一种纳米气泡水耦合纤维素酶酶解-植物乳杆菌发酵制备桑叶提取物的方法与流程

本发明涉及一种纳米气泡水耦合纤维素酶酶解-植物乳杆菌发酵制备桑叶提取物的方法，属于天然产物提取与微生物发酵。

背景技术：

1、桑叶为桑科植物桑的干燥叶，是我国传统药食同源资源，具有疏散风热、清肺润燥之功效。现代药理学研究证实，桑叶具有显著的降血糖活性，其核心功效成分为1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，dnj）——一种强效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，可竞争性抑制小肠内碳水化合物的分解，延缓葡萄糖吸收，有效控制餐后血糖，在2型糖尿病的预防与辅助干预中具有极高应用价值。

2、目前桑叶dnj的提取方法以水提法、醇提法为主，存在提取效率低、有机溶剂残留、能耗高等问题。生物酶解法因反应条件温和、环境友好逐渐受到关注：纤维素酶可降解植物细胞壁的纤维素骨架，破坏细胞结构，促进胞内活性成分的释放，相比传统浸提法可显著提升dnj提取率。但常规水相酶解体系受液固传质限制，酶分子难以渗透到桑叶颗粒内部，细胞壁降解不彻底，导致酶解周期长、dnj及生物碱前体释放不充分，提取率提升幅度有限，也无法为后续发酵提供充足底物。

3、为进一步提升桑叶提取物的生物活性并改善风味，微生物发酵技术被引入桑叶深加工领域。植物乳杆菌等乳酸菌可通过代谢作用转化桑叶中的生物碱前体，促进dnj的生物合成与富集，同时发酵产生的有机酸可在一定程度上掩盖桑叶的苦味。但现有发酵工艺多直接以桑叶粗提液为底物，细胞壁未被充分破坏，胞内前体物质与营养成分释放不足，且发酵体系缺乏稳定适宜的微氧环境，导致微生物生长代谢受限，不仅dnj生物转化效率偏低，对不良风味的修饰效果也十分有限，产品仍带有明显苦涩味，限制了其在口服食品中的应用。

4、因此，开发一种可同时实现dnj高效富集与感官品质改善的新技术，具备迫切的现实需求与广阔的应用前景。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，旨在解决以下问题：

2、1. 常规水相酶解传质效率低，酶与底物接触不充分，桑叶细胞壁降解不彻底，dnj及生物碱前体物质释放有限，制约后续发酵转化的底物基础；

3、2. 传统发酵体系底物营养释放不足，且缺乏稳定适宜的微氧环境，植物乳杆菌代谢活性受限，dnj生物转化效率低，同时发酵不充分导致桑叶苦味、涩味等不良风味难以有效改善；

4、3. 现有工艺难以同步实现dnj含量大幅提升与风味品质优化，且部分工艺存在有机溶剂残留、周期长、能耗高，难以满足工业化绿色生产需求。

5、本发明提供一种纳米气泡水耦合纤维素酶酶解-植物乳杆菌发酵的制备方法，通过纳米气泡水在酶解与发酵阶段的双重强化作用，一方面高效破壁释放活性成分与前体物质，另一方面优化发酵微环境提升生物转化效率，最终实现桑叶提取物dnj含量显著提升、不良风味有效改善的双重目标。

6、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

7、本发明提供的第一个技术方案为一种纳米气泡水耦合纤维素酶酶解-植物乳杆菌发酵制备高活性桑叶提取物的方法，所述方法为将桑叶粉与纳米气泡水混合后，进行纤维素酶酶解获得酶解液，并利用植物乳杆菌发酵酶解液获得桑叶提取物。

8、在某些实施方式中，包括以下步骤：

9、步骤1：桑叶预处理

10、选取新鲜或干燥桑叶，去除枝梗、杂质，清水清洗后沥干，经冻干后，用粉碎机粉碎，过40～80目筛，得到桑叶粉，密封备用。

11、步骤2：纳米气泡水制备

12、采用超微气泡发生器（nbhw20h）制备纳米气泡水，纳米气泡浓度为1×107～2×107个/ml，溶解氧含量为10～20mg/l。该参数下的纳米气泡水兼具强化液固传质与构建稳定微氧环境的双重作用，可同时适配酶解提取与发酵转化两个阶段的需求。

13、步骤3：纳米气泡水耦合纤维素酶酶解提取

14、将桑叶粉与纳米气泡水按料液比1:10～1:30（g/ml）混合，加入纤维素酶（酶活力≥100000u/g），添加量为2～5%；搅拌均匀后，在45～55℃条件下恒温低速搅拌酶解1～4h，得到桑叶酶解提取液。

15、本步骤中，纳米气泡的高传质效应可促进纤维素酶分子向桑叶组织内部渗透，扩大酶与细胞壁的接触面积；气泡溃灭产生的微射流可辅助破坏细胞壁致密结构；结合纤维素酶对纤维素骨架的定向降解，三者协同实现高效破壁，充分释放胞内dnj、生物碱前体及糖类、氨基酸等营养物质，为后续发酵提供充足底物。

16、步骤4：灭酶与发酵培养基调整

17、酶解结束后，于115～121℃灭菌15～30min，冷却至37℃左右，得到发酵培养基。

18、步骤5：植物乳杆菌种子液制备

19、将植物乳杆菌接种于mrs液体培养基中，35～39℃静置培养18～36h，连续活化2～3代，至菌液浓度达到1×108～1×109cfu/ml，得到发酵种子液。

20、步骤6：植物乳杆菌接种发酵

21、按发酵培养基体积的1%～6%（v/v）接种量接入植物乳杆菌种子液，搅拌均匀后，在35～39℃条件下静置发酵24～72h。

22、本步骤中，纳米气泡在发酵体系中缓慢释放氧气，形成稳定的微氧环境，可调控兼性厌氧的植物乳杆菌的代谢通路，提升菌体生物量与生物碱合成酶系活性，促进生物碱前体向dnj的定向转化；同时菌体代谢强度提升，产生更丰富的乳酸、乙酸等有机酸，有效中和、掩盖桑叶的苦味，部分苦味多酚类物质也在发酵过程中发生降解转化，实现风味的显著改善。

23、步骤7：固液分离与浓缩

24、发酵结束后，将发酵液于80～95℃水浴加热10～20min灭活菌体与酶系，冷却后经离心除去桑叶残渣与菌体，收集上清液。

25、步骤8：干燥制粉

26、将上清液进行真空冷冻干燥，得到高活性、低苦味的桑叶提取物粉末。

27、在某些实施方式中，所述步骤2中，纳米气泡浓度优选为1×107～2×107个/ml，溶解氧含量优选为10～20mg/l。

28、在某些实施方式中，所述步骤3中，料液比优选为1:15～1:30（g/ml），酶解温度优选为48～55℃，酶解时间优选为1～3h；纤维素酶添加量为2%-5%。

29、在某些实施方式中，所述步骤5中，植物乳杆菌优选为南京诚成食品有限公司货号为cc044的植物乳杆菌粉。

30、在某些实施方式中，所述步骤6中，接种量优选为2%～6%（v/v），发酵温度优选为36～38℃，发酵时间优选为24～36h。

31、在某些实施方式中，所述步骤7中，离心条件为8000-10000rpm离心10～20min。

32、本发明提供的第二个技术方案为利用第一个技术方案所述的方法制备的桑叶提取物。

33、本发明提供的第四个技术方案为一种食品，所述食品含有第二个技术方案所述的桑叶提取物。

34、本发明提供的第五个技术方案为一种提升桑叶提取物的活性物质含量的方法，所述方法为所述方法为将桑叶粉与纳米气泡水混合后，进行纤维素酶酶解获得酶解液，并利用植物乳杆菌发酵酶解液获得桑叶提取物。

35、在某些实施方式中，所述桑叶粉与纳米气泡水按料液比1:10～1:30（g/ml）混合。

36、在某些实施方式中，所述酶解的条件为：加入纤维素酶（酶活力≥100000u/g），添加量为2～5%；搅拌均匀后，在45～55℃条件下恒温低速搅拌酶解1～4h，得到桑叶酶解提取液。

37、在某些实施方式中，所述发酵条件如下：所述接种量为2%～6%（v/v），发酵温度为36～38℃，发酵时间为24～36h。

38、在某些实施方式中，所述活性物质包括1-脱氧野尻霉素。

39、相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

40、1. 纳米气泡强化酶解破壁，活性成分释放效率大幅提升

41、纳米气泡的高传质效应可促进纤维素酶向桑叶组织内部深度渗透，显著增加酶与细胞壁底物的接触面积；气泡溃灭产生的微射流可辅助破坏细胞壁致密结构；结合纤维素酶对纤维素骨架的定向降解，三者协同实现高效破壁。与常规纯水酶解相比，dnj提取率提升6.2%以上，同时生物碱前体、糖类、氨基酸等营养物质充分释放，为后续发酵转化奠定充足的底物基础。

42、2. 微氧环境优化发酵过程，生物转化效率显著提高

43、发酵体系中纳米气泡缓慢释放氧气，形成稳定持久的微氧环境，可精准调控兼性厌氧的植物乳杆菌代谢通路，显著提升菌体生物量与生物碱合成酶系活性，将酶解释放的生物碱前体高效转化为dnj。与无纳米气泡强化的直接发酵工艺相比，dnj总含量额外提升6.6%以上，实现活性成分的定向富集。

44、3. 发酵深度强化，风味品质显著改善

45、依托纳米气泡对发酵过程的强化作用，植物乳杆菌代谢更旺盛，产生的乳酸、乙酸等有机酸含量更高，可有效中和桑叶的苦涩味；同时发酵过程中部分苦味黄酮、生物碱前体发生降解与转化，进一步弱化不良风味。最终制得的桑叶提取物粉末苦味柔和、无明显涩感，口感更温和，大幅提升了产品的适口性与应用适配性，可直接用于压片糖果、功能饮料等无需掩味的终端产品。

46、4. 多组分协同增效，降糖功能显著增强

47、最终提取物中不仅dnj含量提高，发酵过程产生的有机酸、小分子多酚等物质，可与dnj发挥协同抑制作用，共同提升α-葡萄糖苷酶抑制活性。

48、5. 工艺绿色环保，适合工业化生产

49、全程以水为介质，不使用有机溶剂，无有毒有害试剂残留；纤维素酶为生物制剂，反应条件温和；纳米气泡水可在线循环制备，能耗低。整体工艺操作简便、可控性强，易于规模化放大。