一种基于T7表达系统的FLS芽孢表面展示系统及其应用

本发明涉及生物，尤其是指一种基于t7表达系统的fls芽孢表面展示系统及其应用。

背景技术：

1、微生物表面展示技术（microbial surface display technology）作为一种定向锚定技术，通过功能蛋白与天然表面蛋白的特异性相互作用实现功能蛋白在微生物表面的定位和暴露，从而有效增加目标蛋白的可及性。其中基于枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）的细菌芽孢表面展示系统（bacterial spore surface display systems，bssds）通过利用芽孢衣壳蛋白等为锚定元件，在诱导芽孢形成的过程中将融合的靶蛋白组装至芽孢外壳；随着母细胞裂解及成熟芽孢释放，融合的靶蛋白便会稳定呈现于芽孢表面。

2、尽管基于芽孢的表面展示系统展现出独特的应用潜力，但在实际应用中仍存在诸多技术瓶颈，主要为锚定蛋白稳定性差和功能蛋白表达效率低两个方面。关于锚定蛋白稳定性问题，首先是锚定蛋白的自身不稳定特性直接影响功能蛋白的有效锚定。尽管芽孢外壳对极端环境的耐受性可以提高靶蛋白的功能稳定性，但在芽孢形成阶段，环境的急剧改变可能导致锚定蛋白发生错误折叠，致使功能蛋白无法被正确组装在芽孢外壳上。此外，部分锚定蛋白可能会被芽孢分泌的蛋白酶特异性水解，导致被锚定的蛋白也被水解或者无法实现锚定过程。针对这一问题，需要基于芽孢外壳的保护特性选取合适的锚定蛋白、开发蛋白酶缺陷型生产菌株以及挖掘抗蛋白酶水解的锚定元件等提高表面展示蛋白的稳定性。针对功能蛋白表达水平受限问题，一个关键挑战是难以在维持芽孢完整性的前提下，实现功能蛋白的高效表达。其核心在于开发具有适宜转录强度并能在芽孢形成特定阶段开启外源基因表达的启动子。尽管iptg诱导型启动子已应用于α-淀粉酶表面展示效果优化，但受限于启动子泄漏表达引发的细胞毒性。因此，开发更加严谨的诱导表达系统以平衡芽孢形成完整性和功能蛋白高效表达关系是必要的。除此以外，由于目前芽孢展示系统催化剂的主要生产方式是在dsm培养基中通过饥饿法产孢，该方法存在产孢周期长，产孢效率低，产孢效果波动性大等问题。

技术实现思路

1、为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中的微生物表面展示技术中锚定蛋白稳定性差和功能蛋白表达效率低的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于t7表达系统的fls芽孢表面展示系统及其应用，本发明构建了基于t7 rna聚合酶的芽孢表面展示系统，将t7 rana聚合酶整合至枯草芽孢杆菌g600基因组中，得到工具菌株bsg600-t7l，该菌株可以有效减少蛋白酶对外源蛋白的降解。随后选择cotb、cotc、cote、cotg、cotx和coty等6种衣壳蛋白为锚定元件，分别构建含有报告蛋白的融合表达框，并将融合框插入至高拷贝载体（pstop-t7ls）、中拷贝载体（padk-t7ls）、低拷贝载体（pht-t7ls）和单拷贝基因组整合表达系统，筛选能显著提高目的基因表达的芽孢表面展示系统。除此以外，为了提升芽孢催化剂制备效率，本发明还利用脱水四环素诱导启动子ptet表达kina基因及其变体kina-q-pas-a，促使芽孢杆菌产孢，构建了人工诱导的产孢系统。将该系统用于川芎嗪及其前体乙偶姻的生产，能显著提高乙偶姻和川穹嗪的产量。

3、本发明的第一个目的是提供了一种基于t7表达系统的fls芽孢表面展示系统，所述fls芽孢表面展示系统包括驱动模块和表达模块：

4、所述驱动模块包括含有laci阻遏蛋白的第一表达框和含有laco操纵子和t7 rna聚合酶的第二表达框；

5、所述目的基因表达模块包括含有连接设置的锚定蛋白与目的蛋白的融合蛋白表达框，所述融合蛋白表达框由t7启动子驱动表达；

6、其中，所述第二表达框位于padk质粒、pht质粒或整合至宿主菌基因组中。

7、进一步地，所述锚定蛋白和目的蛋白通过连接子连接。

8、进一步地，所述t7启动子和融合蛋白表达框之间含有laco操纵子。

9、进一步地，所述锚定蛋白选自cotb、cotc、cote、cotg、cotx和coty中的一种或多种。

10、进一步，所述laci阻遏蛋白的氨基酸序列如seq id no.12所示；

11、所述laco操纵子的氨基酸序列如seq id no.13所示；

12、所述t7 rna聚合酶的氨基酸序列如seq id no.14所示；

13、所述t7启动子的氨基酸序列如seq id no.15所示。

14、进一步地，所述fls芽孢表面展示系统还包括诱导模块，所述诱导模块包括氨基酸序列如seq id no.8或9所示的组氨酸激酶，所述诱导模块由启动子ptet启动表达。

15、进一步地，所述启动子ptet的氨基酸序列如seq id no.16所示。

16、本发明的第二个目的是提供了一种含有上述fls芽孢表面展示系统的重组菌。

17、本发明的第三个目的是提供了一种上述重组菌在制备乙偶姻和川穹嗪中的应用，所述目的蛋白为甲醛裂合酶编码基因，所述锚定蛋白位于甲醛裂合酶上游（即锚定蛋白-连接子-甲醛裂解酶），且所述表达模块为单拷贝。

18、本发明的第四个目的是提供了一种川芎嗪和乙偶姻的生产方法，将所述的重组菌接种于培养基中发酵培养，并添加含有异丙基-β-d-硫代半乳糖苷的诱导剂诱导表达；

19、其中所述重组菌中，目的蛋白为甲醛裂合酶，所述锚定蛋白位于甲醛裂合酶上游，且所述表达模块为单拷贝。

20、进一步地，所述诱导剂中还包括焦磷酸硫胺素。

21、进一步地，所述诱导剂中还包括脱水四环素。

22、进一步地，所述培养基中含有0.5-2.5 mol/l的乙醛，所述发酵培养的温度为20-60℃。

23、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下有益效果：

24、本发明提供了一种将t7表达系统与芽孢表面展示系统相结合的技术方案。通过将t7表达系统与芽孢表面展示系统结合，在避免泄露表达对芽孢形成产生毒副作用的基础上解决功能蛋白表达效率低的问题，从而实现功能蛋白在芽孢表面的高效锚定和稳定表达，为芽孢表面展示系统的工业化应用提供创新性技术方案。针对生物-化学偶联法生产川芎嗪存在酶催化剂稳定性差，无法重复利用等问题，本发明通过上述芽孢表面展示系统，将fls展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，实现了川芎嗪的生物-化学法合成并进一步验证了该系统的可行性。除此以外，针对dsm培养基中利用饥饿法诱导产孢存在耗时长、产孢效率低等问题，为提高枯草芽孢杆菌的产孢效率，本发明还构建了脱水四环素诱导表达的人工诱导产孢系统，进一步优化了产孢时间与诱导剂浓度，实现芽孢催化剂的高效制备。

1.一种基于t7表达系统的fls芽孢表面展示系统，其特征在于，所述fls芽孢表面展示系统包括驱动模块和表达模块；

2.根据权利要求1所述的fls芽孢表面展示系统，其特征在于，所述t7启动子和融合蛋白表达框之间含有laco操纵子。

3.根据权利要求1所述的fls芽孢表面展示系统，其特征在于，所述锚定蛋白选自cotb、cotc、cote、cotg、cotx和coty中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的fls芽孢表面展示系统，其特征在于，所述芽孢表面展示系统还包括诱导模块，所述诱导模块包括氨基酸序列如seq id no.8或9所示的组氨酸激酶，所述诱导模块由启动子ptet启动表达。

5.含有权利要求1-4任一项所述的fls芽孢表面展示系统的重组菌。

6.权利要求5所述的重组菌在制备乙偶姻和川芎嗪中的应用，其特征在于，所述目的蛋白为甲醛裂合酶，所述锚定蛋白位于甲醛裂合酶上游，且所述表达模块为单拷贝。

7.一种川芎嗪和乙偶姻的生产方法，其特征在于，将权利要求5所述的重组菌接种于培养基中发酵培养，并添加含有异丙基-β-d-硫代半乳糖苷的诱导剂诱导表达；

8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述诱导剂中还包括脱水四环素。

9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述诱导剂中还包括焦磷酸硫胺素。

10.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述培养基中含有0.5-2.5 mol/l的乙醛，所述发酵培养的温度为20-60℃。