一种南瓜籽粕低分子肽锌组合物及其制备方法、模拟消化吸收评价方法和应用

本发明涉及植物源矿物元素递送、体外模拟消化评价、离体肠道转运评价和功能食品配料制备，具体涉及一种南瓜籽粕低分子肽锌组合物及其制备方法、模拟消化吸收评价方法和应用。

背景技术：

1、锌是人体必需微量元素，参与酶催化、免疫调节、细胞增殖、生长发育和氧化还原稳态等过程。膳食锌的营养效应不仅取决于摄入量，还与其在胃肠道中的化学形态、溶解状态、食物基质相互作用及肠道转运能力有关。尤其在植物性食品体系中，植酸、膳食纤维、多酚和其他矿物离子容易影响锌的溶解状态，降低肠腔中可迁移锌物种的比例。

2、现有锌补充剂主要包括无机锌盐、有机酸锌盐、氨基酸锌和多肽锌配合物。无机锌盐成本较低，但在胃肠环境中容易受到ph变化和食物基质干扰。有机酸锌盐具有较好的水溶性，但其进入肠道后的保留状态和持续转运行为仍受限。食源肽含有羧基、氨基、羰基、咪唑基和巯基等潜在配位基团，可与锌离子形成肽锌结合结构，从而改变锌在消化液中的存在形态。

3、南瓜籽粕是南瓜籽制油加工后的副产物，含有较高比例的蛋白质，具有开发为植物源矿物结合肽原料的潜力。通过蛋白酶酶解，可使南瓜籽粕蛋白释放低分子肽段并暴露更多功能基团；进一步经分子量分级，可富集具有较高锌结合能力的低分子肽组分。以该类低分子肽构建肽锌组合物，有望改善锌在模拟胃肠消化过程中的保留状态和离体肠道模型中的表观转运行为。

4、现有植物源肽锌相关技术多以原料酶解、螯合率优化、结构表征和普通稳定性评价为主要内容，对肽锌组合物进入胃肠消化环境后的粒径变化、表面电荷变化、肽链水解、锌保留和离体肠道转运缺乏系统评价。仅依靠初始螯合率难以判断肽锌组合物在肠道递送中的实际潜力。因此，亟须建立一种围绕模拟胃肠消化和外翻肠囊模型的评价方法，并利用该方法筛选南瓜籽粕低分子肽锌肠道递送组合物，为植物源锌递送配料开发提供更直接的功能证据。

技术实现思路

1、本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为了解决现有植物源肽锌体系评价中重初始螯合、轻消化吸收过程的问题，本发明提供一种南瓜籽粕低分子肽锌组合物及其模拟消化吸收评价方法和应用。该方法以南瓜籽粕低分子肽锌组合物为对象，将模拟胃肠消化、锌保留率测定、胶体重组表征和外翻肠囊表观吸收评价整合为连续评价流程，从而筛选具有肠消化锌保持能力和持续锌表观转运能力的植物源肽基锌递送组合物。

2、本发明的技术解决方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种南瓜籽粕低分子肽锌组合物的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、以南瓜籽粕或脱脂南瓜籽粕为原料，制备南瓜籽粕分离蛋白；

5、s2、采用酸性蛋白酶对所述南瓜籽粕分离蛋白进行酶解，获得南瓜籽粕蛋白水解物；

6、s3、对所述南瓜籽粕蛋白水解物进行分子量分级，获得分子量小于3 kda的低分子肽组分；

7、s4、将所述分子量小于3 kda的低分子肽组分与可食用锌盐发生配位反应，获得南瓜籽粕低分子肽锌组合物。

8、优选地，s1包括以下具体步骤：将脱脂南瓜籽粕进行粉碎，加入去离子水，按料液比1:8~12混合均匀；采用0.5~1.5 mol/l naoh将体系ph调节至10.5~11.5，在室温条件下搅拌提取25~35 min，随后于3~5℃、3500~4500 r/min条件下离心15~25 min，收集上清液；采用0.5~1.5 mol/l hcl将上清液的ph调节至4~5，使蛋白沉淀析出；离心收集沉淀，用去离子水洗涤后装入分子量截留范围为6至8 kda的透析袋中，于3~5℃条件下透析66~78 h，冷冻干燥，得到南瓜籽粕分离蛋白。

9、优选地，s2包括以下具体步骤：将南瓜籽粕分离蛋白按底物浓度4~6%w/v分散于去离子水中，调节体系ph至4.6~5.0，加入酸性蛋白酶，酶添加量为7000~9000 u/g蛋白，在50~60℃条件下酶解2.5~3.5 h；酶解结束后，将体系加热进行灭酶，冷却至室温后离心，收集上清液并冷冻干燥，得到南瓜籽粕蛋白水解物。

10、优选地，s3中，采用3 kda超滤膜对所述南瓜籽粕蛋白水解物进行分子量分级，获得分子量小于3 kda的低分子肽组分；所述分子量小于3 kda的低分子肽组分的锌结合能力不低于26%；

11、优选地，s4中，所述可食用锌盐选自乙酸锌、葡萄糖酸锌、乳酸锌、氯化锌或硫酸锌中的一种或多种；所述分子量小于3 kda的低分子肽组分与可食用锌盐的质量比为1:1至1:3，配位反应的ph为5.0至7.0，配位反应的温度为45至65℃，配位反应的时间为30至120min。

12、更优选地，s4中，所述分子量小于3 kda的低分子肽组分与可食用锌盐的质量比为1:2，配位ph为6.0，配位温度为55℃，配位时间为60 min。

13、第二方面，本发明提供了一种南瓜籽粕低分子肽锌组合物，采用所述的制备方法得到。

14、优选地，所述组合物包含来自南瓜籽粕蛋白的分子量小于3 kda低分子肽和与所述低分子肽结合的锌。

15、进一步地，所述低分子肽中的羧基、氨基、羰基或酰胺基中的一种或多种参与锌结合。

16、进一步地，所述分子量小于3 kda低分子肽的锌结合能力不低于26%。

17、进一步地，所述组合物在外翻肠囊模型中60 min锌表观吸收率不低于30%。

18、进一步地，所述组合物在模拟肠消化末期锌保留率不低于40%。

19、第三方面，本发明提供了所述的南瓜籽粕低分子肽锌组合物制备肽基锌递送体系中的应用。

20、第四方面，本发明提供了所述的南瓜籽粕低分子肽锌组合物制备促锌吸收产品中的应用。

21、第五方面，本发明提供了所述的南瓜籽粕低分子肽锌组合物在制备补锌食品、固体饮料、营养粉、植物蛋白饮料、代餐食品、特殊膳食食品、保健食品或饲料添加剂中的应用。

22、第六方面，本发明提供了所述的南瓜籽粕低分子肽锌组合物在模拟消化吸收中的应用。

23、第七方面，本发明提供了一种模拟消化吸收评价方法，包括以下步骤：

24、（1）将所述的南瓜籽粕低分子肽锌组合物进行模拟胃肠消化，测定消化过程中的粒径分布、zeta电位、游离氨基氮、游离氨基酸和锌保留率；

25、（2）将模拟胃肠消化后的南瓜籽粕低分子肽锌组合物进行外翻肠囊评价，测定浆膜侧锌含量，并计算锌表观吸收率和锌表观转运速率；

26、（3）依据模拟肠消化阶段锌保留率和外翻肠囊模型中的锌表观吸收率，确定所述南瓜籽粕低分子肽锌组合物的肠道递送性能。

27、优选地，步骤（1）中，模拟胃肠消化包括模拟胃消化阶段和模拟肠消化阶段；模拟胃消化阶段采用含胃蛋白酶的模拟胃液，模拟肠消化阶段采用含胰酶和胆盐的模拟肠液；

28、进一步地，模拟胃消化阶段使用hcl和胃蛋白酶模拟胃液，hcl终浓度为0.05~0.2mol/l，胃蛋白酶终浓度为1500~3000 u/ml，模拟胃液的ph为1~2。

29、进一步地，肠消化阶段使用nahco3、胰蛋白酶和猪胆盐作为模拟肠液，nahco3终浓度为6~8g/l，胰蛋白酶终浓度为80~120 u/ml，胆盐终浓度为5~10mmol/l，模拟肠液的ph为8.0~8.5。

30、优选地，所述模拟胃肠消化时间为240 min，0~90分钟为模拟胃消化阶段，90~240min为模拟肠消化阶段

31、其中，所述模拟胃消化阶段的温度为37℃，消化时间为30至90 min；所述模拟肠消化阶段的温度为37℃，消化时间为120至240 min；

32、优选地，所述模拟胃肠消化的胃消化阶段肽锌组合物：模拟胃液的质量比为1:1，肠消化阶段肽锌组合物：模拟肠液的质量比为1:2。

33、优选地，步骤（1）中，锌保留率按下式计算：

34、锌保留率（%）＝消化后上清液中锌含量/消化体系中总锌含量×100%。

35、优选地，步骤（2）中，外翻肠囊评价采用鸡回肠外翻肠囊模型，将所述南瓜籽粕低分子肽锌组合物加入黏膜侧缓冲液，在含氧气体环境中孵育，并于15 min、30 min、45 min和60 min收集浆膜侧液体。

36、进一步地，外翻肠囊模型使用日龄40-50天的白羽鸡，体重为1500~1600 g。

37、进一步地，所使用的白羽鸡需禁食12 h，后静脉注射戊巴比妥钠麻醉剂，去除腹部羽毛及皮肤。

38、进一步地，外翻肠囊模型，需沿腹中线剖开腹腔，定位回盲瓣起始端，向前量取14cm肠段并截取12 cm 中段回肠。

39、进一步地，外翻肠囊模型需从一端注入1 ml含酚红指示剂的krebs-ringer缓冲液用于泄漏验证。

40、进一步地，翻肠囊模型壁厚需≥0.3 mm。

41、优选地，步骤（2）中，锌表观吸收率按下式计算：锌表观吸收率（%）＝浆膜侧锌含量/初始加入锌含量×100%。

42、锌表观转运速率按下式计算：锌表观转运速率＝浆膜侧锌含量变化量/培养时间/外翻肠囊有效长度。

43、优选地，所述南瓜籽粕低分子肽锌组合物在外翻肠囊模型中15 min、30 min、45min和60 min的锌表观吸收率呈持续升高趋势。

44、优选地，所述南瓜籽粕低分子肽锌组合物在模拟胃肠消化过程中发生粒径分布改变和zeta电位变化，并在模拟肠消化阶段形成可分散锌结合体系。

45、本发明至少具有以下有益效果之一：

46、1、本发明从南瓜籽粕中分离、酶解和分子量分级获得了分子量小于3 kda的低分子肽组分，并将其与可食用锌盐发生配位反应制备得到南瓜籽粕低分子肽锌组合物；经研究发现，相比分子量为3~5 kda的组分和分子量大于5 kda组分，分子量小于3 kda的低分子肽组分与可食用锌盐制备的南瓜籽粕低分子肽锌组合物具有更高的锌螯合能力，说明南瓜籽肽的锌结合能力具有明显分子量依赖性；分子量小于3 kda的低分子肽组分可能具有较高的扩散能力、较低空间位阻及羧基、氨基、羰基等潜在配位基团更充分暴露有关，这些特征有利于zn2+接近结合位点并形成稳定配位。

47、2、本发明还提供了南瓜籽粕低分子量肽锌组合物在模拟消化吸收中的应用，并提供了一种模拟消化吸收评价方法，本发明将模拟胃肠消化和外翻肠囊模型整合为肽锌组合物评价流程，可同时评价消化过程结构响应、锌保留和离体肠道表观吸收行为。并且，本发明将模拟肠消化末期锌保留率和外翻肠囊60 min锌表观吸收率作为组合物判定指标，能够避免仅依赖初始螯合率评价肽锌体系的局限。

48、3、经研究发现，相比未与分子量小于3 kda的低分子肽组分结合的可食用锌盐，本发明中制备的南瓜籽粕低分子肽锌组合物经模拟胃肠消化表现出受控肽水解和较高肠阶段锌保留能力，支持其作为肽基锌递送体系的潜在应用价值；同时，本发明所得组合物在肠消化阶段维持较高可溶性锌，并在外翻肠囊模型中表现出持续锌表观转运特征，适合开发为植物源补锌食品配料。