一种利用蝙蝠蛾拟青霉转化三七须根总皂苷制备稀有人参皂苷的方法

本发明涉及微生物生物转化，具体涉及一种利用蝙蝠蛾拟青霉转化三七须根总皂苷制备稀有人参皂苷的方法。

背景技术：

1、三七为五加科人参属植物，其根部含有多种达玛烷型皂苷成分。三七加工过程中除主根外还会产生一定量的须根等原料，其中仍含有三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rd等皂苷成分。因此，如何对三七须根中所含皂苷成分进行进一步转化利用，对于提高三七须根的利用程度具有实际意义。

2、根据皂苷母核结构及糖基连接方式的不同，三七所含皂苷包括原人参二醇型皂苷和原人参三醇型皂苷。相对于三七原料中含量较高的部分原生皂苷，人参皂苷ck（compoundk）、rh2、rh1、rg2等稀有人参皂苷在天然原料中的含量通常较低，其制备需要进一步对相应原生皂苷进行结构转化。

3、生物转化利用微生物生长代谢过程中形成的酶系对皂苷糖苷键进行作用，可以使具有较多糖基的原生皂苷进一步转化为糖基数量减少或者结构发生变化的皂苷产物。由于不同微生物所具有的酶系组成及底物适应能力存在差异，其对不同母核类型皂苷以及不同连接位置糖苷键的作用能力亦存在差异。因此，对于同时含有多种ppd型和ppt型原生皂苷的三七须根总皂苷而言，能否利用同一微生物体系对不同结构类型的主要原生皂苷进行有效转化，并在同一转化体系中形成多种稀有人参皂苷，取决于所选择菌株与复合皂苷底物之间的生物转化适配关系。

4、同时，以三七须根总皂苷作为底物时，各原生皂苷并非彼此独立存在，而是以具有不同初始含量和不同结构类型的复合皂苷体系共同存在。若所采用的微生物仅能够有效作用于其中一种或者少数皂苷，则其余主要原生皂苷仍难以得到充分转化；相应地，所得产物组成也容易受到菌株转化能力及底物组成的限制。

5、因此，有必要提供一种适用于三七须根总皂苷的生物转化方法，使三七须根总皂苷中的不同结构类型原生皂苷能够在同一培养体系内发生生物转化，并形成包含多种稀有人参皂苷的转化产物，从而为三七须根皂苷资源的进一步利用以及稀有人参皂苷的制备提供新的技术途径。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种利用蝙蝠蛾拟青霉转化三七须根总皂苷制备稀有人参皂苷的方法，以三七须根总皂苷作为包含多种原生皂苷的复合底物，利用蝙蝠蛾拟青霉bncc109763对其中的原人参二醇型皂苷和原人参三醇型皂苷进行生物转化，使两类皂苷能够在同一液体培养体系中发生转化，并获得包含多种稀有人参皂苷的转化产物。

2、为实现上述目的，本发明提供一种利用蝙蝠蛾拟青霉转化三七须根总皂苷制备稀有人参皂苷的方法，包括以三七须根为原料制备三七须根总皂苷，所述三七须根总皂苷包含三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1和人参皂苷rd；培养蝙蝠蛾拟青霉bncc109763，获得用于生物转化的种子液；将所述种子液接种至含有所述三七须根总皂苷的液体培养体系中进行发酵转化，使所述三七须根总皂苷中的原人参二醇型皂苷与原人参三醇型皂苷在同一液体培养体系中均发生生物转化；获得经所述生物转化形成的转化产物，所述转化产物同时包含由所述原人参二醇型皂苷转化形成的稀有人参皂苷和由所述原人参三醇型皂苷转化形成的稀有人参皂苷。

3、在一些实施例中，所述三七须根总皂苷通过对三七须根进行醇提取并进一步采用大孔吸附树脂进行纯化获得。具体地，可以采用乙醇对三七须根进行浸提，获得含皂苷提取物，再将所述含皂苷提取物经大孔吸附树脂纯化，通过除杂和皂苷洗脱获得三七须根总皂苷。

4、在一些实施例中，采用85%乙醇对三七须根进行两次室温冷浸，每次48 h；所述大孔吸附树脂采用d101大孔吸附树脂，上样后依次采用水和20%乙醇进行除杂，并采用80%乙醇对皂苷组分进行洗脱。

5、通过上述提取纯化得到的三七须根总皂苷中至少包含三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1和人参皂苷rd，从而形成同时含有原人参二醇型皂苷和原人参三醇型皂苷的复合生物转化底物。

6、在一些实施例中，采用pdb液体培养基培养蝙蝠蛾拟青霉bncc109763，在25 ℃、150 r/min条件下振荡培养5 d，获得用于后续发酵转化的种子液。

7、在一些实施例中，将所述三七须根总皂苷加入液体培养体系，使其终浓度为2.0mg/ml，将所述种子液接种至所述液体培养体系后，在25 ℃、150 r/min条件下进行20 d发酵转化。

8、应当理解的是，上述培养温度、振荡速度、培养时间和底物终浓度属于经实验筛选获得的优选实施条件，用于说明本发明所述生物转化方法能够具体实施，而并非将本发明所依赖的生物转化关系限定于上述单一参数组合。

9、进一步地，利用蝙蝠蛾拟青霉bncc109763对所述三七须根总皂苷进行生物转化后，人参皂苷rb1、三七皂苷r1、人参皂苷rg1以及人参皂苷re均发生相应转化，使ppd型和ppt型主要原生皂苷能够在同一发酵体系中被利用。

10、结合生物转化前后的底物组成、转化产物以及分离获得的中间产物，所述原人参二醇型皂苷的转化可以包括人参皂苷rb1经人参皂苷rd、人参皂苷f2和ck向20(s)-rh2转化；所述原人参三醇型皂苷的转化可以包括人参皂苷rg1经20(s)-rh1向rh4转化、三七皂苷r1向20(s)-r2转化以及人参皂苷re向20(s)-rg2转化。

11、应当说明的是，上述转化关系系根据实际检出的底物、中间产物和终产物之间的组成及结构关系所推测的主要生物转化路径，用于说明蝙蝠蛾拟青霉bncc109763作用于三七须根总皂苷时所形成的转化关系，并不表示各中间反应步骤均已经通过单独酶学反应或者同位素示踪实验逐一验证。

12、在一些实施例中，对生物转化前后的皂苷组分采用hplc进行定量，根据对应原生皂苷在生物转化前后的含量变化确定其转化率。经检测，三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷re和人参皂苷rb1均具有明显的转化，其中上述主要皂苷的转化率均超过50%。

13、进一步地，完成生物转化后得到的转化产物至少可以包含20(s)-rh1、f2、rh4、ck、20(s)-rh2、20(s)-rg2、r2、rg6、rk3、f4、rg3、20(r)-rg3、rk1、20(r)-rh1、20(r)-ppd和20(r)-rh2。

14、在一些实施例中，对生物转化完成后的发酵体系进行产物回收，获得转化浸膏；并采用正相硅胶柱色谱、中压液相色谱mplc和sephadex lh-20凝胶柱色谱中的一种或者多种对所述转化浸膏进行进一步分离纯化，由此获得相应的稀有人参皂苷单体。

15、本发明还提供一种三七须根总皂苷生物转化产物组合物，由三七须根总皂苷经蝙蝠蛾拟青霉bncc109763生物转化获得，并至少包含20(s)-rh1、f2、rh4、ck、20(s)-rh2、20(s)-rg2、r2、rg6、rk3、f4、rg3、20(r)-rg3、rk1、20(r)-rh1、20(r)-ppd和20(r)-rh2。

16、本发明还提供蝙蝠蛾拟青霉bncc109763在将三七须根总皂苷转化为同时含有原人参二醇型稀有人参皂苷和原人参三醇型稀有人参皂苷的转化产物中的应用。

17、由此，本发明并非以某一种单一原生皂苷作为唯一转化对象，而是以三七须根总皂苷所形成的复合皂苷体系作为底物，利用特定蝙蝠蛾拟青霉菌株在同一培养体系中对不同母核类型的主要原生皂苷进行生物转化，从而形成包含多种稀有人参皂苷的转化产物。

18、本发明的有益效果：

19、与将三七须根中的皂苷资源仅作为提取对象相比，本发明利用蝙蝠蛾拟青霉bncc109763进一步对所得三七须根总皂苷进行生物转化，使三七须根中含量较高的多种原生皂苷继续向稀有人参皂苷转化。在实际实验中，三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷re和人参皂苷rb1的转化率分别达到52.74%、61.45%、53.87%和93.41%，四种主要原生皂苷的转化率均超过50%。其中，人参皂苷rb1属于ppd型皂苷，而三七皂苷r1、人参皂苷rg1及人参皂苷re属于ppt型皂苷，由此说明所述菌株能够在同一复合底物体系中兼顾不同母核类型主要皂苷的生物转化，而不是仅针对某一种单一皂苷形成转化作用。

20、本发明通过蝙蝠蛾拟青霉bncc109763与三七须根总皂苷之间的生物转化关系，使一个发酵体系中能够形成具有不同母核类型及不同糖基取代状态的多种稀有人参皂苷。实际检测可以获得至少16种皂苷及相关生物转化产物，包括20(s)-rh1、f2、rh4、ck、20(s)-rh2、20(s)-rg2、r2、rg6、rk3、f4、rg3、20(r)-rg3、rk1、20(r)-rh1、20(r)-ppd和20(r)-rh2，并且能够从转化产物浸膏中进一步实际分离得到20(s)-rh1、f2、rh4、ck、20(s)-rh2、20(s)-rg2及20(s)-r2等多种结构明确的皂苷单体。因此，本发明所获得的技术效果并非仅表现为原生皂苷含量下降，而能够落实为多种稀有人参皂苷的实际形成及分离获得，使复合底物的转化结果具有明确的产物基础。

21、本发明采用三七加工过程中能够获得的三七须根作为皂苷来源，经提取纯化后作为蝙蝠蛾拟青霉的复合生物转化底物，使三七须根中的原生皂苷能够进一步转化形成具有更高后续利用价值的稀有人参皂苷。在扩大培养实验中，采用126个500 ml培养体系进行同步发酵转化，能够获得303 g转化产物浸膏；同时，各主要检测环节均设置相应平行实验或者重复验证。由此表明，本发明不仅在分析检测尺度上能够观察到皂苷组成变化，而且具有扩大培养、转化产物回收以及后续分离纯化的实际实施基础，为三七须根总皂苷的进一步利用以及多种稀有人参皂苷的制备提供了一种可实施的生物转化途径。

22、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。