石斑鱼SIK2蛋白及其编码基因在抗鱼类神经坏死病中的应用

本发明属于生物技术的；具体地，涉及石斑鱼sik2蛋白及其编码基因在抗鱼类神经坏死病中的应用。

背景技术：

1、石斑鱼（

epinephelus spp.）是一类重要的海水经济鱼类，在我国及东南亚沿海地区被广泛养殖，近年来养殖规模持续扩大。然而，病毒性疾病始终是制约石斑鱼养殖业可持续发展的主要瓶颈之一。其中，神经坏死病毒（nervous necrosis virus，nnv）作为一种典型的水生rna病毒，主要引起鱼类的病毒性神经坏死病（viral nervous necrosis，vnn），可感染包括石斑鱼在内的多种海水及淡水鱼类，尤其对仔鱼和幼鱼具有极高致病性。斜带石斑鱼（

epinephelus coioides）已被证实为nnv的高度易感宿主，其在养殖过程中反复暴发性发病给产业造成了严重的经济损失。

2、由于在石斑鱼等低等脊椎动物中，先天性免疫系统在抗病毒防御中起着关键作用，因此解析石斑鱼抗nnv的先天免疫机制、挖掘关键抗病毒基因，已成为当前水产病害防控领域的迫切需求。在石斑鱼类等低等脊椎动物中，先天免疫系统是抵御病原体入侵的第一道防线。先天免疫的核心环节是模式识别受体（prrs）对病原体相关分子模式（pamps）的识别，进而激活下游免疫信号级联反应。其中，视黄酸诱导基因i（rig-i）样受体（rlr）介导的信号通路在宿主抗rna病毒防御中发挥关键作用。在rlr通路中，干扰素调节因子（irfs）和核因子κb（nf-κb）作为关键转录因子，被上游prrs激活后转位入核，诱导干扰素（ifns）和促炎细胞因子的表达，从而建立抗病毒免疫应答。

3、此外，越来越多的证据表明，液-液相分离（liquid-liquid phase separation，llps）在先天免疫调控中发挥关键作用。含有内在无序区域（intrinsically disorderedregions，idrs）的蛋白质可通过llps形成生物分子凝聚体，促进模式识别受体激活和抗病毒信号复合物组装等关键免疫过程。

4、盐诱导激酶（salt-inducible kinases，siks）属于amp活化蛋白激酶（ampk）家族，包含sik1、sik2和sik3三个亚型。其中，sik2在脂肪组织中高表达，在代谢稳态调控中发挥重要作用。迄今为止，关于sik2的研究主要集中在哺乳动物领域，涉及代谢稳态、自噬和肿瘤相关信号通路等方面。在硬骨鱼中，已有研究在大黄鱼（

larimichthys crocea）中发现sik2可通过调控肝脏糖脂代谢减轻炎症反应，但sik2在病毒感染中的作用，尤其是在硬骨鱼类抗病毒免疫中的功能，尚未见报道，其潜在的抗病毒功能及分子机制仍不清楚。

5、因此，挖掘和鉴定石斑鱼中抗nnv的关键宿主调控因子，阐明其作用机制，对于开发鱼类病毒病的新型防控策略和免疫增强剂具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种斜带石斑鱼sik2蛋白、其编码基因以及含有该基因的重组载体。所述斜带石斑鱼sik2蛋白是一种病毒响应的宿主限制因子，能够通过激活tbk1相关信号和nf-κb信号协同抑制鱼类神经坏死病毒复制，且其抗病毒活性依赖于液-液相分离特性。

2、本发明的目的还在于提供所述斜带石斑鱼sik2蛋白或其编码基因或所述重组载体在抗nnv及其引起的鱼类病毒性神经坏死病中的应用。

3、本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：

4、一种斜带石斑鱼sik2蛋白，所述蛋白来源于斜带石斑鱼，命名为ecsik2，所述ecsik2编码基因的开放阅读框（orf）长度为2796 bp，编码931个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、结构预测表明，ecsik2包含一个n端丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（s_tkc，位于第21-272位氨基酸残基），以及c端的两个内在无序区域（idrs），分别命名为pl结构域（位于第391-683位氨基酸残基）和pg结构域（位于第743位氨基酸残基至c端）。

6、本发明还提供所述sik2蛋白的编码基因，下文称为ecsik2，其核苷酸序列如seqid no.2所示。

7、本发明还提供含有所述编码基因的重组载体；所述重组载体为真核表达载体。优选地，所述真核表达载体为pegfp-n3。

8、本发明通过研究发现，斜带石斑鱼sik2蛋白是一种病毒响应的宿主限制因子，能提高鱼类抗nnv能力。具体地，在鱼类细胞中过表达ecsik2质粒能够显著抑制nnv的复制，降低病毒衣壳蛋白（cp）和rna依赖的rna聚合酶（rdrp）的表达水平；反之，敲降ecsik2的表达可促进nnv的复制。

9、所述ecsik2通过以下机制提高鱼类抗nnv能力：在鱼类细胞中过表达ecsik2质粒，模式识别受体基因（mda5、znfx1）或接头基因（mavs）的转录水平没有显著性变化，但可选择性上调traf3的表达。关键信号传导因子（tbk1、irf3、irf7、nf-κb）、干扰素（ifnc、ifnh）、干扰素刺激基因（ifit1、isg15）以及促炎细胞因子（tnfα、il-1β）的mrna水平在ecsik2质粒过表达后均显著升高。与之相符的是，敲降ecsik2后，irf3、ifnc和tnfα表达均受到抑制，表明ecsik2是抗病毒免疫的正向调控因子。

10、所述ecsik2还通过以下机制提高鱼类抗nnv能力：ecsik2与tbk1、irf3、irf7和nf-κb发生物理相互作用，增强tbk1和irf3的磷酸化，同时激活nf-κb启动子和干扰素相关基因（ifnc、ifit1）的启动子活性，从而协调激活两条抗病毒信号通路：（i）ecsik2-nf-κb-促炎细胞因子轴；（ii）ecsik2-tbk1-irf3-干扰素轴。

11、具体地，所述ecsik2的c端pg结构域介导液-液相分离，ecsik2在细胞内形成液样细胞质凝聚体，该凝聚体可被3%的1,6-己二醇溶解，具有荧光漂白后快速恢复和动态融合/分裂的特征；所述pg结构域介导的相分离能力是ecsik2完全抗病毒活性所必需的，删除pg结构域会导致凝聚体形成减少和抗病毒活性显著下降。

12、本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：

13、本发明所述斜带石斑鱼sik2蛋白或其编码基因或上述重组载体在抗nnv中的应用，具体是在制备抗nnv药物和在抗nnv育种中的应用。

14、进一步地，本发明提供所述斜带石斑鱼sik2蛋白或其编码基因或所述重组载体在抗nnv引起的鱼类病毒性神经坏死病中的应用。具体是，所述斜带石斑鱼sik2蛋白或其编码基因或上述重组载体在制备抗鱼类病毒性神经坏死病药物和在抗鱼类病毒性神经坏死病育种中的应用。

15、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

16、（1）本发明首次发现斜带石斑鱼sik2蛋白ecsik2是一种病毒响应的宿主限制因子，能够显著抑制nnv在石斑鱼细胞中复制，拓展了sik2的功能框架，将其从代谢调控延伸至抗病毒宿主防御领域。

17、（2）本发明揭示了ecsik2通过协调两条抗nnv病毒信号通路发挥作用的分子机制：ecsik2与tbk1、irf3、irf7和nf-κb相互作用，增强tbk1和irf3的磷酸化，同时激活nf-κb-促炎细胞因子轴和tbk1-irf3-干扰素轴，实现炎症反应与干扰素相关抗病毒应答的协同激活。

18、（3）本发明首次发现ecsik2具有液-液相分离特性，其c端pg结构域介导凝聚体形成，且相分离能力与抗病毒活性直接相关。激酶结构域和相分离相关区域的功能偶联是ecsik2完全抗病毒活性的基础，为理解抗病毒信号的空间组织调控提供了新视角。

19、（4）本发明的ecsik2显著抑制nnv在石斑鱼细胞中复制，可开发为鱼类抗nnv药物或抗nnv基因育种靶点，有利于石斑鱼等鲈形目鱼类病毒性神经坏死病的防治，对海水鱼类养殖业的健康发展具有重要意义。