一种甘露糖修饰的树枝状大分子及其制备方法和应用

本发明属于药物载体，具体涉及一种甘露糖修饰的树枝状大分子及其制备方法和应用。

背景技术：

1、血脑屏障（blood-brain barrier，bbb）是中枢神经系统中具备高度选择性通透能力的生理屏障结构，主要由脑微血管内皮细胞、内皮细胞间的紧密连接、周细胞、星形胶质细胞终足以及基底膜共同构成。在生理状态下，血脑屏障可通过严格的物质筛选功能有效维持脑内微环境的稳态，阻挡血液中的外源性有害物质侵入脑组织，对于保护中枢神经系统的正常生理功能具有不可替代的重要作用。然而，血脑屏障的高度选择性屏障效应也成为中枢神经系统疾病诊疗的核心瓶颈——其显著限制了外源性治疗药物、诊断探针及大分子功能材料向脑组织的递送效率，导致绝大多数神经系统疾病相关药物难以在脑内达到有效治疗浓度，严重制约了脑部疾病诊断与治疗技术的发展。

2、目前，用于提升药物脑内递送效率的技术手段主要分为暂时性破坏血脑屏障、局部侵入式给药以及借助内源性转运系统介导递送三大类。其中，暂时性破坏血脑屏障的方法通常通过物理刺激、渗透压调节或化学调控等方式短暂开放屏障结构，虽能在一定程度上增加药物的脑内渗透量，但该类方式会破坏血脑屏障的生理完整性，存在引发脑内稳态失衡、有害物质侵入等安全性风险。颅内注射、脑室注射等局部给药方式可直接绕过血脑屏障将药物递送至脑部靶区，但该类方法具有明显的侵入性，临床操作难度高，且易引发感染、脑组织损伤、药物分布不均等问题，无法满足长期、重复给药的临床需求，难以实现广泛应用。因此，开发可通过静脉注射等系统给药方式实现高效、安全跨血脑屏障递送的载体体系，始终是脑部疾病药物递送领域亟待突破的关键技术问题。

3、纳米递药载体凭借粒径可调、表面易修饰、载药能力可控等优势，已成为跨血脑屏障递送领域的研究热点。其中，树枝状大分子作为一类具有高度支化三维结构的纳米级高分子材料，具有分子结构明确、尺寸均一、表面官能团丰富以及易于功能化修饰等突出特点，可作为小分子药物、核酸药物、蛋白多肽及成像探针的递送平台，在生物医药领域展现出广阔的应用前景。但现有树枝状大分子载体应用于脑部递送时，仍存在诸多难以兼顾的技术缺陷，尚未能实现安全性与递送效率的平衡。

4、具体而言，表面带正电荷的树枝状大分子可通过静电作用与细胞膜产生较强相互作用，提升细胞摄取效率，但其表面正电性也易造成细胞膜损伤，同时会导致血液相容性下降、神经细胞毒性升高，极大限制了其在脑部递送中的安全应用。表面经羟基、羧基或其他中性亲水基团修饰的树枝状大分子虽具备良好的生物相容性与水溶性，但与血脑屏障内皮细胞之间缺乏特异性相互作用，跨血脑屏障的转运效率十分有限，难以实现有效的脑组织富集。此外，聚乙二醇（peg）修饰是改善纳米材料水溶性、分散稳定性与体内循环行为的常规手段，peg化修饰可降低载体与血浆蛋白及单核吞噬细胞系统的非特异性相互作用，延长体内循环半衰期，但单纯的peg化修饰无法赋予载体主动跨血脑屏障的能力，其脑递送效率仍难以满足中枢神经系统疾病的诊疗需求。

5、研究表明，血脑屏障内皮细胞具有载体介导转运、受体介导转胞及吸附介导转胞等多种物质转运机制，可选择性调控特定物质进入脑组织。糖基结构广泛存在于生物体内，具有优异的生物相容性，且可参与细胞识别、黏附及跨膜转运等生理过程。因此，将糖基功能单元修饰于树枝状大分子表面，可通过糖基与血脑屏障内皮细胞表面转运蛋白的特异性结合，增强载体与屏障细胞的相互作用，促进其跨血脑屏障转运，从而提升脑组织的富集程度。但目前现有技术中，尚缺乏结构明确、尺寸均一、水溶性优异、生物相容性高且表面具有高密度糖基修饰的树枝状大分子载体体系，无法在避免正电荷毒性、无需破坏血脑屏障的前提下，实现高效的脑实质递送。

6、综上，开发一种结构精确可控、生物相容性好、具备高效穿透血脑屏障能力的树枝状大分子递送载体，对于推动中枢神经系统疾病的精准诊疗具有重要的现实意义，也是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、基于上述问题，本发明提供甘露糖修饰树枝状大分子载体gb3，具有明确的三代树枝状层级结构，其中以寡聚乙二醇作为亲水性骨架，采用固相合成方法逐步构筑大分子核心，并通过高效的铜催化叠氮-炔环加成（cuaac）点击反应进一步在外围修饰了靶向配体甘露糖。gb3可规避强正电荷带来的细胞毒性，经静脉全身给药后高效穿透血脑屏障并富集于脑组织，可用于神经疾病小分子药、核酸、蛋白药物及影像探针的递送，为中枢神经系统疾病诊疗提供全新技术方案。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供了一种具有跨血脑屏障能力的甘露糖修饰树枝状大分子，所述树枝状大分子以寡聚乙二醇结构为亲水性骨架，并通过叠氮-炔环加成点击反应在外围共价修饰甘露糖基团。

4、进一步地，所述树枝状大分子为完整的三代层级结构，分子中心含有一个可用于偶联修饰的游离氨基，分子外围共价连接有27个甘露糖基团；所述寡聚乙二醇支化单元与甘露糖之间通过1,2,3-三唑键连接，其具体的化学结构式如下：

5、。

6、本发明还提供了一种制备所述甘露糖修饰树枝状大分子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7、（1）采用固相合成法，以肟树脂为载体，通过酰胺化缩合与脱保护循环逐步构筑支化骨架，随后接入含丙炔基的支化单元最后从树脂上切除，获得外围含丙炔基的前体树枝状大分子；

8、（2）将所述前体树枝状大分子与叠氮修饰的甘露糖衍生物在铜催化体系下发生叠氮-炔环加成反应，经纯化后得到所述甘露糖修饰树枝状大分子。

9、进一步地，步骤（1）具体为：将含三个boc保护氨基的三支化单体m3与肟树脂在缩合体系中进行初始偶联反应，经乙酸酐封端后，循环进行三氟乙酸脱保护与单体m3的酰胺化缩合反应；随后接入含丙炔基的支化单元分子tralk-cooh，最后利用1,2-双（2-氨基乙氧基）乙烷将产物从树脂上切除，经沉淀纯化后获得外围含27个丙炔基的第2.5代树枝状大分子ga2.5。

10、进一步地，所述单体m3与肟树脂的初始偶联反应为40℃下震摇反应12 h；循环酰胺化缩合反应及丙炔基支化单元接入反应均为40℃下反应4 h；产物从树脂上的切除反应为室温下震摇3 h；

11、进一步地，步骤（2）中，所述叠氮修饰的甘露糖衍生物为man-n3；所述铜催化体系为六氟磷酸四乙腈铜与三（3-羟丙基三唑甲基）胺的组合；反应溶剂为n,n-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂；反应在液氮冷冻-泵抽-解冻除氧及氩气保护下，于50℃条件下搅拌反应48h；反应后经去离子水稀释、透析纯化及冷冻干燥得到终产物。

12、本发明还提供了一种所述的甘露糖修饰树枝状大分子在制备用于脑部疾病高效诊疗的药物或纳米递药载体中的应用。

13、进一步地，所述树枝状大分子通过表面甘露糖基团与血脑屏障内皮细胞高表达的葡萄糖转运蛋白glut1发生特异性底物结合，实现跨血脑屏障的高效递送。

14、进一步地，所述树枝状大分子经系统给药后，脑组织定量摄取量高达0.8% id/g；所述纳米递药载体用于递送小分子药物、核酸药物、蛋白药物或成像探针。

15、由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术效果如下：

16、本发明所构建的树枝状大分子纳米载体，通过精密的层代结构演进与叠氮-炔点击化学反应，成功在寡聚乙二醇亲水骨架的外围高密度地共价呈现了27个甘露糖基团。此设计不仅使得该大分子在无需进行传统peg后修饰的情况下即可获得优越的生物相容性与高达10 mg/ml的水溶性，同时高密度甘露糖修饰赋予载体高效的脑部转运能力。

17、借助树枝状大分子纳米载体表面高密度甘露糖配体与血脑屏障内皮细胞葡萄糖转运蛋白 1（glut1）之间的特异性结合作用，该水合动力学直径约为8 nm的均一纳米载体能够高效特异性穿透血脑屏障紧密连接结构。这一创新设计从根本上规避了高风险性破坏血脑屏障的侵入性手段，在保证对海马神经元细胞（ht22）无明显暗毒性的极佳安全性前提下，实现了向活体脑实质的显著、高效富集，其活体脑部荧光信号强度达到了同代peg化对照组的约1.57倍，最高定量脑摄取量可达0.8% id/g。

18、本发明为新一代非侵入性中枢神经系统疾病诊疗药物及纳米递送载体提供了关键的先导化合物与底层技术支撑。