一种基于CRISPR技术检测安第斯病毒的方法与流程

本发明属于核酸检测领域，具体地涉及一种基于crispr技术检测安第斯病毒的方法。

背景技术：

1、安第斯病毒（andes virus，andv）属于布尼亚病毒目（bunyavirales）汉坦病毒科（hantaviridae）正汉坦病毒属（orthohantavirus），是一种有包膜、负链单股rna病毒，基因组由s、m、l三个节段组成，为南美洲（主要分布于阿根廷、智利）汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome，hps，亦称汉坦病毒心肺综合征hcps）的主要病原。该病毒的自然宿主为长尾侏鼠（oligoryzomys longicaudatus）等南美洲仓鼠亚科啮齿动物，人群主要通过吸入被感染鼠类唾液、尿液或粪便污染的气溶胶而感染，亦可经食物链、叮咬及密切接触传播。安第斯病毒是目前已知唯一被证实可在人际间发生有限传播的汉坦病毒，其传播多见于密切接触者、照护者及封闭拥挤环境，且被认为主要发生在症状期，这一特性显著区别于其他汉坦病毒，也给聚集性疫情的防控带来特殊挑战。hps起病急骤，常在数日内由流感样前驱期迅速进展为急性呼吸窘迫与循环休克，缺乏特异性抗病毒药物与获批疫苗，整体病死率高达20%至40%，部分毒株或暴发情境下可达50%，因此早期诊断和及时重症支持是改善预后的关键。然而hps早期临床表现与普通呼吸道感染高度相似，临床极易误诊，实验室确诊依赖急性期血清或全血中病毒核酸的分子检测与特异性igm/igg抗体检测，常用方法包括实时逆转录聚合酶链式反应（rt-qpcr）、酶联免疫吸附试验（elisa）及免疫荧光抗体试验，并以基因测序进行毒株鉴定与传播链追溯。上述方法多需在具备生物安全条件的中心实验室完成，样本外送与出结果周期常以天计，难以满足口岸、邮轮、野外作业等封闭或移动场景下的现场快速筛查与即时隔离决策需求。由此可见，开发一种快速、灵敏、可在资源有限或移动环境下现场开展的安第斯病毒检测技术，对提升新发突发传染病早期发现能力、支撑口岸与封闭空间的公共卫生防控具有重要现实意义。

2、本发明提供了一种检测安第斯病毒的方法，该方法是基于rpa-crispr技术，提供的一种特异性高、检测灵敏度高的检测方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种检测安第斯病毒的方法。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3、一方面，本发明提供了一种用于检测安第斯病毒的方法，所述方法包括如下步骤：

4、s1、扩增待测样品得到扩增产物；

5、扩增待测样本为利用rpa扩增引物组对待测样本进行扩增，所述rpa扩增引物组序列如seq id no.8和seq id no.12所示；

6、s2、将扩增产物与cas蛋白、sgrna和单链核酸检测器接触，检测由cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测安第斯病毒，所述sgrna包括与cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于安第斯病毒的核酸，所述sgrna中与靶核酸杂交的靶向区序列如seq id no.2所示。

7、在一个实施方式中，所述方法为rpa-crispr检测方法。

8、在一个实施方式中，所述靶核酸为安第斯病毒基因。

9、在一个实施方式中，所述靶核酸为nc_003466.1。

10、在一个实施方式中，所述rpa扩增引物组序列如seq id no.5-12任一所示。优选的，所述rpa扩增引物组序列如seq id no.8和seq id no.12所示。

11、本发明中，所述与crispr/cas效应蛋白（cas蛋白）结合的区域又称为骨架区，该区域与cas蛋白相互作用，从而结合cas蛋白。

12、在一个实施方式中，所述grna自5’端至3’端依次包括与cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的靶向区。

13、在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的靶向区序列包含seq id no.1-3任一所示的序列；优选的，所述与靶核酸杂交的靶向区序列如seq id no. 2所示。

14、在一个实施方式中，所述与cas蛋白结合的区域如seq id no.4所示。

15、在一个实施方式中，所述cas蛋白选自v型cas蛋白，例如，cas12、cas14家族蛋白或其突变体。

16、在一个实施方式中，所述cas蛋白为cas12b。优选的，所述cas蛋白为野生型cas12b。优选的，所述cas蛋白为突变的cas12b蛋白。

17、优选的，所述cas蛋白的氨基酸序列如seq id no.13所示。

18、优选的，所述cas蛋白的氨基酸序列与野生型cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于seq id no.13所示的氨基酸序列的第958位的e突变为k。

19、优选的，所述cas蛋白的氨基酸序列与seq id no.13相比，第958位的e突变为k。

20、进一步的，所述方法还包括从待测样品中获得待测核酸的步骤；优选的，采用扩增的方法从待测样品中获得待测核酸。

21、本发明所述扩增选自pcr、基于核酸测序的扩增(nasba)、重组酶聚合酶扩增(rpa)、环介导的等温扩增(lamp)、链置换扩增(sda)、解旋酶依赖性扩增(hda)、或切口酶扩增反应(near)、多重置换扩增(mda)、滚环扩增(rca)、连接酶链反应(lcr)、或衍生物扩增方法(ram)中的一种或任意几种，优选的，所述扩增为lamp扩增。

22、本发明中，所述样品可以为来自动物。

23、本发明中，所述可检测信号通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光信号，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

24、在一些实施方式中，本发明的方法还包括测量cas蛋白产生的可检测信号的步骤。所述cas蛋白识别所述靶核酸或与所述靶核酸杂交之后可以激发任意单链核酸的切割活性，从而切割所述单链核酸检测器进而产生可检测信号。

25、在一个实施方式中，所述可检测信号还可以通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，例如荧光基团和淬灭基团，荧光基团选自fam、fitc、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种或任意几种；淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的一种或任意几种。

26、在一个实施方式中，所述单链核酸检测器为5’-fam-ttttttt-bq1-3’。

27、在一个实施方式中，单链核酸检测器的两端设置成能够被胶体金检测的标记。

28、在一个实施方式中，所述步骤s1为rpa扩增方法。

29、优选的，所述步骤s1包括：

30、（1）将样本与扩增缓冲液充分混匀；

31、（2）取 （1）混匀液，并加入核酸模板；

32、（3）加入上游引物和下游引物；

33、（4）向反应管中加入醋酸镁。

34、优选的，所述步骤s1包括：

35、（1）将样本与48 µl扩增缓冲液充分混匀；

36、（2）取（1）混匀液12µl置于八连管管盖上，并加入1.6 µl核酸模板；

37、（3）分别加入0.2µl上游引物和0.2µl下游引物（引物浓度 100µm）；

38、（4）向反应管中加入 1.0µl 醋酸镁。

39、在一个实施方式中，所述步骤s2为crispr检测方法；优选的，所述步骤s2中的检测体系包括10×crispr buffer、cas蛋白、sgrna和单链核酸检测器；更优选的所述步骤s2中的检测体系包括1µl 1×crispr buffer、(2.5 µm) 0.4µl cas蛋白、(100ng/µl) 0.2µlsgrna和(100µm) 0.1µl单链核酸检测器；crispr反应参数为43℃/30min。

40、在一个实施方式中，所述方法的特异性强、灵敏度高。所述方法的检出限为1e1copies/t。

41、另一方面，本发明还提供了一种用于检测安第斯病毒的系统或组合物，所述系统或组合物包括上述rpa扩增引物组、cas蛋白、上述sgrna。进一步的，所述系统或组合物还包括上述单链核酸检测器。

42、另一方面，本发明还提供了上述系统或组合物在检测安第斯病毒中的应用。

43、另一方面，本发明还提供了上述系统或组合物在制备检测安第斯病毒的试剂或试剂盒中的用途。

44、发明的有益效果：

45、本发明提供了一种检测安第斯病毒的方法，所述方法为rpa-crispr检测方法，并采用了检测效率较高的rpa扩增引物组和sgrna，具有特异性强、灵敏度高等优点。

46、序列信息

47、本发明涉及的部分序列信息提供如下表1所示：

48、表1

49、

50、

51、

52、下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。