一种子宫内膜异位症大鼠模型的构建方法与流程

本发明涉及生物医药及动物模型构建，特别涉及一种子宫内膜异位症大鼠模型的构建方法。

背景技术：

1、子宫内膜异位症(endometriosis，ems)是女性常见的疾病之一，影响着全球约10%的育龄期女性，其指宫腔外出现有活性的子宫内膜腺体和间质。ems病变通常位于盆腔，可累及腹膜、卵巢和输卵管，但也有少数可种植于肠道、横膈和胸膜腔。虽然ems是常见的良性疾病，但异位的内膜组织及其产生的炎症可导致痛经、性交痛、慢性盆腹腔疼痛和不孕。由于其确切病因尚未明确，目前缺乏十分有效的治疗措施。动物模型作为一种研究疾病病理机制和治疗策略的重要手段，可供我们进一步深入研究ems的发生发展过程并探索相关的治疗方案。

2、目前用于构建子宫内膜异位症动物模型的动物类型主要有灵长类和啮齿类动物。常用灵长类动物为恒河猴、食蟹猴、狨猴等，建模方法多模拟人类经血逆流机制进行自体子宫内膜移植法。其优点是灵长类动物生理特征高度接近人类，具有与人类相似的月经周期，子宫内膜的组织学结构、激素受体分布、周期性增殖与脱落规律均与人类一致，模型能真实模拟人类内异症的病理生理过程，且建模后异位病灶可形成类似人类的典型内异症结节、囊肿，与临床患者的病理特征一致。但其实验成本极高，建模周期长、难度大，实验样本量也受到限制。常用啮齿类动物为小鼠、大鼠，建模方法以自体子宫内膜移植法为主，也可采用异体移植、激素诱导法等。其优点是成本低廉，易规模化，且建模周期短，啮齿类动情周期短（4~5天），建模后2~4周即可形成稳定的异位病灶。其操作简便，易于标准化。

3、关于腹膜型子宫内膜异位症大鼠模型的构建方法，主要有自体内膜移植和异体内膜移植。移植方法一般有两种，内膜碎片腹腔注射法及定点缝合法。内膜碎片腹腔注射法是将剪碎的子宫内膜组织悬液，通过注射器直接注入大鼠腹腔内，依靠腹腔液的流动和腹膜的黏附性，让内膜碎片随机种植于腹膜表面。此方法虽操作简便，耗时短，但由于种植位点不可控，导致病灶分布分散，而不同大鼠的病灶数量、大小、位置差异较大，难以观察比较。且现有技术指出部分内膜碎片可能被腹腔巨噬细胞吞噬或随腹腔液排出，无法成功黏附定植，整体建模成功率通常低于定点缝合法。定点缝合法是在开腹后，将子宫内膜碎片或组织块精准缝合固定于腹膜的特定目标位点（如腹壁腹膜、卵巢表面、子宫直肠陷凹），实现内膜组织的异位定植。

4、现有技术中，为了提高内膜在腹壁的存活率，普遍采用“术前雌激素诱导+显微缝合固定+术后每日雌激素注射”的三段式方案。这一方案存在显著的技术局限性与技术偏见：1、操作瓶颈：显微缝合技术要求高，在狭小的大鼠腹腔内将脆弱的子宫内膜缝合于腹壁上，极易因张力导致组织撕裂、缺血坏死，且手术时间过长会增加麻醉风险和感染概率。2、给药繁琐与应激干扰：术后需连续1-2周每日对大鼠进行肌肉注射雌激素。这不仅耗费大量人力，且每日抓取注射会造成大鼠强烈的应激反应，导致皮质酮水平升高，免疫微环境改变，反而不利于早期异位病灶的稳定定植。3、存在的技术偏见：本领域存在一种普遍认知，即术中仅需物理固定，外源性雌激素的补充必须在术后进行以模拟生理周期。这是因为存在一种技术偏见——认为术中局部接触高浓度雌激素可能导致移植物表面炎性细胞过度浸润或加速凋亡，从而降低早期粘附成功率。因此，尽管缓释材料在医药领域普遍，但本领域技术人员通常不会将雌激素的释放时机前移至移植物与腹壁接触的初始急性期，以避免干扰这一关键窗口期的生物学过程。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种利用环境响应型自愈合水凝胶一步法构建腹壁型子宫内膜异位症大鼠模型的方法。本发明不仅实现了手术操作的极简化，更利用内异症病灶早期的炎症微环境触发机制，实现了雌激素的智能适配释放。

2、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一个方面，提供一种负载雌激素的水凝胶在构建子宫内膜异位症动物模型中的应用，其中，所述负载雌激素的水凝胶为负载雌激素的羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸水凝胶。

4、在本发明的一些实施方式中，所述负载雌激素的水凝胶中，每1ml水凝胶含有雌激素1至2mg。

5、在本发明的一些实施方式中，所述负载雌激素的水凝胶能够响应子宫内膜异位症病灶局部ph6.5-6.8的微酸性微环境，实现所载激素的ph响应可控释放。

6、在本发明的一些实施方式中，所述负载雌激素的水凝胶在体内利用内异症病灶早期因缺氧和炎症导致的微酸性环境（ph 6.5-6.8），触发席夫碱键的动态断裂-重构，智能调控雌二醇的按需释放，从而精准促进血管生成和内膜存活。

7、在本发明的一些实施方式中，所述氧化透明质酸的分子量为8-14kda。

8、在本发明的一些实施方式中，所述氧化透明质酸中的醛基与腹壁组织蛋白氨基的共价键结合，实现了在腹腔液存在下的牢固湿态粘附。

9、在本发明的一些实施方式中，所述雌激素包括雌二醇。

10、在本发明的一些实施方式中，所述羧甲基壳聚糖的质量浓度为2-6wt%。

11、在本发明的一些实施方式中，所述羧甲基壳聚糖的质量浓度为3-5 wt%。

12、在本发明的一些实施方式中，所述羧甲基壳聚糖的质量浓度为4 wt%。

13、在本发明的一些实施方式中，所述雌激素溶液浓度为1.5-2.5 mg/ml。

14、在本发明的一些实施方式中，所述雌激素溶液浓度为2 mg/ml。

15、在本发明的一些实施方式中，所述羧甲基壳聚糖水溶液与雌激素溶液的混合体积比为0.8:1-1.2:1。

16、在本发明的一些实施方式中，所述羧甲基壳聚糖水溶液与雌激素溶液混合体积比为1:1。

17、在本发明的一些实施方式中，所述羧甲基壳聚糖与雌激素的混合质量比为15:1至25:1。

18、在本发明的一些实施方式中，所述羧甲基壳聚糖与雌激素的混合质量比为20：1。

19、在本发明的一些实施方式中，所述负载雌激素的水凝胶的制备方法，具体包括如下步骤：

20、（1）oha的合成：称取4.0 g的透明质酸(ha)溶解在350 ml超纯水中。随后，将0.4g的高碘酸钠(nalo4)溶解在10 ml超纯水中，然后缓慢滴加到ha溶液中，在室温下避光搅拌2小时。之后加入1 ml乙二醇以清除多余的nalo4，继续搅拌1小时。接着，反应溶液在透析袋(分子量截止=8-14kda)中透析3天。最后，将透析溶液经冷冻干燥得到氧化透明质酸(oha)储存在-20℃。

21、（2）e-cmcs的合成：取羧甲基壳聚糖（cmcs，4 wt%）与雌二醇（2 mg/ml）按1:1（体积比）混合均匀。

22、（3）e-cmcs-oha的合成：将4wt%上述步骤（1）中的oha与4wt%步骤（2）中的e-cmcs按1:1（体积比）混合即可得搭载雌二醇的羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸水凝胶，静止数分钟后可成胶。

23、（4）cmcs-oha的合成：部分实验采用不搭载雌激素的水凝胶材料作为对照，即将4wt%上述步骤（1）中的oha与4wt% cmcs按1:1（体积比）混合即可得搭羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸（cmcs-oha）水凝胶。

24、本发明的第二个方面，提供一种子宫内膜异位症动物模型的构建方法，包括如下步骤：

25、实验动物给予激素以同步动情周期；取自体子宫作为移植物，与腹壁贴紧，同时将上述方面所述的负载雌激素的水凝胶涂覆于移植物上；即完成所述子宫内膜异位症动物模型的构建。

26、在本发明的一些实施方式中，所述实验动物为6-8周龄的雌性sd大鼠。

27、在本发明的一些实施方式中，所述sd大鼠的体重为200–250 g。

28、在本发明的一些实施方式中，所述雌激素包括雌二醇类甾体激素。

29、在本发明的一些实施方式中，所述雌激素为戊酸雌二醇。

30、在本发明的一些实施方式中，所述激素的给药剂量为0.2 mg-0.3 mg/只。

31、在本发明的一些实施方式中，在术前实验动物给予激素以同步动情周期，目的是为了提高异位内膜存活率及造模成功率。

32、在本发明的一些实施方式中，所述取自体子宫的具体步骤包括：作下腹正中纵切口约2–3 cm，逐层入腹；暴露左侧子宫角，于近端1cm、远端离卵巢1cm处双重结扎并切断，切除约1 cm子宫段。

33、在本发明的一些实施方式中，所述移植物的大小为3mm×3mm-6mm×6mm。

34、在本发明的一些实施方式中，所述移植物的大小具体为5mm×5mm。

35、在本发明的一些实施方式中，所述实验动物腹壁为实验动物左右两侧腹壁。

36、在本发明的一些实施方式中，所述实验动物左右两侧腹壁为远离切口且血供丰富的区域。

37、在本发明的一些实施方式中，所述水凝胶涂覆于移植物及腹壁上后，等待3-5分钟。

38、在本发明的一些实施方式中，所述实验步骤还包括术后管理：单笼饲养，28℃–32℃保温，自由饮食；每日观察大鼠精神状态与切口愈合情况。

39、在本发明的一些实施方式中，所述饲养周期为21-28天。

40、在本发明的一些实施方式中，所述饲养周期既能确保病灶充分生长至目标尺寸并形成稳定的囊实性结构，又能避免饲养周期过长导致的病灶过度增殖或动物机体出现严重并发症，提升实验效率与模型稳定性。

41、在本发明的一些实施方式中，所述构建的子宫内膜异位症动物模型会形成直径≥5 mm囊实性异位定植病灶。

42、在本发明的一些实施方式中，所述囊实性异位定植病灶可经病理切片he染色观察，具备典型子宫内膜异位组织病理学特征：病灶同时包含异位子宫内膜腺体及周围间质组织，腺体形态规则、排列规整，间质细胞分布均匀；病灶局部伴有不同程度炎性细胞浸润，符合临床腹壁型子宫内膜异位病灶的基础病理形态学特征。

43、在本发明的一些实施方式中，所述囊实性异位定植病灶的判定还可结合活体成像技术辅助验证，通过向实验动物体内注射荧光探针，在造模后14天、21天、28天进行活体荧光成像，实时监测病灶的生长动态与定植范围，确保病灶在腹腔腹壁区域稳定存在且未发生远处转移，进一步提升成模判定的精准度。

44、在本发明的一些实施方式中，所述荧光探针包括tbtcn-tdg荧光探针。

45、在本发明的一些实施方式中，所述荧光探针由d-吡喃半乳糖b-d-硫代吡喃半乳糖苷（thiodigalactoside，tdg）与小分子荧光探针tbtcn偶联制得。

46、在本发明的一些实施方式中，所述子宫内膜异位症动物模型的构建方法，具体包括如下步骤：

47、（1）术前准备：选用6-8周龄雌性sd大鼠，体重200–250g。术前1周：戊酸雌二醇0.2mg/只灌胃以同步动情周期。

48、（2）子宫内膜移植物准备：大鼠麻醉后，作下腹正中纵切口约2–3cm，逐层入腹；暴露左侧子宫角，于近端1cm、远端离卵巢1cm处双重结扎并切断，切除约1cm子宫段，放入无菌pbs中，将多余的脂肪、筋膜组织剔除，洗净血液，转移入dmem/f12培养基中，纵向剖开子宫，剪成5mm×5mm小块，保证内膜面完整。

49、（3）自体手术移植：在大鼠左右两侧腹壁（远离切口、血供丰富区），将移植物内膜面朝向腹膜贴紧，将上述e-cmcs-oha水凝胶涂覆于移植物及腹壁上，等候3-5分钟，此时水凝胶凝固并将移植物牢固粘合于腹壁上；检查无脱落及出血后复位肠管，逐层关腹并消毒。

50、（4）术后管理：单笼饲养，28–32℃保温，自由饮食；每日观察大鼠精神状态与切口愈合情况。

51、本发明的第三个方面，提供上述方面所述的构建方法构建的子宫内膜异位症动物模型在药物筛选和评估中的应用。

52、在本发明的一些实施方式中，所述药物用于治疗子宫内膜异位症，和/或缓解子宫内膜异位症伴随的痛经、盆腔慢性疼痛、性交痛、盆腔粘连、不孕并发症中的至少一种。

53、在本发明的一些实施方式中，所述药物包括抗增殖药物、抗炎药物或激素调节药物。

54、在本发明的一些实施方式中，所述药物选自化学合成小分子药物、中药复方提取物、微生物代谢产物、人工合成多肽药物、mirna/sirna核酸药物中的至少一种。

55、在本发明的一些实施方式中，所述药物的制剂形式包括脂质体制剂、温敏水凝胶缓释制剂、普通片剂、注射剂、栓剂中的至少一种。

56、在本发明的一些实施方式中，所述脂质体制剂、温敏水凝胶缓释制剂为靶向盆腔病灶的局部递送制剂。

57、在本发明的一些实施方式中，所述靶向盆腔病灶的局部递送制剂通过腹腔注射、阴道给药或腹腔镜引导下病灶局部给药的方式施用。

58、在本发明的一些实施方式中，所述药效评价包括病灶体积及生长速率评估、异位内膜组织病理形态学评估、外周血及病灶局部炎症因子（il-6、tnf-α、vegf）水平检测评估、疼痛行为学指标（热板法痛阈、机械缩足反射阈值）评估及生殖功能（排卵率、受孕率）相关指标评估。

59、在本发明的一些实施方式中，所述病理形态学评估包括异位内膜上皮细胞增殖活性、间质纤维化程度、血管生成密度的检测。

60、本发明的有益效果是：

61、（1）本发明在术中将负载雌激素的水凝胶应用于子宫内膜异位症的造模，该方法并未引起排斥或过度炎症，反而因该凝胶的生物相容性屏蔽作用和酸响应微量释放特性，显著降低了早期异位内膜的凋亡率。相比传统缝合+术后注射组，本发明的构建方法无需显微缝合及术后每日注射雌激素，手术时间缩短将近80%，建模成功率提升至90%，病灶体积均一性显著提高，且更真实模拟人类子宫内膜异位症早期病理生理过程，适用于规模化建模及药物筛选。

62、（2）本发明利用oha中的醛基与腹壁组织蛋白氨基的共价键结合，实现了在腹腔液存在下的牢固湿态粘附。这一操作将平均手术时间从传统缝合法的8.99分钟缩短至1.90分钟，且无需显微外科培训背景即可操作，具有显著的临床转化和规模化推广价值。

63、（3）本发明实现了“固定-给药-微环境调控”三位一体的智能化。本发明构建的水凝胶并非简单的“雌激素仓库”，其释药动力学受病灶酸性微环境调控。在炎症重、ph低时加速释放以促进修复；随着病灶成熟炎症消退，释放减缓。这种智能负反馈调节是传统术后肌注恒定剂量雌激素所无法比拟的，使得构建的模型更贴近人类内异症的自然病程。