一种基于级联酶催化反应的血液中多种标志物分析试剂及其制备方法与应用

本发明属于血清分析，具体涉及一种基于级联酶催化反应的血液中多种标志物荧光分析试剂及其制备方法与应用。

背景技术：

1、对于一些代谢性疾病，如糖尿病、高血压、血脂异常等，尤其在家庭环境中，需要频繁监测相关生物标志物，合理控制饮食、生活方式，调整治疗策略。例如，血清胆固醇（chol）水平影响脑血栓和动脉硬化的发生，血清胆固醇水平每降低1%，患病风险降低约2%。尿酸（ua）监测对评估痛风患者的治疗效果和预防痛风患者复发具有重要意义。血清乳酸（la）与缺血、感染、创伤性休克等多种严重疾病有密切关系。重要的是，同时检测多种生物标志物更能满足个性化诊断的实际需求。例如，许多代谢性疾病都需要联合测定胆固醇和葡萄糖。因此，开发对于血液中多种标志物具有较高灵敏度的检测试剂具有重要的意义。

2、在过氧化物酶样活性材料的动力学性能对比中，天然辣根过氧化物酶（hrp）虽具有经典的催化活性，但其对底物的亲和力有限（对opd的k_m为7.3 mm）；zhao等人（zhao,c., xiong, c., liu, x., qiao, m., li, z., yuan, t., wang, j., qu, y., wang,x., zhou, f., xu, q., wang, s., chen, m., wang, w., li, y., yao, t., wu, y.,&li, y. (2019). unraveling the enzyme-like activity of heterogeneous singleatom catalyst.

chemical communications, 55, 2285–2288.）开发了单原子铁催化剂（fesaes），用于模拟天然含血红素酶的催化功能，实现了优异的酶样活性（对opd的k_m为0.572mm）；kulandaivel等人（kulandaivel, s., lin, c.-h.,&yeh, y.-c. (2022). the bi-metallic mof-919 (fe-cu) nanozyme capable of bifunctional enzyme-mimickingcatalytic activity.

chemical communications, 58, 569–572.）开发了双金属mof-919(fe-cu)，用于模拟氧化酶和过氧化物酶的双功能催化活性，实现了对肾上腺素宽线性范围的比色传感（对opd的k_m为1.36 mm）；horcajada等人（he, n., zhu, x., liu, f., yu,r., xue, z.,&liu, x. (2022). rational design of fes2-encapsulated covalentorganic frameworks as stable and reusable nanozyme for dual-signal detectionglutathione in cell lysates. chemical engineering journal, 445, 136543.）开发了mil-100(fe)纳米酶，用于模拟过氧化物酶活性，实现了对有机底物的催化氧化（对opd的km为1.06 mm）。相比之下，本发明所开发的nf@co-zif-l纳米酶，用于血清中胆固醇、乳酸、尿酸和葡萄糖四种代谢标志物的即时检测，凭借其对opd最低的michaelis常数（km = 0.12mm）和较高的最大反应速率（vmax = 0.829 × 10-7m·s-1），展现出优于上述对照材料及天然酶的底物亲和力；同时，结合智能手机app与人工神经网络算法对荧光图像的rgb和hsv参数进行协同分析，实现了无需大型仪器和专业操作人员的多靶标离线精准定量检测，在便捷性、检测通量和数据智能化处理方面具有显著的综合优势。

技术实现思路

1、为了解决现有方法灵敏度低以及难以实现多目标物检测的问题，本发明以胆固醇、乳酸、尿酸、葡萄糖四种物质为目标物，目标物的定量分析依赖于相应氧化酶与泡沫镍上原位合成具有过氧化物酶样活性的钴基叶状沸石咪唑酸框架（co-zif-l）。在这个过程中，氧化酶识别特定的靶分子并催化氧化反应生成h2o2。然后，具有过氧化物酶样活性的co-zif-l催化h2o2氧化邻苯二胺（opd），生成一种高荧光底物2,3-二氨基哌嗪（opdox）。在此基础上，可以将待测生物标志物转化为opdox的荧光信号。

2、本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。

3、本发明提供了一种基于级联酶催化反应的血液中多种标志物分析试剂，所述分析试剂包括试剂f以及包括试剂a、试剂b、试剂c1、试剂c2、试剂d、试剂e中的一种或几种。

4、具体地，

5、试剂a为试剂a为葡萄糖氧化酶的超纯水溶液，浓度为1.0±0.1 mg·ml-1；

6、试剂b为乳酸氧化酶的超纯水溶液，浓度为1.0±0.1 mg·ml-1；

7、试剂c1为胆固醇氧化酶的超纯水溶液，浓度为1.0±0.1 mg·ml-1；

8、试剂c2为胆固醇脂酶的超纯水溶液，浓度为1.0±0.1 mg·ml-1；

9、试剂d为尿酸酶的超纯水溶液，浓度为1.0±0.1 mg·ml-1；

10、试剂e为邻苯二胺的超纯水溶液，浓度为10.0±1.0 mm；

11、试剂f为具有类过氧化物酶活性的nf@co-zif-l纳米酶。

12、所述nf@co-zif-l纳米酶由泡沫镍与zif-l前驱体在水中合成，制备方法如下：

13、首先，用3m盐酸、乙醇、去离子水先后清洗一定面积的泡沫镍，干燥待用。然后，将1.1817-1.4443g 2-甲基咪唑(c4h6n2)和0.524-0.640g 六水硝酸钴（co(no3)2•6h2o）加入到49.0-51.0 ml去离子水中搅拌至溶解。随后，将两组分混合，搅拌30秒形成紫色溶液，将泡沫镍（nf）底物在室温下快速浸入紫色溶液中60分钟。最后，合成的nf@co-zif-l用酒精和去离子水洗涤并干燥，裁剪为1.0 cm×1.0 cm的方块备用。

14、2-甲基咪唑与六水硝酸钴的质量比为2.2±0.1 : 1.0。进一步优选为2.2：1。

15、本发明还提供了上述的一种基于级联酶催化反应的血液中多种标志物分析试剂的应用，用于快速检测血液中的多种目标物，包括但不限于血液中的胆固醇、乳酸、尿酸、葡萄糖等。

16、1、葡萄糖的检测：

17、建立标准曲线的方法如下：首先，取100 μl不同浓度的葡萄糖（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mm）与10 μl试剂a混合，在37℃下孵育30分钟。然后，在上述溶液中加入100 μl opd试剂e，790 μl磷酸盐缓冲盐水（pbs, 0.02 m, ph 7.4）。然后，将试剂f放入溶液中。最后，在室温下黑暗反应30分钟后，将上述溶液转移到石英试管中，在360 nm激发下进行荧光测量，建立标准曲线。

18、测试血液样本时，取100 μl血清并按照上述操作进行，测定荧光强度，根据标准曲线计算血清中的葡萄糖浓度。

19、2、乳酸、胆固醇和尿酸检测：先取100 μl不同浓度的乳酸、胆固醇和尿酸分别与10μl试剂b、试剂c1、试剂d在37℃下孵育30分钟。然后按照上述葡萄糖检测方法进行其他程序测定，即根据荧光信号建立标准曲线，然后测定样品荧光信号计算得到相关具体样品浓度。

20、本发明提供的一种基于级联酶催化反应的血液中多种标志物分析试剂，利用代谢生物标志物级联反应，合成一种具有过氧化物酶样活性的nf@co-zif-l，通过该物质催化的h2o2氧化opd（邻苯二胺）产生高荧光底物opdox，从而实现对目标标志物的高灵敏测定。

21、与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果如下：

22、（1）本发明的一种基于级联酶催化反应的血液中多种标志物分析试剂能够快速实现对血液中葡萄糖、乳酸、胆固醇和尿酸等多种标志物的检测（体外检测），满足了个性化诊断的实际需求。

23、（2）通过级联酶催化反应与具有过氧化物酶样活性的nf@co-zif-l的协同作用，将待测生物标志物转化为荧光信号，提高了检测的灵敏度。