基于长读长三代测序技术的HIV近全长基因组测序用引物组、测序方法和应用与流程

本发明属于病毒检测，具体涉及基于长读长三代测序技术的hiv近全长基因组测序用引物组、测序方法和应用。

背景技术：

1、艾滋病即获得性免疫缺陷综合症（acquiredimmune deficiency syndrome，aids），是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，hiv）感染引起的一种致命性疾病。可严重破坏人体的免疫系统，使人体丧失抵御各种疾病的能力，最终感染其他疾病导致死亡。

2、hiv也称艾滋病病毒，属于逆转录病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组，分为1型和2型，其中hiv-1有m、n、o和p四个分组，并且m组内又细分为a、b、c、d、f、g、h、j和k等多种亚型，且各亚型间又极易发生重组，形成种类繁多的不同流行重组型（crf）和独特重组型（urf）。hiv基因组由两条单链rna组成，每个rna基因组约为9.7kb，在rna 5'端有一帽结构（m7g5'ppp5'gmpnp），3'端有poly（a）尾巴。hiv的主要基因结构和组合形式与其他反转录病毒相同，均由5'末端长重复（long terminal repeat，ltr）、结构蛋白编码区（gag）、蛋白酶编码区（pro）、具有多种酶活性的蛋白编码区（pol）、外膜蛋白（env）和3'末端的长重复ltr区组成。

3、hiv-1超感染是指一个机体同时感染两种或两种以上的hiv-1毒株，超感染导致的病毒重组是产生如此众多重组亚型的主要因素，可能造成治疗失败，加快疾病进展。

4、与此同时，hiv耐药性问题是艾滋病抗病毒治疗面临的重要挑战，对于接受抗病毒治疗的感染者和病人来说，医生强调的最重要的事就是服药依从性，因为病毒的变异就是在血液中药物浓度不能有效抑制病毒复制的情况下逐渐产生并积累起来的，当这种积累超过一定的程度，变异病毒就突破了药物防线成为新的优势毒株，让原来的抗病毒治疗方案失效。因此，hiv的耐药性检测是艾滋病防控和治疗中的一个重要环节。首先，hiv-1感染人群的耐药检测，可以监测和了解hiv-1耐药毒株流行的状况、发展趋势以及影响因素；其次，感染者在抗病毒治疗前进行耐药检测，可指导主治医生制定精准的抗病毒治疗方案，保证抗病毒治疗的效果；第三，对抗病毒治疗失败的病人进行耐药检测，临床医生可以通过检测结果分析治疗失败原因，并及时调整抗病毒治疗方案。

5、不管是hiv耐药检测还是超感染检测，最重要的是要准确获得感染者体内hiv准种序列信息。目前常用测序方案大多为一代测序和二代测序，都有其限制性。一代测序长期以来是hiv耐药性检测的“金标准”，但其灵敏度低，难以发现低频耐药突变；通量低，操作繁琐，难以满足大规模筛查或监测的需求；成本高，对样本病毒载量要求高。二代测序虽然通量更高，但其读长短，导致基因组碎片化；无法进行连锁分析，解析复杂重组型困难；处理和分析流程复杂。因此，目前缺少一种可用于hiv-1超感染检测和hiv耐药性检测的检测效率更高的检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供基于长读长三代测序技术的hiv近全长基因组测序用引物组、测序方法和应用。本发明所述引物组的检测灵敏度高且检测效率高，可用于hiv-1基因分析、hiv-1超感染检测和hiv耐药性检测。

2、本发明提供了基于长读长三代测序技术的hiv近全长基因组测序用引物组，所述引物组包括检测gag-pol区的引物组和检测pol-nef区的引物组；所述检测gag-pol区的引物组包括检测gag-pol区的外引物和检测gag-pol区的内引物；所述检测pol-nef区的引物组包括检测pol-nef区的外引物和检测pol-nef区的内引物；所述检测gag-pol区的外引物包括核苷酸序列如seq id no.1所示的hiva_f1和核苷酸序列如seq id no.2所示的hiva_r1；所述检测gag-pol区的内引物包括核苷酸序列如seq id no.3所示的hiva_f2和核苷酸序列如seq id no.4所示的hiva_r2；所述检测pol-nef区的外引物包括核苷酸序列如seqid no.5所示的hivb_f1、核苷酸序列如seq id no.5所示的hivb_r1.1和核苷酸序列如seqid no.7所示的hivb_r1.2；所述检测pol-nef区的内引物包括核苷酸序列如seq id no.8所示的hivb_f2和核苷酸序列如seq id no.9所示的hivb_r2。

3、本发明还提供了基于长读长三代测序技术的hiv近全长基因组测序用试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物组和反应试剂。

4、优选的是，所述试剂盒包括反转录巢式pcr反应试剂盒，当所述试剂盒为反转录巢式pcr反应时，所述反应试剂包括反转录巢式pcr反应试剂。

5、优选的是，所述试剂盒还包括病毒rna提取试剂盒和长读长三代测序建库试剂盒。

6、本发明还提供了上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒在制备基于长读长三代测序技术的hiv近全长基因组测序用产品、hiv-1基因分析产品、超感染检测用产品和hiv耐药性检测用产品中任一项中的应用。

7、本发明还提供了一种基于长读长三代测序技术的hiv近全长基因组测序方法，包括以下步骤：对待测样本中的hiv病毒的rna进行提取，获得hiv病毒rna；

8、利用上述技术方案所述引物组对所述hiv病毒rna进行反转录巢式pcr反应，得到反转录巢式pcr产物；

9、对反转录巢式pcr产物进行长读长三代测序。

10、优选的是，所述反转录巢式pcr反应包括第一轮扩增反应和第二轮扩增反应；所述第一轮扩增反应以所述hiv病毒rna为模板，分别利用检测gag-pol区的外引物和检测pol-nef区的外引物进行第一轮rt-pcr扩增，得到第一轮扩增产物；

11、所述第二轮扩增反应以第一轮扩增产物为模板，分别利用检测gag-pol区的内引物和检测pol-nef区的内引物进行第二轮pcr扩增，得到反转录巢式pcr产物。

12、优选的是，每50 µl所述第一轮扩增反应的反应体系含：25 µl反应buffer、1 µl逆转录酶、4µl扩增酶、外引物2µl、hiv病毒rna 5µl和余量的水；所述第一轮扩增反应的扩增程序为：45℃ 15 min，1个循环；94℃ 2 min，1个循环；98℃ 10 sec，60℃ 15 sec，68℃ 1min，32个循环；68℃ 5min，1个循环。

13、优选的是，每50 µl所述第二轮扩增反应的反应体系含：10 µl扩增buffer、1µldntp mix、2µl扩增酶、内引物2µl、第一轮扩增产物5 µl和余量的水；所述第二轮扩增反应的扩增程序为：98℃ 30 sec，1个循环；98℃ 10 sec，60℃ 15 sec，68℃ 5 min，28个循环；68℃ 5min，1个循环。

14、优选的是，所述长读长三代测序的平台包括齐碳、普译、ont、今是或pacbio。

15、本发明提供了基于长读长三代测序技术的hiv近全长基因组测序用引物组。本发明所述引物组靶向捕获的灵敏性高，可对较低载量的hiv核酸进行捕获。本发明仅用针对两端目标序列的两组引物即可扩增得到hiv近全长，有利于后续的生信分析，特别是针对准种分析方面有很大优势，且能实现hiv-1基因分析、hiv-1超感染检测和hiv耐药性检测。具体的，利用本发明引物组和进行反转录巢式pcr能实现hiv近全长扩增，后续通过基于单分子测序原理的第三代测序技术平台，因其高通量和长读长（>20 kb）的特性，能够实现真正意义上的高通量近全长hiv准种分析。二代测序（next-generation sequencing，ngs）也可实现高通量测序，但是其存在读长限制，对大量混合的短读长片段进行拼接成的序列并不能真正代表体内每个相应的完整的准种水平。

16、进一步的，本发明测序方法具有以下有益效果：

17、①灵敏性高，基于本发明引物组，采用巢式扩增方案进行两轮扩增，最终提高了靶向捕获的灵敏性，可对较低载量的hiv核酸进行捕获；试验结果表明，本发明方法能够检测出99：1的混合样本准种比例，即至少能够检测出1%的劣势准种；

18、②扩增片段长，本方法采用长片段扩增方案，仅用两组引物扩增得到hiv近全长，有利于后续的生信分析，特别是针对准种分析方面有很大优势；

19、③适配性高，本发明扩增得到的hiv近全长扩增产物，可适配ont、pacbio、奇碳、普译、今是等大部分进口和国产三代测序平台。