一种具有抗肿瘤活性的果胶-蛋白纤维复合物及其制备和应用

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的果胶-蛋白纤维复合物及其制备和应用。

背景技术：

1、肿瘤的异常增殖与耐药性仍是癌症治疗的核心挑战。近年来，基于天然多糖的纳米递送系统因其生物相容性、可降解性及多靶点调控能力备受关注。传统化疗药物因靶向性差、系统毒性及耐药性等问题，亟需开发兼具高效性与生物安全性的新型纳米药物。

2、果胶(pectin)是一类广泛存在于高等植物初生细胞壁与胞间层的高度支化杂多糖，其结构可以分为：鼠李半乳聚糖-i(rhamnogalacturonan i，rg-i)和同型半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，hg)。其中，rg-i由重复单位[1,4-α-d-gala-1,2-α-l-rha-]构成，鼠李糖残基的c-3和c-4位常连接半乳糖和阿拉伯糖等中性糖而形成的长短不一的侧链。半乳糖凝集素-3(galectin-3，gal-3)是一种β-半乳糖苷结合蛋白，在多种肿瘤中高表达，参与肿瘤的发生、发展和转移，而rg-i上的半乳糖基团是介导gal-3特异性结合的关键功能域，能通过多价结合模式阻断gal-3受体信号，抑制肿瘤细胞迁移粘附、调节t细胞过度活化并重塑免疫微环境，所以rg-i是果胶的活性区域。

3、β-乳球蛋白(β-lg)是牛奶中主要的乳清蛋白，具有独特的结构和功能特性，其能在特定条件下(如加热、ph变化、离子强度改变或浓度升高)发生自组装(self-assembly)，形成更高级的聚集体(如二聚体、寡聚体和纳米纤维)，暴露出疏水核心，疏水相互作用增强，使得β-lg成为不同生物活性成分的潜在载体。

4、然而，β-lg通过热变复性形成的纳米纤维缺乏靶向识别能力，果胶则因线性结构易降解且直接抗肿瘤活性不足，制约了其二者的应用。研究表明，通过调控氢键与疏水相互作用，rg-1可以与β-lg纤维形成纤维状复合物，但目前果胶-蛋白纳米纤维在活性领域的研究仍较少，不同的蛋白质、果胶的性质和结构以及复合物所处的环境条件，都会影响蛋白纤维和果胶之间的亲和力和免疫活性。因此，有必要制备出一种具有抗肿瘤活性的果胶-蛋白纤维复合物。

技术实现思路

1、为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种果胶-蛋白纤维复合物的制备方法，首先采用酶解与超声结合的方法得到果胶片段，再与β-乳球蛋白纤维通过调控氢键与疏水相互作用形成“纤维内核-果胶外壳”结构的复合成果胶-蛋白纤维复合物。所得果胶-纳米纤维复合物在中性条件下能稳定分散，且可通过诱导肿瘤细胞的早期凋亡影响细胞的生长，对肝癌细胞(hepg2细胞)具有一定的抑制增殖作用，表现出较强的抗肿瘤活性。

2、本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的一种果胶-蛋白纤维复合物。

3、本发明的再一目的在于提供上述果胶-蛋白纤维复合物在药物制备中的应用。

4、本发明目的通过以下技术方案实现：

5、一种具有抗肿瘤活性的果胶-蛋白纤维复合物的制备方法，包括以下步骤：

6、(1)将果胶粉水合后，超声处理，再在果胶酶作用下进行水解反应，水解产物经透析，冷冻干燥，得到果胶片段；

7、(2)将β-乳球蛋白水化后，在酸性条件下加热反应，反应结束后，在冰水混合物中冷却，得到β-乳球蛋白纳米纤维；

8、(3)将果胶片段、β-乳球蛋白纳米纤维和水混合后，再调节体系ph，得到果胶-蛋白纤维复合物。

9、优选地，步骤(1)所述果胶粉水合的方法为：将果胶粉加入到乙酸钠缓冲液中，搅拌至水合。

10、更优选地，所述果胶粉和乙酸钠缓冲液的比例为0.5-2g：100ml；所述乙酸钠缓冲液的ph为2.0-7.0。

11、优选地，步骤(1)所述超声处理的功率为8-10w/ml，时间为5-20min(工作1-3s，间歇1-3s)。

12、优选地，步骤(1)所述超声处理在细胞粉粹机中进行。

13、优选地，步骤(1)所述果胶为柑橘果胶、苹果果胶和甜菜果胶中的至少一种，更优选为柑橘果胶。

14、优选地，步骤(1)所述果胶酶为内切多聚半乳糖醛酸酶，比活性为4-6u/mg蛋白，酶液的蛋白浓度为8-12mg/ml。

15、优选地，步骤(1)所述水解反应体系中，果胶酶的添加量为0.025-0.5u/g底物，优选为0.025u/g底物。

16、优选地，步骤(1)所述水解反应的温度为20-70℃，更优选为30-45℃；水解时间为10-40min，优选为30min。

17、优选地，步骤(1)所述水解反应结束后立即浸入沸水中水浴3min以灭活果胶酶。

18、优选地，步骤(1)所述透析指将水解产物在去离子水中进行透析。

19、优选地，步骤(2)所述β-乳球蛋白水化的方法为：将β-乳球蛋白分散于去离子水中，室温搅拌，使其充分水化。

20、优选地，步骤(2)所述β-乳球蛋白水化后分散液浓度为10-30mg/ml。

21、优选地，步骤(2)所述酸性条件指用酸性调节剂调节水化后的β-乳球蛋白分散液的ph为2-3，所述酸性调节剂为1-3mol/l的盐酸、醋酸、柠檬酸和硫酸中的至少一种。

22、优选地，步骤(2)所述加热反应的温度为70-90℃，时间为15-25h。

23、优选地，步骤(3)所述果胶片段和β-乳球蛋白纳米纤维的质量比为1：1-2：1。

24、优选地，步骤(3)所述果胶片段、β-乳球蛋白纳米纤维和水混合后，果胶片段和β-乳球蛋白纳米纤维在混合体系中的总浓度为0.5-2mg/ml。

25、优选地，步骤(3)所述体系ph为2-9；更优选为5-9；最优选为7-9。

26、优选地，步骤(3)所述调节体系ph用的试剂为盐酸、醋酸、柠檬酸、硫酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠和氢氧化钾中的至少一种。

27、上述一种具有抗肿瘤活性的果胶-蛋白纤维复合物的制备方法，包括以下步骤：

28、(1)将果胶粉加入到乙酸钠缓冲液中，搅拌至水合，再用细胞破碎机超声处理，再加入果胶酶进行水解反应，反应结束后，透析，冷冻干燥，得到果胶片段；

29、(2)将β-乳球蛋白分散于水中，搅拌至水化，调节分散液ph，加热反应，反应结束后，所得β-乳球蛋白纤维浸没在冰水中冷却，最后于低温保存备用；

30、(3)将β-乳球蛋白纤维、果胶片段和水混合后，调节体系ph，得到果胶-蛋白纤维复合物。

31、优选地，步骤(2)所述低温指1-6℃。

32、本发明还提供上述制备方法制得的一种具有抗肿瘤活性的果胶-蛋白纤维复合物。

33、本发明还提供上述一种具有抗肿瘤活性的果胶-蛋白纤维复合物在药物制备中的应用。

34、优选地，所述应用指在制备抗肿瘤药物中的应用。

35、本发明工艺的机理为：

36、在酸热处理下，β-乳球蛋白会发生部分解折叠，暴露蛋白纤维内部的疏水基团，增强疏水相互作用，而果胶片段的加入在蛋白分子之间起到桥梁作用，形成分子间复合物。疏水相互作用克服了蛋白分子间的静电斥力，而且，在ph为7时，果胶片段带有一定的电荷，可能屏蔽了热处理蛋白分子表面的电荷，减弱了蛋白分子间的静电排斥力。在疏水相互作用和电荷屏蔽效应的协同作用下，果胶羧酸根(-coo-)与β-lg纤维表面带正电荷区域发生静电结合。这种结合使得果胶在纤维表面形成一层负电荷层，通过静电排斥作用有效抑制β-lg纤维的聚集。同时，果胶分子链的刚性骨架可能通过空间位阻效应进一步稳定纤维的延展构象，使得果胶-蛋白纤维复合物形成“蛋白纤维内核-果胶外壳”结构，呈现高度延展的线性结构，具有较好的分散性。

37、与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

38、1、本发明将果胶片段和β-乳球蛋白纳米纤维进行复配，得到均一且稳定的果胶-蛋白纤维复合物。该复合物形成“蛋白纤维内核-果胶外壳”结构，呈现高度延展的线性结构，其zeta电位绝对值大于30mv，且纤维表面覆盖较为连续，在透射电镜下未观察到明显的聚集或相分离现象，整体保持均匀性。

39、2、本发明得到的果胶-蛋白纤维复合物可通过诱导肿瘤细胞的早期凋亡影响细胞的生长，对肝癌细胞(hepg2细胞)具有一定的抑制增殖作用，且抗肿瘤细胞异常增殖的活性显著优于单一组分，表现出较强的抗肿瘤活性。有利于解决蛋白纤维缺乏靶向识别能力，果胶因线性结构易降解且直接抗肿瘤活性不足等单一组分应用的局限性。