一种提高二维DNA晶体组装效率的方法

本发明属于dna纳米，具体涉及一种提高二维dna晶体组装效率的方法。

背景技术：

1、dna纳米技术利用dna分子碱基互补配对的特异性及序列的可编程性，以dna为基本单元自组装形成具有确定形状与尺寸的纳米结构。现有的二维dna晶体组装技术主要分为两类：dna折纸技术（dna origami）与模块化组装技术，后者包括dna瓦片（dna tiles）组装和dna砖瓦（dna bricks）组装。dna折纸技术以一条长的天然dna骨架链与数百条短链（staple strands）退火折叠形成目标结构，其可构建结构的尺寸与形状受骨架链长度的限制。dna瓦片/dna砖瓦技术则通过模块化短链的退火或恒温孵育逐级组装，不依赖骨架链，原则上可构建任意尺寸与形状的复杂二维dna晶体，尤其适于制备微米量级的周期性二维dna晶体阵列，为功能纳米材料的精准设计与制造提供了工具（winfree e.等，

nature，1998，394，539-544）。

2、在模块化组装中，瓦片单元之间依靠其末端伸出的短单链（即粘性末端，stickyend）通过碱基互补配对相互连接。粘性末端的长度直接决定单元间结合的自由能，是决定组装能否发生及组装效率高低的关键参数。然而粘性末端长度的选择存在固有的两难：粘性末端过短时，单元间结合的自由能不足，杂交产物在组装温度下寿命过短，难以形成并维持稳定的组装核心，组装往往停留在寡聚体或小尺寸片状产物阶段，无法生长为大尺寸有序阵列；而单纯延长粘性末端虽可提高单元间的结合强度，却会显著增加不同粘性末端序列之间发生交叉杂交（crosstalk）与非特异性连接的概率，导致错配、分支与无序聚集，反而降低目标结构的产率，同时大幅增加序列正交设计的难度与体系可扩展性的成本。

3、针对上述问题，现有技术主要从组装条件优化入手，包括退火程序与孵育温度的优化、dna链浓度的调整、以及镁离子等阳离子种类与浓度的调控（sobczak j. p. j.等，

science，2012，338，1458-1461；martin t. g.等，

nat. commun.，2012，3，1103）；或者从序列层面对粘性末端的长度与碱基组成进行整体设计，以在结合强度与结合特异性之间取得折中（evans c. g.等，

chem. soc. rev.， 2017, 46, 3808-3829）。此类方法或需针对每一种目标结构逐一筛选组装条件，或需重新设计整套序列，工艺复杂、通用性差；更重要的是，其并未改变单位长度粘性末端所能提供的结合自由能，因而无法真正突破粘性末端长度的下限——在常规组装条件下，长度不足4个碱基的粘性末端通常难以支撑二维dna晶体的形成。

4、此外，5’磷酸化对含缺口（nick）dna缔合行为的影响亦有报道，但现有结论并不一致。一方面，对由40-mer半滑动互补寡核苷酸经20个碱基的粘性末端缔合而成的一维dna多聚体进行凝胶电泳分析表明，5’磷酸化可使多聚体形成的自由能降低约0.9 kj/mol，数均聚合度由约6.3提高至约7.6（tanaka a., 等，

chem. lett.，2008，37，758-759）；另一方面，同一研究测得该一维多聚体的熔解温度反而由38.2℃降至37.3℃，并将其归因于末端磷酸基与骨架磷酸基之间的静电排斥所引起的末端开裂（end fraying）；此前基于紫外熔解与核磁共振的研究亦得出5’磷酸化不利于缺口结构稳定的结论。因此，5’磷酸化究竟能否稳定缺口结构，在现有技术中尚无定论，且现有教导倾向于认为5’磷酸化会降低缺口处的热稳定性，从而不利于依赖退火降温的自组装过程。

5、并且，上述报道所涉及的体系均为粘性末端长度达20个碱基的一维线性多聚体，其结合自由能的增量在总结合能中所占比例极小，而一维线性缔合的聚合度对界面结合能仅呈线性响应；zhe li等（

j. am. chem. soc.，2021，143, 1498714991）采用三维dna晶体作为工具，对5’-磷酸化对粘性末端凝聚作用的调控效应进行了实验研究，发现5’-磷酸化可增强粘性末端凝聚作用，在仅通过粘性末端凝聚作用自组装形成的dna晶体中，5’-磷酸化不仅普遍促进结晶过程，还能加速晶体沿设计方向的生长，但是，一方面，二维dna晶体和三维dna晶体的自组装环境、热力学和动力学要求截然不同，因此从三维到二维的跨越也无法通过上述技术进行简单套用；另一方面，包括上述研究在内的现有技术也未涉及到5’磷酸化对二维dna点阵（晶体）组装的影响，尤其是未涉及其对组装动力学以及对可用粘性末端长度的影响。

6、因此，如何在不延长粘性末端、不重新设计序列、不引入复杂工艺步骤的前提下，提高瓦片单元间粘性末端的结合强度，从而提高二维dna晶体的组装效率与产率，并降低可用粘性末端的长度下限，是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种提高二维dna晶体组装效率的方法及由该方法制备的二维dna晶体，以克服现有技术中粘性末端过短则单元间结合自由能不足、而延长粘性末端又易引发交叉杂交与非特异性连接，难以兼顾组装效率与结合特异性的不足。

2、为实现以上发明目的，本发明采用了如下所述的技术方案：

3、作为发明的第一个目的，本发明提供一种提高二维dna晶体组装效率的方法，包括：将dna瓦片单元中带有的粘性末端进行磷酸化修饰，得到磷酸化的dna瓦片单元；再将磷酸化的所述dna瓦片单元在高浓度mg2+缓冲溶液中使所述粘性末端之间进行杂交，提高相邻所述dna瓦片单元之间的结合强度和所述dna瓦片单元自组装率。

4、本发明通过相邻两个瓦片单元的粘性末端杂交，在其连接界面处形成缺口（nick）结构；在粘性末端的5’端引入磷酸基，一方面，该末端磷酸基可与相接dna链3’端的羟基之间形成氢键，其强度高于未经磷酸化时3’-羟基与5’-羟基之间的氢键；另一方面，在本发明所采用的高浓度mg2+组装体系中，该末端磷酸基可经由与mg2+的配位在连接界面处形成阳离子桥连，同时mg2+对磷酸负电荷的屏蔽亦可抑制末端磷酸基与骨架磷酸基之间的静电排斥；在上述的氢键和mg2+配位桥连的双重机制作用下，共同增强缺口两侧双螺旋的共轴堆积与界面内聚力，从而在不增加碱基配对数目、不改变序列设计的前提下，提高相邻瓦片单元之间的结合强度，进而提高二维dna晶体的组装效率与结构稳定性；也即，本发明通过dna瓦片单元的粘性末端进行5’磷酸化修饰后再在高浓度mg2+缓冲溶液中进行杂交，使磷酸化的dna瓦片自组装形成二维dna晶体。

5、需要指出的是，在粘性末端较长的一维线性缔合体系中，上述结合强度的增量在总结合能中所占比例极小，难以产生实质性影响；而在本发明所涉及的二维点阵组装体系中，每个瓦片单元具有4个连接界面、每个连接界面含有2个缺口，且二维点阵的成核与生长对单位界面结合能呈高度非线性的响应，因此当粘性末端的长度为3-5 nt时，该增量足以使体系由不能组装成二维dna晶体转变为能够组装成二维dna晶体。

6、作为一种优选的实施方式，所述dna瓦片单元具有两条平行构象的双螺旋结构。

7、优选地，所述双螺旋结构之间具有两个交叉点，两个交叉点之间的距离为n×10.5个碱基，n为正整数。

8、作为一种优选的实施方式，所述dna瓦片单元包括瓦片a和瓦片b。

9、优选地，所述瓦片a中的粘性末端与所述瓦片b中的粘性末端通过杂交连接，形成周期性重复的二维dna晶体。

10、作为一种优选的实施方式，dna瓦片单元为5条dna单链构成的dna链。

11、作为一种优选的实施方式，所述dna瓦片单元由第一dna单链和第二dna单链构成。

12、优选地，所述第一dna单链为4条含有粘性末端的dna单链。

13、优选地，所述第二dna单链为1条不含粘性末端的dna单链。

14、优选地，所述粘性末端为所述第一dna单链的5’端在所述双螺旋结构中延长而出的单链。

15、优选地，所述粘性末端分别位于所述dna瓦片单元的两端，每端2个。

16、作为一种优选的实施方式，所述的提高二维dna晶体组装效率的方法，具体步骤包括：

17、s1、dna瓦片单元的dna单链序列的构建，包括第一dna 单链和第二dna单链；

18、s2、磷酸化：将所述第一dna单链加入磷酸化酶缓冲液中混合均匀，加入磷酸化酶并孵育，得到磷酸化的所述第一dna单链；

19、s3、dna瓦片的自组装：向磷酸化的所述第一dna单链的混合溶液中加入所述第二dna单链，在高浓度 mg2+缓冲溶液中进行退火处理，dna单链之间通过碱基互补配对杂交形成dna瓦片单元，相邻的dna瓦片单元再经粘性末端杂交而自组装形成二维dna晶体。

20、作为一种优选的实施方式，所述磷酸化酶缓冲液为1×t4多核苷酸激酶缓冲液，其组成为70 mm tris-hcl、10 mm mg2+、5 mm dtt，ph =7.6。

21、作为一种优选的实施方式，所述孵育的条件为37℃下孵育60分钟。

22、作为一种优选的实施方式，所述高浓度mg2+缓冲溶液中mg2+的浓度为17.5 mm，ph=7.0。

23、优选地，所述高浓度mg2+缓冲溶液中还包括89 mm的tris-hcl和2 mm的 edta。

24、作为一种优选的实施方式，所述第一dna单链和所述第二dna单链的摩尔比为1:1，终浓度均为500 nm。

25、作为一种优选的实施方式，所述退火处理的程序为：95℃加热3 min，随后以1℃/50 min的速率降温至22℃，共历时60 h。

26、作为一种优选的实施方式，所述粘性末端的长度为3-5 nt；此时，磷酸化的dna瓦片可自组装形成二维dna晶体。在相同的组装条件下，未经磷酸化修饰的dna瓦片需要长度不小于4 nt的粘性末端方可组装成二维dna晶体；而经5’磷酸化修饰后，粘性末端长度为3nt的dna瓦片仍可组装成二维dna晶体。即本发明通过dna瓦片单元的粘性末端进行5’磷酸化修饰后再在高浓度mg2+缓冲溶液中进行杂交，将二维dna晶体的组装的粘性末端长度的下限由4 nt降低至3 nt。

27、而当所述粘性末端的长度为1 nt或2 nt时，磷酸化与非磷酸化的dna瓦片均不能组装成二维dna晶体，但磷酸化的dna瓦片可以组装成片状的二维dna晶体，且其数量明显多于非磷酸化的dna瓦片。

28、作为发明的第二个目的，本发明还提供一种二维dna晶体，采用如上文所述的提高二维dna晶体组装效率的方法制备得到。

29、优选地，所述二维dna晶体的横向尺寸约10μm。

30、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

31、1、本发明通过对dna瓦片单元粘性末端的5’端进行磷酸化修饰，借助末端磷酸基与相接dna链3’-羟基之间的氢键作用以及末端磷酸基与mg2+之间的配位桥连作用，在不增加碱基配对数目的前提下提高了相邻瓦片单元粘性末端连接界面处的内聚力，从而提高了dna瓦片的组装效率，所得二维dna晶体的结构完整性与尺寸均优于未经磷酸化修饰的对照组。

32、2、本发明降低了可用于二维dna晶体组装的粘性末端长度下限。在相同的组装条件下，未经磷酸化修饰的dna瓦片需要长度不小于4 nt的粘性末端方可组装成二维dna晶体，而经5’磷酸化修饰的dna瓦片在粘性末端长度仅为3 nt时即可组装成二维dna晶体，显然，经5’磷酸化修饰后，二维dna晶体组装的粘性末端长度下限由4个碱基降低至3个碱基；当粘性末端长度为1-2 nt时，磷酸化的dna瓦片亦可形成数量明显更多的片状二维dna晶体，由于粘性末端越短，不同粘性末端序列之间发生交叉杂交与非特异性连接的概率越低，因此本发明在提高组装效率的同时，亦有利于降低粘性末端序列正交设计的难度。

33、3、采用本发明技术方案，能够显著缩短组装过程的迟滞期，在粘性末端长度为3nt的体系中，未经磷酸化修饰的dna瓦片在组装开始后约40 h荧光信号才出现明显上升，至60 h时组装率仅约为0.5；而经5’磷酸化修饰的dna瓦片在组装开始后约5 h即出现荧光信号的上升，至60 h时组装率接近1.0，两者在组装曲线快速上升阶段的斜率相近，表明5’磷酸化修饰主要通过降低组装起始阶段的难度、缩短迟滞期来提高组装效率，而非改变后续结构生长阶段的速率，从而在相同的组装时间内获得显著更高的组装率，为快速制备二维dna晶体提供了新的组装方法。

34、4、本发明的方法操作简单、条件温和、通用性好，仅需在常规退火组装之前进行磷酸化酶处理，无需改变瓦片单元的序列设计，无需引入化学修饰基团，亦无需其他额外的定制化设计环节，即可实现“即修饰即增强”的效果，而其增强作用来源于粘性末端杂交界面处的通用相互作用，可推广至其他依赖粘性末端杂交进行连接的二维dna晶体的组装。