一种牛胚胎无创遗传检测的培养液游离DNA高效制备及SNP位点检测方法

本发明涉及牛体外胚胎生产，具体地说，涉及一种牛胚胎无创遗传检测的培养液游离dna高效制备及snp位点检测方法。

背景技术：

1、胚胎植入前遗传学检查（pgt）不仅是辅助生殖技术（art）创新发展的重要方向，还是体外胚胎质量筛选的核心技术之一，其核心原理是在不影响胚胎发育潜力的前提下，获取能够代表胚胎全部遗传信息的材料，通过检测明确胚胎遗传学特征，为优质胚胎移植提供依据（zhang et al., 2016；ana del et al., 2024）。pgt在畜牧业中同样具有重要应用价值，可用于引入优良性状、增强畜群遗传多样性、提高畜群整体质量，尤其对于牛这类妊娠期长的单胎动物，提前筛选优良遗传性能胚胎进行移植，能够有效缩短世代间隔、增加遗传增益、提升繁殖效率（janine et al., 2023）。但目前常用的pgt活检方式（极体活检、卵裂球活检、滋养层细胞活检）均为有创操作，存在机械损伤影响胚胎发育、操作要求高、检测效率低及检测结果易受嵌合现象干扰等问题，限制了其在辅助生殖及畜牧胚胎生产中的广泛应用（aoyama et al., 2020；palini et al., 2013）。

2、在畜牧业中，ni-pgt 可用于筛选具有优良遗传性状的胚胎，缩短育种周期、加快育种进程（alves et al., 2022）。无创胚胎植入前遗传学检测（ni-pgt）是规避有创pgt缺陷的重要发展方向，其核心是通过检测囊胚液或胚胎培养基中的游离dna（cf-dna）获取胚胎遗传信息，无需损伤胚胎结构，可有效维持胚胎活力（amin et al., 2022）。cf-dna是细胞通过坏死、凋亡等生物学过程释放到微环境中的短片段双链dna，可作为反映细胞核酸特征的生物标志物，也是ni-pgt的核心检测对象（amin et al., 2022）。单滴培养能够满足对胚胎个体评估的需求（yang et al., 2023），可有效确保后续检测样本（胚胎培养基中游离dna）的来源明确，避免交叉污染，成为适配无创pgt的关键培养模式（viotti, 2022）。然而，单滴培养也存在明显短板，其缺失了群体培养中胚胎间的旁分泌/自分泌相互作用，即群体效应，易导致胚胎发育效率下降（travaglione et al., 2024），优化单滴培养条件、提升胚胎发育质量，成为当前该领域的研究重点（layek et al., 2024）。

3、目前已有多种技术可实现snp检测，涵盖单链构象多态性（sscp）、限制性酶切片段长度多态性、dna测序及基因芯片法等（kim et al., 2016；mekonnen et al., 2024），该技术凭借高分辨率和完整的数据输出能力，在个体诊断治疗、群体遗传学等领域发挥重要作用，尤其在畜牧业中可用于优良畜种的筛选，为良种繁育提供技术支撑（gkioka et al.,2023；maceda et al., 2021）。全基因组扩增（wga）技术作为snp检测的重要辅助手段，可对样本全基因组序列进行非选择性均匀扩增，有效提升后续检测所需遗传数据的数量与质量，目前常用的wga技术包括多重置换扩增（mda）、多重退火基于环的扩增循环（malbac）等（glotov et al., 2024；huang et al., 2024）。

4、综上，优化单滴培养条件、提升 cf-dna 检出效率及完善 snp 检测技术体系，是推动 ni-pgt 在畜牧业应用、实现良种快速扩繁的关键。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种牛胚胎无创遗传检测的培养液游离dna高效制备及snp位点检测方法。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种牛胚胎无创遗传检测的培养液游离dna高效制备及snp位点检测方法，包括以下步骤：

3、（1）体外受精获得牛胚胎后，在受精后第5天，将发育至桑葚胚阶段的单个胚胎转移至20 μl体积的胚胎培养液滴中进行单滴培养，培养至受精后第8天；其中，受精后第0-4天，胚胎为群体培养，100 μl单滴培养液培养约20个胚胎；群体培养的条件为：恒温38.0℃~38.5℃，4.5%~5.0% co2（优选恒温38.5℃，5% co2）；

4、（2）收集步骤（1）中含有单个胚胎的培养液，所述培养液中包含胚胎释放的游离dna；

5、（3）对步骤（2）收集的培养液中的游离dna进行全基因组扩增；

6、（4）对步骤（3）扩增后的产物进行snp位点检测。

7、进一步地，步骤（1）中，将所述桑葚胚培养至扩张囊胚阶段。

8、进一步地，步骤（1）中，所述单滴培养的培养条件为38.0℃~38.5℃，4.5%~5.0%co2（优选38.5℃、5% co2）。

9、进一步地，在步骤（2）之前，即在收集培养液之前，还包括对胚胎发育质量进行评估的步骤；

10、所述评估指标包括囊胚率、囊胚细胞总数及细胞凋亡率。

11、进一步地，步骤（3）中所述全基因组扩增采用多重置换扩增法（multipledisplacement amplification，mda）。

12、进一步地，采用全基因组扩增试剂盒进行扩增，所述试剂盒为亿康chromlongtm单细胞全基因组扩增试剂盒或华智细胞培养液扩增试剂盒；优选华智细胞培养液扩增试剂盒。

13、进一步地，步骤（3）进行全基因组扩增后，还包括对扩增产物进行质量检测的步骤；

14、优选地，所述质量检测包括琼脂糖凝胶电泳检测；

15、更优选地，通过琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物在100-1000 bp范围内呈现弥散条带。

16、进一步地，步骤（4）中所述snp位点检测采用snp芯片检测或测序方法进行。

17、进一步地，步骤（4）中所述snp位点检测用于牛胚胎的优良遗传性状筛选或性别鉴定。

18、第二方面，本发明提供所述方法在牛胚胎无创遗传检测中的应用；

19、所述应用为非疾病诊断和治疗目的。

20、进一步地，所述无创遗传检测是用于评估牛胚胎发育潜能、筛选优良遗传性状或进行性别鉴定。

21、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

22、本发明以牛体外胚胎为研究对象，系统探究单滴培养起始时间、培养体积对胚胎发育效率、囊胚细胞数、凋亡水平及代谢特征的影响，并优化胚胎培养基 cf-dna 的全基因组扩增与 snp 检测方案。结果表明，单滴培养组囊胚率显著低于同期群体培养组，而自胚胎培养第五天（d5）起始，采用 20 μl 培养体积培养至第八天（d8）的胚胎囊胚率（40.06 ±6.82）与细胞总数（119.20 ± 21.86）显著优于其他单滴培养条件。综上，d5 起始、20 μl单滴培养至 d8 可显著改善牛胚胎发育质量，胚胎发育阶段与质量直接影响培养基 cf-dna 的 snp 检出效率，检出效率最高可达到71.62％，本发明为牛无创胚胎遗传检测技术体系的建立提供了实验依据与技术支撑。