一种诱导雨生红球藻聚集生长及提高虾青素产量的方法

本发明涉及一种诱导雨生红球藻聚集生长及提高虾青素产量的方法，属于生物材料与微藻生物。

背景技术：

1、虾青素是一种具有强抗氧化活性的高值酮式类胡萝卜素，在营养保健品、化妆品和水产养殖等领域具有广泛的应用前景。与化学合成的虾青素相比，天然虾青素因其安全性和消费者偏好而更具市场优势。雨生红球藻是天然虾青素的最重要来源，该藻类在高光照、营养缺乏或盐胁迫下能够大量积累虾青素，形成红色厚壁孢子。雨生红球藻的传统悬浮培养面临多重挑战。藻细胞对剪切力和环境波动高度敏感，维持最佳生长与胁迫诱导条件控制困难，且收获和加工过程繁琐、能耗高。细胞固定化和包封技术为解决上述问题提供了有效途径。通过将微藻包封于水凝胶基质中，可以保护细胞免受机械应力损伤、稳定局部培养条件、简化分离和反应器设计。

2、海藻酸盐基水凝胶因其良好的生物相容性、温和的凝胶化条件及易于加工成珠粒或胶囊的特点，是微藻包封最常用的材料之一。核壳结构的胶囊由凝胶壳层包裹液体核心的构型能够进一步改善物质传质效率，同时提供明确的保护屏障。然而，传统海藻酸盐胶囊普遍存在力学强度不足、溶胀不可控、结构稳定性差等问题，难以满足长期培养及虾青素诱导所需的胁迫条件。在水凝胶中引入磷酸钙（cap）等无机成分可在一定程度上改善材料的力学稳定性、调控孔隙率和生物功能性。例如矿化海藻酸钙复合水凝胶已被证实能够支持成骨细胞等动物细胞的分化。

3、然而，将仿生矿化水凝胶作为微藻包封载体，特别是用于虾青素等高值代谢产物的受控生产，目前尚缺乏可行性的系统研究和应用。与哺乳动物细胞不同，微藻依赖光合作用维持生长和代谢，其生长效率直接取决于光子通量、co2传质速率和营养物质扩散效率。现有技术研究表明，保护性涂层或包封层在强化微环境的同时，存在限制光传输、营养物质扩散或气体交换的权衡代价（environ. sci. technol., 2026, 60(22): 15462-15481）。该文献还指出，微藻的光合作用本身即受到光子浪费以及co2在水中扩散速率缓慢的制约。

4、进一步研究显示将藻类细胞与仿生矿化直接复合，会降低其细胞的聚集效率，同时会降低光的通透性，显著降低藻类细胞光使用效率（chem. commun., 2013, 49, 7525-7527；angew. chem. int. ed., 2015, 54: 11961-11965.）。因此，若将仿生矿化策略引入微藻包封体系，矿化层中磷酸钙的引入可能进一步降低壳层的光透过率、增加co2和营养物质的扩散阻力，从而对包封微藻的光合作用、生长速率和细胞活性产生不利影响。

5、基于上述原因，现有研究仍然倾向于采用聚合物共混、交联优化等有机改性策略来优化微藻的虾青素产量。如何在不损害微藻光合作用和生长活性的前提下，通过仿生矿化策略增强海藻酸盐胶囊的力学性能和结构稳定性，同时为雨生红球藻的高光胁迫和虾青素积累提供适宜的微环境，是本领域尚待解决的技术难题。综上所述，研究一种诱导雨生红球藻聚集生长及其提高虾青素产量的方法对于生物材料与微藻生物技术领域具有重要意义。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种诱导雨生红球藻聚集生长及提高虾青素产量的方法。本发明摒弃了常规的外源纳米颗粒掺杂或简单的表面包覆，构建磷酸钙-海藻酸钠-羧甲基纤维素复合矿化壳层。该过程条件温和、可控，避免了外源矿化材料在壳层中的无序团聚，保证了核壳胶囊壳层具有适宜的孔隙率和光学通透性，从而有效克服了现有技术中矿化层导致的光传输受阻和物质传质受限问题，确保了雨生红球藻在胶囊内正常的光合作用和营养交换。

2、其次，本发明通过精准调控矿化条件，使所制备的磷酸钙-海藻酸钠-羧甲基纤维素壳层显著降低了溶胀率、提高了机械强度，同时保持了良好的生物相容性，避免了矿化过程对细胞活性的损害。本发明能够有效支持雨生红球藻的生长和高光胁迫诱导的虾青素积累。

3、为了实现上述目的，本文提供以下技术方案：

4、本发明首先提供了一种诱导雨生红球藻聚集生长及其提高虾青素产量，其包括以下步骤：

5、1）将处于对数生长期的雨生红球藻细胞悬液经离心浓缩后，加入羧甲基纤维素与钙盐的混合溶液中，混合均匀得到含藻细胞、羧甲基纤维素、钙盐的预混液；将所述预混液滴入含磷酸盐的海藻酸钠溶液中并持续搅拌，通过交联在液滴表面形成凝胶壳层，同时磷酸根离子与钙离子在所述壳层内原位矿化生成磷酸钙矿化复合材料；收集所得胶囊并洗涤，转移至钙盐溶液中，同步在搅拌的状态下固化，得到磷酸钙-海藻酸钠-羧甲基纤维素复合壳层包裹的雨生红球藻仿生矿化复合核壳胶囊；

6、2）将步骤1）所得胶囊置于培养基中进行光自养培养，使藻细胞在所述胶囊核相内增殖并聚集成团；

7、3）对步骤2）所得胶囊施加光照处理，诱导所述聚集态藻细胞积累虾青素，胶囊培养用于虾青素的收集。

8、优选的，所述雨生红球藻为对数生长期细胞，细胞悬液要离心浓缩，离心浓缩条件为：转速3000-5000 rpm，时间5-10 min。

9、优选的，向细胞离心后沉淀物种加入羧甲基纤维素与氯化钙的混合溶液，混合均匀得到含藻细胞、羧甲基纤维素、钙盐的预混液。

10、优选的，所述预混液中，雨生红球藻浓度为2×104 -8×104 cells/ml，钙盐质量百分比浓度为0.5-2%，羧甲基纤维素的质量百分比浓度为0.5-2%。

11、羧甲基纤维素分子量为200000-300000，所选的雨生红球藻种类为：712 品系藻株（fachb-712）、h797品系藻株（fachb-797），两种雨生红球藻在学术研究中被广泛使用，均可从中国科学院淡水藻种库购买；所述钙盐可选自氯化钙、硝酸钙等可溶性钙盐。

12、优选的，所述海藻酸钠溶液的质量百分比浓度为0.2%-2.5%，磷酸根来源包括但不限于磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸钠或磷酸钾，海藻酸钠溶液中磷酸根浓度为100 mm-500mm。

13、优选的，预混液以液滴形式滴入含磷酸盐的海藻酸钠凝胶复合物中并持续温和搅拌，预混液与海藻酸钠溶液的体积比为1：15-30；滴入高度为1-4 cm，反应时间为2-8 min。钙盐溶液为含氯化钙或硝酸钙的溶液，钙盐的质量百分比浓度为0.5-2%，固化时间为2-10min。

14、根据本发明的优选方案，步骤1）中所述同步在搅拌的状态下固化，其中，搅拌速度为200-800 rpm，搅拌时间为2-10 min；搅拌状态可以加速钙离的交联，更重要的是，该搅拌可以显著提高羧甲基纤维素缓慢扩散与磷酸钙-海藻酸钠矿化壳层的微孔中，在2-10 min内快速复合，得到仿生矿化磷酸钙-海藻酸钠-羧甲基纤维素复合壳层包裹。

15、优选的，所述仿生矿化磷酸钙-海藻酸钠-羧甲基纤维素复合的核壳胶囊的胶囊直径为1-5 mm；其结构特征为核壳结构，磷酸钙矿化物为原位形成于凝胶壳层内，壳层材料为磷酸钙与海藻酸钠矿化复合物，壳层厚度为100-500 µm，包裹的核材料为雨生红球藻与羧甲基纤维素复合物，雨生红球藻混匀分散在核内。

16、优选的，所得胶囊置于培养基中进行光自养培养，使藻细胞在所述胶囊核相内增殖并聚集成团，可在培养5-7天内逐渐实现聚焦成球。

17、优选的，所得胶囊施加光照处理，光照时间为5-7天，光照功率密度为25-120w/m2；优选采用功率密度为100w/m2的高光处理，进一步优选为全天24h进行光照。所述的胶囊培养可快速用于虾青素的收集，微胶囊可通过简单静置，无需离心步骤即可实现与培养基的快速分离和微胶囊收集，微胶囊可通过柠檬酸钠溶液快速裂解实现微胶囊内虾青素的收集，单位质量的雨生红球藻虾青素产量比游离培养的方法提高3-6倍。

18、本发明还进一步提供了一种诱导雨生红球藻聚集生长及其提高虾青素产量的方法，作为雨生红球藻提供了聚集生长的方法，并可提高雨生红球藻产生虾青素的产量。

19、优选的，该技术为兼具聚集生长诱导活性成分产量的藻类细胞的培养提供了新方法，并可提高其活性成分物质的产量。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

21、本发明采用仿生矿化策略制备磷酸钙-海藻酸钠-羧甲基纤维素复合核壳胶囊，方法简单、条件温和可控。所制备的仿生矿化胶囊具有降低的溶胀率、增强的机械强度、良好的生物相容性，能够为包封的雨生红球藻提供稳定的生长微环境，并在高光胁迫条件下促进虾青素的积累，具有良好的工业化应用前景。

22、本发明进一步研究了海藻酸钠、仿生矿化过程中搅拌条件以及矿化程度对包封雨生红球藻生长的影响。实验结果表明，海藻酸钠是确保复合材料结构稳定性的必要成分，缺少海藻酸钠无法诱导雨生红球藻的功能调节，无法形成限域的生长空间。在搅拌速度为200-1000 rpm，搅拌时间为2-10 min下，凝胶浴中磷酸盐浓度在100 mm-500 mm范围内时，包封的雨生红球藻均能正常生长并积累虾青素；其中450 mm组效果最优，培养7天后细胞数量达到3.65×107个/胶囊，而当磷酸盐浓度达到600 mm时，包封的雨生红球藻生长极为有限，表明过度的磷酸钙矿化会加剧壳层对光传输和物质传质的限制，抑制微藻的光合作用和生长。而未经搅拌处理的胶囊结构无法有效形成，无法有效果的形成对雨生红球藻的核壳状包裹。本发明通过调控搅拌条件并使磷酸盐浓度在适宜范围内，在增强胶囊力学性能的同时，避免了矿化层对光传输和物质传质的不利影响，实现了力学性能与生物功能的兼顾。

23、结合本发明实施例11及实验结果可知，在高光胁迫条件下，仿生矿化胶囊不仅未对细胞造成额外的传质阻碍，反而显著促进了虾青素的积累高光胁迫后，与低光条件（25w/m2、16 h光照/8 h黑暗）下游离未包封藻细胞相比，450 mm仿生矿化胶囊中的虾青素含量达到39.41 mg/g（提高了约3.99倍），证实了其在增加活性产物含量方面的优越性。