NtBZR7基因在烟草绿原酸调控和种质资源改良中的应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及ntbzr7基因在烟草绿原酸调控和种质资源改良中的应用。

背景技术：

1、烟草（nicotiana tabacum l.）属于茄科一年生或有限多年生草本作物，是我国重要的经济作物，在国民经济体系中占据重要位置，国内烟草种植规模与总产量均居世界前列。多酚类物质是烟草体内一类重要次生代谢物，主要经由苯丙烷代谢通路完成生物合成，整个代谢过程受众多转录因子精密调控。烟草多酚组分主要包含绿原酸、芸香苷、莨菪亭，同时还有新绿原酸、4-o-咖啡酰奎宁酸、山奈酚葡萄糖苷等衍生物，绿原酸为烟草中占比最高的多酚物质，占总多酚含量 50%以上。

2、绿原酸也叫咖啡单宁，具有重要的药理活性。我国卫生部药品标准收录的 175种清热解毒、抗菌消炎类中成药，均将绿原酸作为核心活性组分。同时，绿原酸作为天然抗氧化物质，在食品保藏、果蔬贮藏、护肤防晒等领域同样具备广阔应用前景。对于烟草而言，绿原酸自身可释放清新香气，还能够经酶促降解生成吡嗪、吡啶、吡咯等挥发性物质，赋予卷烟特有的坚果香韵，显著改善烟叶整体香吃味品质。

3、当前烟草产业以烤烟生产为核心，但其食用、药用开发价值也逐步得到重视。烟草采收加工环节会产生约25%的废次烟沫等副产物，这部分资源尚未得到充分开发。以废次烟叶为原料开展绿原酸提取，既可以实现加工废弃物资源化再利用，还能够产生可观的经济收益。烟草组织培养体系成熟、遗传转化操作简便，借助基因编辑、转基因等育种技术创制高绿原酸烟草新材料具备现实可行性，也为把烟草开发为生物反应器、规模化获取绿原酸提供技术支撑。综上，解析烟叶绿原酸生物合成及其调控分子机理，挖掘关键调控基因，对烟草种质品质改良，以及绿原酸资源深度开发利用均具有重要的理论价值与现实意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供ntbzr7基因在烟草绿原酸调控和种质资源改良中的应用。

2、本发明提供了ntbzr7在植物种质资源改良中的应用，所述ntbzr7的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3、进一步的，所述种质资源改良包括调控绿原酸的含量。

4、所述调控绿原酸的含量包括：升高绿原酸的含量和/或降低绿原酸的含量。

5、所述升高绿原酸的含量为在植物中过表达所述ntbzr7；

6、所述在植物中过表达所述ntbzr7为通过将编码所述ntbzr7的核酸转染进入所述植物；编码所述ntbzr7的核酸的核苷酸序列如seq id no.1所示。

7、所述降低绿原酸的含量为利用vigs介导的基因沉默靶向编码所述ntbzr7的核酸。

8、所述vigs介导的基因沉默的靶向片段为seq id no.1所示的编码所述ntbzr7的核酸的第134bp~第514bp区段。

9、本发明提供了调控植物绿原酸含量的方法，其包括使用如下a）~g）所示中的至少一种对植物的绿原酸含量进行调控：

10、a）、过表达所述ntbzr7；

11、b）、靶向编码所述ntbzr7的核酸的vigs 靶标片段；

12、c）、靶向所述ntbzr7的grna；

13、d）、含有如b）所述vigs 靶标片段，或如c）所述grna的表达盒；

14、e）、含有如b）所述vigs 靶标片段，或如c）所述grna，或如d）所述表达盒的重组载体；

15、f）、转化或转染如e）所述重组载体的宿主细胞；

16、g）、培养如f）所述的宿主细胞获得的混合物。

17、进一步的，编码所述ntbzr7的核酸的核苷酸序列如seq id no.1所示；

18、所述vigs 靶标片段为seq id no.1所示的编码所述ntbzr7的核酸的第134bp~第514bp区段。

19、本发明提供了植物种质资源改良的产品，其包括如下a）~g）所示中的至少一种：

20、a）、以编码所述ntbzr7的核酸为模板的扩增引物、检测引物和/或靶向引物；

21、b）、靶向编码所述ntbzr7的核酸的vigs 靶标片段；

22、c）、靶向所述ntbzr7的grna；

23、d）、含有如b）所述vigs 靶标片段，或如c）所述grna的表达盒；

24、e）、含有如b）所述vigs 靶标片段，或如c）所述grna，或如d）所述表达盒的重组载体；

25、f）、转化或转染如e）所述重组载体的宿主细胞；

26、g）、培养如f）所述的宿主细胞获得的混合物。

27、进一步的，编码所述ntbzr7的核酸的核苷酸序列如seq id no.1所示；

28、所述vigs 靶标片段为seq id no.1所示的编码所述ntbzr7的核酸的第134bp~第514bp区段。

29、本发明中，所述植物包括烟草。

30、本发明所述ntbzr7，可调控植物中绿原酸的含量，具体的，本发明通过对ntbzr7基因的克隆和表达载体的构建与分析发现，在烟草植株中过表达该基因能显著提高叶片中ntbzr7基因表达量，说明该基因在烟草中能够有效实现过量表达，为后续功能研究奠定了表达层面的基础；进一步地通过检测发现，与正常对照组相比，转基因株系中绿原酸含量显著升高，这一结果表明ntbzr7基因的表达水平与绿原酸的积累之间存在明显的正相关关系，即ntbzr7对绿原酸的合成或积累具有正向调控作用。而绿原酸是一种广泛存在于植物中的多酚类化合物，属于植物次生代谢产物中的重要组成成分，其在植物中具有抗病防御、增强植物抗逆性以及提高品质的作用；具体的，对于增强抗病性，绿原酸能直接抑制病原菌生长，从而降低病害发生程度，减少病原菌对植物组织的侵染和破坏，帮助植物维持正常的生长发育状态；对于提高植物的品质，尤其在烟草中，绿原酸是烟叶中含量最多的多酚类物质，其含量常被作为衡量烟叶品质的重要指标，具体的，绿原酸在调制中可形成与人体感官密切相关的致香物质，这些致香物质是烟叶香气的重要来源，对改善烟叶的香气质和香气量具有积极作用，进而影响烟叶的感官质量和工业可用性，因此可以通过调节烟草中绿原酸的含量，调控烟草的香气；同时绿原酸在植物抗逆性调控中也起到十分重要的作用，尤其烟草中，绿原酸能够参与植物对干旱、盐碱、低温等逆境胁迫的响应，增强植株对不良环境的适应能力，减轻逆境条件对烟草生长的不利影响，因此也可以通过调节烟草中绿原酸的含量，影响烟草的抗逆性。综合来说，本发明为烟草种质资源改良提供了新的可利用基因资源。

31、并且本发明在ntbzr7沉默实验中，利用病毒诱导的基因沉默技术对ntbzr7进行了功能缺失研究，实验过程中，vigs实验的空白对照组出现了光漂白现象，这一现象说明vigs体系在烟草植株中能够有效发挥作用，为后续基因沉默效果的分析提供了可靠的实验基础；而ntbzr7沉默后，植株表现为“生长状态良好”，这意味着ntbzr7功能的缺失并没有干扰烟草正常的发育程序，表明该基因在烟草的常规生长发育过程中并非必需的关键调控因子，其功能缺失不会对植株的整体生长造成明显的不良影响。

32、本发明挖掘到烟草ntbzr7基因，其在烟草中过表达，可提高烟草绿原酸含量，将其沉默可降低烟草绿原酸的含量，为烟草种质资源改良提供了新的可利用基因资源。