塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体及其在提高D-塔格糖转化率中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程和酶工程，更具体的说是涉及塔格糖-6-磷酸磷酸酶突变体及其应用。

背景技术：

1、塔格糖（d-tagatose）是天然存在的一种稀有单糖，是半乳糖的酮糖形式，果糖的差向异构体，分子式为c6h12o6，相对分子质量为180.16。甜味特性与蔗糖相似，而产生的热量只为蔗糖的三分之一，所以被称之为低热量甜味剂。塔格糖具有低热量值、零血糖生成指数、血糖钝化作用、无龋齿性、益生元作用和抗氧化活性等优良营养特性；并且具有改善肠道菌群、治疗ⅱ型糖尿病、降低胆固醇、预防结肠癌等生理功效，因此被作为蔗糖的代替品应用于健康饮料及酸乳、果汁等产品中；同时还被广泛应用于糖尿病专用食品、减肥食品、口香糖、谷物食品、饮料、肉制品、糖果等工业中，并在医药行业被用于咳嗽糖浆、粉剂、起泡剂、固定假牙的豁合剂及口腔消毒剂中。

2、d-塔格糖的合成方法主要有化学合成法和生物转化法。化学合成法是以果糖-6-磷酸为原料，在碱性或碱土金属的催化下，发生异构化反应，生成金属氢氧化物和d-塔格糖复合物中间体沉淀，然后用酸中和中间体，得到d-塔格糖。化学合成法生产d-塔格糖虽然是一种经济有效的方法，但是在生产过程中需要高温高压的条件，并且容易生成山梨糖、甘露糖等杂糖，不利于分离纯化。因此，为了克服这些缺点，生物转化法生产d-塔格糖得到了广泛的关注和研究。

3、单酶催化通常转化率较低，且面临底物成本高、酶活性不高或分离困难等问题，以淀粉为底物经多酶级联催化制备d-塔格糖的合成路线具有底物成本低，转化率高等特点，受到广泛关注，但其中的某个酶性能不能满足工业需求，需通过酶工程手段提升，提高关键酶的活性和稳定性对于推动使用生物制造方式制备d-塔格糖具有重要的研究意义和实际应用价值。

4、因此，提供塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体及其在提高d-塔格糖转化率中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体及其在提高d-塔格糖转化率中的应用，该突变体能够和异淀粉酶、α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖-1-磷酸变位酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、塔格糖-6-磷酸差向异构酶偶联，将底物麦芽糊精转化为d-塔格糖。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体，在seq id no.11所示氨基酸序列的基础上，存在下述突变：k151e-s206k、s206k或k151e。

4、进一步，所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体的编码基因。

5、进一步，含有所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体的编码基因的表达载体。

6、进一步，含有所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体的编码基因的重组细胞。

7、进一步，所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体在生产d-塔格糖中的应用。

8、进一步，所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体在提高d-塔格糖产量中的应用。

9、进一步，所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体在提高d-塔格糖转化率中的应用。

10、进一步，所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体在提高塔格糖6-磷酸磷酸酶酶活力中的应用。

11、所述催化反应的反应体系中还可以加入异淀粉酶或普鲁兰酶中的任意一种或两种。

12、所述催化反应的反应体系中还可以加入4-葡聚糖基转移酶中，用于提高淀粉的利用率。

13、在建立催化反应体系时，可以对菌体进行透性化处理后或相应替换这些菌体的纯酶以及它们的混合物和底物采用同时加入或先后加入的方式建立多酶催化反应体系，优选为采用同时加入的方式建立催化反应体系。

14、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体及其在提高d-塔格糖转化率中的应用，最优突变体t6pp3塔格糖的终浓度是118.7g/l，相对麦芽糊精的质量转化率为79.1%。本发明利用多酶催化路线催化制备塔格糖，具有底物利用率高、成本低、塔格糖产率高等优点，适合规模化生产塔格糖。

1.塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体，其特征在于，在seq id no.11所示氨基酸序列的基础上，存在下述突变：k151e-s206k、s206k或k151e。

2.权利要求1所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体的编码基因。

3.含有权利要求2所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体的编码基因的表达载体。

4.含有权利要求2所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体的编码基因的重组细胞。

5.权利要求1所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体在生产d-塔格糖中的应用。

6.权利要求1所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体在提高d-塔格糖产量中的应用。

7.权利要求1所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体在提高d-塔格糖转化率中的应用。

8.权利要求1所述的塔格糖6-磷酸磷酸酶突变体在提高塔格糖6-磷酸磷酸酶酶活力中的应用。