高产三萜及甾醇的灵芝菌株YW-1号及其鉴定方法、栽培方法与分子标记引物组及用途与流程

本发明属于食药用菌和分子生物学，具体涉及一株高产三萜及甾醇的灵芝菌株yw-1号及其鉴定方法、栽培方法与分子标记引物组及用途。

背景技术：

1、灵芝作为我国重要的药食同源药用真菌，药用历史悠久，健康功效广泛，在功能食品、保健食品、化妆品及医药等领域展现出巨大的产业化开发应用价值。近年来，随着“健康中国”战略推进和大健康产业的蓬勃发展，市场对灵芝类产品的需求持续增长，对原料品质及功能活性成分的要求也日趋提高，优质本土品种的培育与精准鉴定已成为产业升级的核心驱动力。然而，目前国内主栽品种仍以韩芝系列为主，这种种源结构单一的局面严重制约了产业的高质量发展。同时，现有rflp（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）、rapd（random amplified polymorphic dna，随机扩增多态性dna）、ssr（simple sequence repeat，简单序列重复）等分子标记技术在准确性、稳定性及操作便捷性上存在局限，难以满足工厂化栽培对菌种快速精准鉴定的需求，因此亟需选育优质本土灵芝品种并开发其简便、准确、高效的新型特异性分子标记鉴定方法。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一株高产三萜及甾醇的灵芝菌株yw-1号及其鉴定方法、栽培方法与分子标记引物组及用途，以解决现有技术中优质本土灵芝品种匮乏，以及缺乏针对所述菌株的特异性分子标记鉴定手段，导致其品种真实性鉴别困难、易与近似菌株混淆的问题。

2、为达到上述目的，本发明的第一方面提供了：

3、一种高产三萜及甾醇的灵芝菌株，所述灵芝菌株为灵芝（ganoderma lucidum）yw-1号，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：67757。

4、优选的，所述灵芝（ganoderma lucidum）yw-1号的its序列如seq id no.9所示。

5、本发明的第二方面提供：

6、一种用于检测或鉴定所述高产三萜及甾醇的灵芝菌株yw-1号的indel分子标记引物组，所述引物组包括以下任意一对或一对以上的组合：

7、（1）由seq id no. 1所示的正向引物和seq id no. 2所示的反向引物组成的引物对1；

8、（2）由seq id no. 3所示的正向引物和seq id no. 4所示的反向引物组成的引物对2；

9、（3）由seq id no. 5所示的正向引物和seq id no. 6所示的反向引物组成的引物对3。

10、本发明的第三方面提供：

11、一种检测或鉴定所述高产三萜及甾醇的灵芝菌株yw-1号的方法，包括以下步骤：

12、提取待测样品的dna，以所述的indel分子标记引物组中的引物对为pcr引物建立pcr扩增体系并进行扩增；当引物对1、引物对2或引物对3中任意一对或多对的扩增结果为阳性时，判定待测样品为灵芝菌株yw-1号。

13、优选的，所述pcr扩增的反应体系按体积计包括：，dna模板2 μl，正向引物2 μl，反向引物2 μl，；其中dna模板浓度为50 ng/μl，正向引物和反向引物的浓度均为10 μmol/l。

14、优选的，所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 sec，58℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，循环32次；最后72℃延伸10 min。

15、本发明的第四方面提供：

16、一种所述高产三萜及甾醇的灵芝菌株yw-1号的栽培方法，包括以下步骤：

17、（1）将灵芝yw-1号母种接种于原种培养基中培养，得到原种；

18、（2）将原种接种于栽培培养基中培养，待菌丝满袋后开袋出芝，进行栽培管理，获得子实体。

19、优选的，所述原种培养基按质量分数计包括：75～80%高粱、15～25%小米和1～2%碳酸钙；

20、所述栽培培养基按质量分数计包括：55～60%木屑、30～35%棉籽壳、10～15%麸皮和1～2%碳酸钙。

21、优选的，所述原种培养基按质量分数计包括：78%高粱、20%小米和2%碳酸钙；

22、所述栽培培养基按质量分数计包括：58%木屑、31%棉籽壳、10%麸皮和1%碳酸钙。

23、优选的，所述步骤（2）中所述栽培管理的条件为：温度25～28℃，湿度85～95%，二氧化碳浓度800～1500 ppm，光照强度600～800 lx，光照时长8小时/天。

24、本发明的第五方面提供：

25、所述的indel分子标记引物组在所述的高产三萜及甾醇的灵芝yw-1号菌种真实性鉴定或品种权保护中的用途。

26、本发明的第六方面提供：

27、所述高产三萜及甾醇的灵芝菌株yw-1号在制备功能食品、保健食品、化妆品或药品中的应用。

28、本发明具有如下有益效果：

29、1、本发明提供了一种具有生长性状稳定、产量高、三萜及甾醇含量突出等多方面优良性状的灵芝菌株yw-1号，并提供了其栽培方法。yw-1号在广州地区工厂化栽培时具备高产、优质的特性，为南方地区提供新的灵芝栽培品种，适用于灵芝高附加值产品的开发，具有重要价值和意义。

30、2、本发明利用yw-1号、韩芝和沪农1号的全基因组重测序数据筛选差异indel位点并设计特异性引物，获得yw-1号的特异性分子标记，适用于yw-1号的真实性鉴定，准确性高、结果稳定可靠。

31、3、本发明基于pcr扩增反应，利用indel分子标记，能快速精确完成yw-1号的真实性鉴定，方法快速便捷、检测成本低，克服了现有rflp、rapd、ssr等标记技术的缺陷，为yw-1号的菌种质控和品种权保护提供了更优的技术选择。

1.一种高产三萜及甾醇的灵芝菌株，其特征在于，所述灵芝菌株为灵芝（ganodermalucidum）yw-1号，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：67757。

2.根据权利要求1所述的高产三萜及甾醇的灵芝菌株，其特征在于，所述灵芝（ganoderma lucidum）yw-1号的its序列如seq id no.9所示。

3.一种用于检测或鉴定权利要求1或2所述高产三萜及甾醇的灵芝菌株的indel分子标记引物组，其特征在于，所述引物组包括以下任意一对或一对以上的组合：

4.一种检测或鉴定权利要求1或2所述高产三萜及甾醇的灵芝菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系按体积计包括：，dna模板2 μl，正向引物2 μl，反向引物2 μl，；其中dna模板浓度为50 ng/μl，正向引物和反向引物的浓度均为10 μmol/l；

6.一种权利要求1或2所述高产三萜及甾醇的灵芝菌株的栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的栽培方法，其特征在于，所述原种培养基按质量分数计包括：75～80%高粱、15～25%小米和1～2%碳酸钙；

8.根据权利要求7所述的栽培方法，其特征在于，所述原种培养基按质量分数计包括：78%高粱、20%小米和2%碳酸钙；

9.根据权利要求6所述的栽培方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述栽培管理的条件为：温度25～28℃，湿度85～95%，二氧化碳浓度800～1500 ppm，光照强度600～800 lx，光照时长8小时/天。

10.根据权利要求3所述的indel分子标记引物组在权利要求1或2所述的灵芝yw-1号菌种真实性鉴定或品种权保护中的用途。