一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂的制作方法

本发明涉及动物疫苗，具体的，涉及一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂。

背景技术：

1、炭疽是由炭疽杆菌引起的人畜共患烈性传染病，传染性强、致死率高，是重点防控的烈性病原微生物。针对炭疽感染的应急救治与预防，马源超免疫炭疽血清是临床核心被动免疫制剂。

2、传统活菌免疫方案风险极高，炭疽杆菌可形成抵抗力极强的芽孢，活菌免疫后马匹易出现发热、炎症应激、凝血紊乱等不良反应，严重时可导致免疫动物死亡，规模化生产安全性极差。

3、因此，研制一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，是很有必要的。

技术实现思路

1、本发明提出一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，本发明提供的无芽孢灭活菌体混悬注射剂在不进行活菌攻毒的前提下，安全、有效地诱导马匹产生高效价炭疽抗体，零死亡，对马匹年龄及体质要求宽泛，适用面广。

2、本发明的技术方案如下：

3、根据本发明的一个方面，本发明提出一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，其特征在于，由无芽孢灭活菌体和混悬介质组成；所述混悬介质的原料包括hepes缓冲剂、甘露醇、羟丙基β环糊精包合姜黄素、低分子肝素钙和注射用水。

4、在上述技术方案中，所述无芽孢灭活菌体为无芽孢灭活炭疽杆菌，所述无芽孢灭活炭疽杆菌的平均粒径为2~8μm。

5、在上述技术方案中，所述无芽孢灭活炭疽杆菌的制备方法包括以下步骤：炭疽杆菌解冻后接种于固体富养培养基，培养后收集菌苔至无菌离心管中，物理灭活处理后冰浴冷却至4℃以下，破碎后得到所述无芽孢灭活炭疽杆菌。

6、在上述技术方案中，所述培养的时间为8~12 h，所述培养的温度为35~37 ℃，所述培养的相对湿度为50%~60%。

7、在上述技术方案中，所述物理灭活处理的温度为120~122 ℃，所述物理灭活处理的时间为20~25 min，所述物理灭活处理在饱和蒸汽状态下进行，所述饱和蒸汽的压力为2~2.05 kg/cm2。

8、在上述技术方案中，所述无芽孢灭活菌体混悬注射剂的制备方法包括以下步骤：

9、s1、配置hepes缓冲体系，将羟丙基β环糊精分散于所述hepes缓冲体系中，水浴预热至30~50℃，得到羟丙基β环糊精母液；

10、s2、将姜黄素溶于乙醇中，得到姜黄素乙醇溶液，将所述姜黄素乙醇溶液滴加入所述羟丙基β环糊精母液中，搅拌后经旋蒸、过滤，得到包合物溶液；

11、s3、将低分子肝素钙加入所述包合物溶液中，过滤后得到所述混悬介质；

12、s4、将所述无芽孢灭活菌体和所述混悬介质混合，形成混悬液，所述混悬液经粗滤除杂、分装，得到所述无芽孢灭活菌体混悬注射剂。

13、在上述技术方案中，所述hepes缓冲体系的配置方法包括以下步骤：将hepes缓冲剂溶于注射用水中，调节ph为7.1~7.2，加入甘露醇，得到渗透压为280~320 mosm/kg的hepes缓冲体系。

14、在上述技术方案中，步骤s2中，所述乙醇的浓度为95wt%，所述姜黄素与所述乙醇的质量体积比为1:15~16 g/ml，所述包合物溶液中，所述姜黄素与所述羟丙基β环糊精的摩尔比为1:4~4.2。

15、在上述技术方案中，按抗xa活性计，所述低分子肝素钙的分子量为4000~6000da。

16、在上述技术方案中，所述无芽孢灭活菌体混悬注射剂中，所述hepes缓冲剂的浓度为10~12 mmol/l，所述甘露醇的浓度为20~30 mg/ml，所述姜黄素的浓度为5~50 μmol/l，所述低分子肝素钙的浓度为20~80iu/ml，按抗xa活性计。

17、本发明的工作原理及有益效果为：

18、本发明中，以hepes缓冲体系、羟丙基β环糊精包合姜黄素与低分子肝素钙协同构建混悬介质，与无芽孢灭活菌体复配形成混悬注射剂。hepes缓冲体系具备优异的缓冲容量与静脉生物相容性，可维持制剂体系ph长期稳定，规避常规缓冲体系输注过程ph漂移、产生沉淀引发马匹应激发热的问题；羟丙基β环糊精包合结构提升姜黄素水溶性与体系分散稳定性，能够有效抑制菌体碎片诱发的介导炎症级联反应，减轻静脉免疫带来的全身性炎症损伤；低分子肝素钙可靶向抑制菌体碎片激活的接触途径凝血扩增，预防微血管血栓形成，同时相较于其他抗凝物质出血风险更低。三种组分相互配合发挥协同作用，在保障灭活菌体抗原结构稳定、充分激发马匹特异性免疫应答、提升炭疽抗体血清效价的同时，大幅降低马匹静脉免疫后的发热、凝血异常等不良反应，兼顾免疫制剂使用安全性与免疫诱导效率。

1.一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，其特征在于，由无芽孢灭活菌体和混悬介质组成；所述混悬介质的原料包括hepes缓冲剂、甘露醇、羟丙基β环糊精包合姜黄素、低分子肝素钙和注射用水。

2. 根据权利要求1所述的一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，其特征在于，所述无芽孢灭活菌体为无芽孢灭活炭疽杆菌，所述无芽孢灭活炭疽杆菌的平均粒径为2~8 μm。

3.根据权利要求2所述的一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，其特征在于，所述无芽孢灭活炭疽杆菌的制备方法包括以下步骤：炭疽杆菌解冻后接种于固体富养培养基，培养后收集菌苔至无菌离心管中，物理灭活处理后冰浴冷却至4℃以下，破碎后得到所述无芽孢灭活炭疽杆菌。

4. 根据权利要求3所述的一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，其特征在于，所述培养的时间为8~12 h，所述培养的温度为35~37 ℃，所述培养的相对湿度为50%~60%。

5. 根据权利要求3所述的一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，其特征在于，所述物理灭活处理的温度为120~122 ℃，所述物理灭活处理的时间为20~25 min，所述物理灭活处理在饱和蒸汽状态下进行，所述饱和蒸汽的压力为2~2.05 kg/cm2。

6.根据权利要求1所述的一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，其特征在于，所述无芽孢灭活菌体混悬注射剂的制备方法包括以下步骤：

7. 根据权利要求6所述的一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，其特征在于，所述hepes缓冲体系的配置方法包括以下步骤：将hepes缓冲剂溶于注射用水中，调节ph为7.1~7.2，加入甘露醇，得到渗透压为280~320 mosm/kg的hepes缓冲体系。

8. 根据权利要求6所述的一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，其特征在于，步骤s2中，所述乙醇的浓度为95wt%，所述姜黄素与所述乙醇的质量体积比为1:15~16 g/ml，所述包合物溶液中，所述姜黄素与所述羟丙基β环糊精的摩尔比为1:4~4.2。

9.根据权利要求1所述的一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，其特征在于，按抗xa活性计，所述低分子肝素钙的分子量为4000~6000da。

10. 根据权利要求6所述的一种用于马匹静脉超免疫制备炭疽阳性血清的无芽孢灭活菌体混悬注射剂，其特征在于，所述无芽孢灭活菌体混悬注射剂中，所述hepes缓冲剂的浓度为10~12 mmol/l，所述甘露醇的浓度为20~30 mg/ml，所述姜黄素的浓度为5~50 μmol/l，所述低分子肝素钙的浓度为20~80 iu/ml，按抗xa活性计。