来源于粗糙脉孢菌的seb-1基因在蛋白分泌能力中的应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及来源于粗糙脉孢菌的seb-1基因在蛋白分泌能力中的应用。

背景技术：

1、丝状真菌粗糙脉孢菌（neurospora crassa）作为模式微生物，具有遗传操作简单、生长速率快、纤维素酶系完备以及强大的蛋白分泌能力等优点，是生产工业酶制剂的潜在宿主菌株。现有研究表明，丝状真菌的蛋白分泌主要发生在菌丝体的顶端区域。菌丝体顶端数量的增加（即菌丝分支增多）通常有利于提高蛋白分泌总量。因此，通过基因工程手段限制菌丝极性生长、增加分支结构，是改良菌株蛋白分泌能力的常用策略。然而，粗糙脉孢菌在常规培养条件下菌丝体过长，且其纤维素酶的高效表达通常依赖不溶性纤维素底物进行诱导，这一特性限制了其在液体深层发酵等工业生产工艺中的应用。因此，构建一株能够在可溶性底物存在下高效分泌纤维素酶的粗糙脉孢菌菌株，对于推动其工业化应用具有重要意义。

2、目前，通过调控特定基因表达来优化丝状真菌菌丝形态、提升蛋白分泌能力已有报道。例如，在里氏木霉（trichoderma reesei）中，drs2、vps13、gul-1等基因的缺失可改变菌丝分支结构并提高纤维素酶产量。

3、在粗糙脉孢菌（neurospora crassa）中，现有技术已鉴定出pla-7基因可靶向调控菌丝形态，其缺失导致菌丝变短、分支增加，且通过与转录因子clr-2共表达，可在可溶性底物（蔗糖）条件下显著提高胞外蛋白分泌量，发酵168h后重组菌株蛋白分泌量达到0.7 mg/ml。胁迫响应相关基因seb-1在粗糙脉孢菌菌丝形态和蛋白分泌调控中的作用尚未见任何报道。关于该基因缺失如何影响菌株的蛋白分泌能力，尤其是能否通过与其他调控因子（如转录因子clr-2）协同作用，实现在可溶性底物条件下高效分泌纤维素酶，目前尚无研究报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的主要问题是如何提高粗糙脉孢菌的蛋白分泌能力。

2、为了解决上述问题，本发明提供了一种通过调控胁迫响应蛋白编码基因seb-1表达来优化粗糙脉孢菌菌丝形态、提升蛋白分泌能力的方法。

3、本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量或调控所述蛋白质的编码基因的表达的物质在下述任一种中的应用：

4、1）调控粗糙脉孢菌蛋白分泌能力中的应用；

5、2）制备调控粗糙脉孢菌蛋白分泌能力的产品中的应用；

6、3）调控粗糙脉孢菌菌丝形态中的应用；

7、4）制备调控粗糙脉孢菌菌丝形态的产品中的应用；

8、所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：

9、a1）氨基酸序列为seq id no:2的蛋白质；

10、a2）将seq id no:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；或与a1）或a2）所限定的氨基酸序列具有80%以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

11、a3）在a1）或a2)所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。

12、seq id no:2的氨基酸序列为如下： medimaqpfifyesdasperqqrqhifnpfpyqmnmlpvvppvpstpiysrrnsgclqspmqhkpflnldsitsmpvpqvltpmaspqpisharpaiklqtemgdycgmppsppltrsnsaassprscdllqtpcnpmvsgmdglevkpaghemkpysppltpvylpdqariqvpmlpsndlslntptptasglltptptyttllspaasplvqpasifpvpvdgvcdpreltvgtvnstlapeyfptiyspdeedrdyfsqgiapqrlatpfdysfnpqltaglpvfdilsvltdidsedespftsgscslvesspsvssrsrsssgaasldqsslfcdeledmhdvesveddccsdsearpskrarharkstmdvaadnqtastekqapasehtqqaasaeaesnntesnattessveageqastplpvptnrrgrkqsltedpsktfkcdicnrrfrrqehlkrhhrslhtqdkpfecgecgkkfsrsdnlsqharthgsgslvmdlindpelmgmhhpgfihhpmmgpaltsedchtfgkvlfqvasevpgsgsdssddsdsnkkkrrrge。

13、本文中，所述调控可为上调或增强或提高。

14、本文中，调控所述蛋白质seb-1的编码基因的表达也可为抑制或降低或下调所述编码基因表达。抑制或降低或下调所述编码基因表达可通过基因敲除或基因沉默实现。

15、上述应用中，所述物质可为下述任一种：

16、e1）抑制或降低或沉默前文所述蛋白质seb-1编码基因表达的核酸分子；

17、e2）含有e1）所述核酸分子的表达盒；

18、e3）含有e1）所述核酸分子的重组载体、或含有e2）所述表达盒的重组载体；

19、e4）含有e1）所述核酸分子的重组微生物、或含有e2）所述表达盒的重组微生物、或含有e3）所述重组载体的重组微生物。

20、进一步地，c1）所述核酸分子为如下任一所示的dna分子：

21、d1）核苷酸序列是seq id no:1所示的dna分子；

22、d2）编码序列是seq id no:3所示的dna分子；

23、d3）与d1）或d2）限定的核苷酸序列具有90%或90%以上同一性，且编码前文所述蛋白质seb-1的dna分子；

24、d4）在严格条件下与d1）-d3）限定的核苷酸序列杂交，且编码前文所述蛋白质seb-1的dna分子。

25、本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

26、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）、ti质粒或病毒载体。具体可为载体pδseb-1::hph。

27、可选地，e3）重组载体可为重组载体pδseb-1::hph。

28、重组载体pδseb-1::hph的结构描述如下:是在出发载体pbluescript ii sk（+）的5’-gggagaccggcagcggccgc-3’和5-ggcccctcgcagtgctccaa-3’片段之间依次插入序列为seq id no:7，seq id no:8和seq id no:9的dna片段，保持出发载体pbluescript ii sk（+）其他序列不变得到的重组载体。

29、本发明还提供了一种降低粗糙脉孢菌蛋白分泌能力的方法，所述方法为敲除前文所述蛋白质seb-1的编码基因，来降低粗糙脉孢菌蛋白分泌能力。同时提供了一种降低粗糙脉孢菌蛋白分泌能力的方法，所述方法为敲除前文所述蛋白的编码基因，来降低粗糙脉孢菌蛋白分泌能力。

30、前文所述的蛋白质seb-1在增强clr-2蛋白调控粗糙脉孢菌蛋白分泌中的应用也属于本发明要求保护的范围；所述clr-2蛋白的氨基酸序列为seq id no:4，其编码基因的核苷酸序列为seq id no:5，编码序列是seq id no:6所示的dna分子。

31、本发明还提供了一种提高粗糙脉孢菌蛋白分泌能力的方法，包括敲除受体粗糙脉孢菌中前文所述蛋白质seb-1的编码基因，得到蛋白分泌能力提高的粗糙脉孢菌，所述蛋白分泌能力提高的粗糙脉孢菌的蛋白分泌能力高于所述受体粗糙脉孢菌；

32、在具体的实施例中，所述受体粗糙脉孢菌可为过表达clr-2蛋白编码基因的重组粗糙脉孢菌。

33、本文中，所述蛋白分泌能力为纤维素酶分泌能力。

34、本发明还提供了一种提高粗糙脉孢菌在可溶性底物条件下的纤维素酶产量的方法，包含如下步骤：

35、1）构建前文所述的蛋白质seb-1编码基因缺失的重组粗糙脉孢菌；

36、2)将步骤1）所述的重组粗糙脉孢菌与clr-2蛋白过表达重组菌株进行杂交，得到前文所述的蛋白质seb-1缺失且clr-2蛋白过表达的目的菌株；所述clr-2蛋白的氨基酸序列为seq id no:4；

37、3）以蔗糖为底物，发酵培养步骤2）获得的目的菌株，使发酵上清液中纤维素酶产量提高。

38、所述可溶性底物可为蔗糖。

39、上述步骤2）得到的目的菌株也属于本发明要求保护的范围。

40、上述步骤2）得到的目的菌株在提高纤维素酶产量中的应用也属于本发明要求保护的范围。

41、本发明利用seb-1缺失与转录因子clr-2过表达的协同效应，构建在可溶性底物下高效分泌纤维素酶的重组菌株，为粗糙脉孢菌的工业化应用提供新的技术方案。

42、相较于现有技术，本发明的有益效果如下：

43、1）本发明首次揭示胁迫响应相关基因seb-1在粗糙脉孢菌蛋白分泌中的调控功能。seb-1缺失可导致菌丝变短、分支增加，同时该基因缺失导致纤维素酶分泌能力发生缺陷，表明seb-1通过独立途径参与分泌调控。

44、2）本发明首次发现δseb-1突变株与过表达转录因子clr-2存在协同效应。通过将δseb-1与wt::mclr-2杂交，构建的重组菌株δseb-1::mclr-2在可溶性底物（蔗糖）条件下实现纤维素酶的高效分泌，逆转了单敲除菌株的分泌缺陷。

45、3)本发明解决了粗糙脉孢菌因菌丝过长、依赖不溶性纤维素底物诱导而难以工业化应用的技术难题，为粗糙脉孢菌在生物炼制、食品加工及可再生材料生产等领域的应用提供了新的技术方案。