所述目标蛋白为igg抗体、病毒样颗粒、或重组病毒颗粒的组成蛋白。

58、在另一优选例中，所述药物为包含所述目标蛋白的药物组合物，所述药物用于治疗肿瘤或自身免疫性疾病，或用作疫苗。

59、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。