集成血红素铁和非血红素铁的补铁剂纳米载体及其应用

本发明涉及集成血红素铁和非血红素铁的补铁剂纳米载体及其应用，属于生物。

背景技术：

1、铁是人体必需的微量元素之一，在氧气运输、能量代谢及多种酶促反应中发挥重要作用。铁缺乏会导致缺铁性贫血，进而引起免疫功能下降、生长发育迟缓及认知能力受损等问题。因此，开发安全、高效的补铁剂具有重要的营养学和公共健康意义。

2、目前，市场上的补铁剂主要分为血红素铁（heme iron）和非血红素铁（non-hemeiron）两大类。

3、非血红素铁补充剂主要包括硫酸亚铁、富马酸亚铁和葡萄糖酸亚铁等无机或有机铁盐。该类补铁剂成本较低，应用广泛，但其吸收过程依赖二价金属离子转运体（dmt1），易受到膳食中植酸、多酚及膳食纤维等因素的抑制，导致生物利用率较低。此外，非血红素铁在胃肠道中容易产生氧化反应，引发胃肠不适、恶心等副作用。

4、血红素铁补充剂主要来源于动物血红蛋白或血红素提取物，其吸收过程主要通过血红素转运蛋白（hcp1）介导，具有较高的吸收率且不易受膳食因素干扰。然而，该类补铁剂存在来源受限、成本较高及稳定性较差等问题，限制了其广泛应用。

5、现有技术中，补铁策略多以单一铁源为主，难以兼顾高载铁能力与高生物利用率。同时，将血红素铁与非血红素铁简单混合并不能显著提高吸收效率，且可能存在铁离子相互作用导致稳定性下降的问题。因此，开发一种能够同时整合血红素铁与非血红素铁优势的新型补铁体系仍是亟待解决的技术问题。

6、铁蛋白是一类广泛存在于生物体内的铁储存蛋白，具有由24个亚基组成的纳米笼结构，内部可矿化储存大量铁离子。近年来，铁蛋白作为纳米载体在营养递送和生物医学领域受到关注。然而，传统铁蛋白主要用于非血红素铁的储存与递送，其在同时递送血红素铁方面的应用研究较少。细菌来源的铁蛋白（bacterioferritin，bfr）具有独特的结构特征，其在蛋白亚基之间具有天然血红素结合位点，能够结合血红素分子，同时其内部空腔仍具备矿化铁离子的能力。这一特性为构建兼具血红素铁和非血红素铁的双铁源递送体系提供了新的可能。但是，在利用bfr同时携带血红素铁和非血红素铁时，还存在24聚体和2聚体共存从而影响结合血红素的问题。

7、因此，如何利用细菌铁蛋白的结构优势，构建一种同时负载血红素铁和非血红素铁、兼具高稳定性、高载铁能力及高生物利用率的新型补铁体系，是本领域亟需解决的关键技术问题。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明要解决的技术问题是利用bfr作为载体同时携带血红素铁和非血红素铁用作补铁剂时，还存在稳定性及生物利用率不高的问题。

3、技术方案

4、本发明提供一种制备集成血红素铁和非血红素铁的补铁剂纳米载体的方法，包括以下步骤：

5、（1）细菌铁蛋白的制备

6、获得大肠杆菌bl21来源细菌铁蛋白（

escherichia coli bacterioferritin，ecbfr）的编码基因，经限制性内切酶酶切后连接至原核表达载体以构建得到重组表达质粒，将重组表达质粒转化至宿主菌中，培养重组菌并诱导表达ecbfr，在诱导表达的同时添加血红素前体5-氨基乙酰丙酸；培养结束后，收集菌体，经细胞破碎、热处理、离子交换层析及凝胶过滤等方法纯化，获得ecbfr蛋白；

7、（2）血红素铁装载

8、将血红素溶解于有机溶剂后，用缓冲液稀释配制血红素工作液，将其加入ecbfr蛋白溶液中，在适宜温度下孵育，使血红素结合于ecbfr亚基间的天然血红素结合位点，随后采用透析、超滤或凝胶过滤等方式去除未结合血红素，获得血红素负载的ecbfr；

9、所述有机溶剂可以是二甲基亚砜、甲醇或乙醇；

10、所述缓冲液可以是tris-hcl（ph7.0-8.0）、mops（ph7.0-8.0）或pbs（ph7.0-8.0）；

11、所述血红素工作液的浓度可以是20 μm -100 μm；

12、所述ecbfr蛋白溶液中ecbfr的浓度可以是0.5 μm-1.0 μm，所述ecbfr蛋白溶液的溶剂可以是tris-hcl（ph7.0-8.0）、mops（ph7.0-8.0）或pbs（ph7.0-8.0）；

13、所述血红素工作液与所述ecbfr蛋白溶液的用量比例可以是50:1-20:1；

14、所述孵育的温度可以是60-80℃，孵育时间可以是15-30min；

15、（3）非血红素铁矿化

16、将步骤（2）所得血红素负载的ecbfr溶于缓冲液中，在搅拌条件下分批加入亚铁盐溶液，每次加入后充分反应，使fe²+进入蛋白内部空腔并发生矿化，形成非血红素铁矿物核心；待完成预设矿化次数后，采用透析或超滤去除游离铁离子，得到同时负载血红素铁和非血红素铁的ecbfr纳米载体；

17、所述缓冲液可以是 tris-hcl（ph7.0-8.0）、mops（ph7.0-8.0）、pbs（ph7.0-8.0）；

18、所述亚铁盐溶液可以是硫酸亚铁溶液，溶液浓度可以是1 mm-100 mm；

19、（4）产物纯化与保存

20、将所得纳米载体进一步脱盐纯化，经缓冲液置换后保存，获得集成血红素铁和非血红素铁的补铁剂纳米载体。

21、本发明提供应用所述方法制备得到的集成血红素铁和非血红素铁的补铁剂纳米载体。

22、本发明提供一种补铁组合物，含有所述集成血红素铁和非血红素铁的补铁剂纳米载体。可用于人或动物。

23、所述补铁组合物可以是粉剂、片剂、口服液、饮料。

24、所述补铁组合物还可以含有其他促进铁吸收的成分。

25、本发明提供所述补铁组合物在制备用于人或动物治疗缺铁性贫血的药物中的应用，例如用于制备宠物治疗缺铁性贫血的药物。

26、所述大肠杆菌来源的细菌铁蛋白（

escherichia coli bacterioferritin，ecbfr）在其二重对称轴位置具有天然血红素结合位点，能够结合血红素分子，同时其内部空腔能够矿化储存大量铁离子。

27、有益效果

28、补铁剂主要采用血红素铁或非血红素铁单一补铁模式，而本发明首次利用细菌源铁蛋白天然血红素结合能力和铁矿化能力，在同一蛋白纳米笼内实现血红素铁和非血红素铁的协同负载与递送，构建兼具高稳定性、高载铁量及高吸收率的新型双铁源补铁平台。大肠杆菌来源细菌铁蛋白（

escherichia coli bacterioferritin，ecbfr）作为载体，单个蛋白纳米笼可负载12个血红素分子及约800个铁原子。

29、本发明在制备ecbfr的过程中添加血红素前体5-氨基乙酰丙酸(5-ala)以提高ecbfr的血红素结合量。与不添加5-ala，可以将血红素结合量提高单个蛋白提高到5-9个血红素。

30、本发明所得集成血红素铁和非血红素铁的补铁剂纳米载体具有优异的热稳定性和储存稳定性；在80℃加热10 min条件下，仍然具备球形结构，可满足食品加工及储存过程中的稳定性要求；铁吸收效率显著高于传统feso4补铁体系，30 min铁转运量达到34.87±4.20 μg/well，为feso4+heme体系的约2.2倍，且明显高于feso4+heme补铁体系。

31、本发明所得集成血红素铁和非血红素铁的补铁剂纳米载体具有作为新一代高生物利用率补铁剂的应用潜力。