一种光响应透皮原位交联材料及其制备方法和使用方法与流程

本发明涉及生物医用高分子材料、经皮递送材料、胶原基复合材料、可见光响应材料及皮肤外用材料。

背景技术：

1、胶原是皮肤细胞外基质的重要结构成分。随着年龄增长、光老化或其他因素影响，皮肤胶原含量、纤维连续性和组织力学状态可发生变化。外源胶原、胶原肽及多糖材料因其亲水性和生物相容性，常被用于皮肤外用材料、组织界面材料和水凝胶体系。然而，皮肤角质层对大多数亲水性和高分子物质构成显著屏障，直接将完整大分子胶原或交联型多糖涂布于皮肤表面并不能保证其进入目标皮肤层。

2、另一方面，单纯追求材料的低分子化与高扩散性，会削弱材料在局部形成稳定网络的能力。短链胶原片段拥有更好的溶解性、铺展性与迁移能力，链缠结和连续成网能力却相对有限；较高分子量的胶原片段可以提供更多的氨基反应位点，兼具更好的链缠结效果与骨架支撑作用，但体系黏度与经皮迁移阻力也会相应增大。因此，可通过短链胶原承担“递送和补给”功能，长链胶原承担“界面桥联和网络支撑”功能，在完成递送后再进行原位交联，以此在经皮迁移能力与结构稳定性之间建立新的平衡。

3、若在皮肤表面先将胶原与交联型多糖充分混合，再尝试进行经皮递送，提前形成的网络会增加体系黏度、限制扩散并降低超声促渗效率。超声在20-100 khz低频超声主要通过稳态空化与瞬态空化效应扰动角质层脂质双分子层的有序排列，增加细胞间脂质流动性，构建瞬时水相通道，削弱皮肤屏障；0.5-3 mhz 高频超声借助机械效应与微声流，推动物质由表皮向真皮浅层传质。因此采用先低频开角质层、后高频促皮内转运的两阶段顺序超声，相比单频超声，更利于胶原-多糖在皮肤靶区高效共定位。

4、核黄素及其衍生物为可见光光敏组分，蓝光激发下可同时发生i型、ii型光动力反应：ii型反应生成单线态氧，在核黄素与胶原酪氨酸残基共定位的局部微环境中诱导胶原酪氨酸残基氧化交联，构建胶原分子间共价键；i型反应产生自由基，若体系存在甲基丙烯酰、丙烯酰等不饱和基团，可引发自由基聚合，额外构筑聚合网络。

5、当前胶原透皮-原位交联领域已有超声促渗、胶原光交联、多糖复合水凝胶、光敏交联等技术路线，但均存在不足，难以实现完整皮肤下胶原无创递送、深层渗透、时序原位交联一体化效果。cn100588436c公开超声促渗方案，可调节参数提升活性物透皮能力，但未针对胶原分子量、低黏度特性优化，缺少“先递送、后交联”时序控制，仅能导入物质，不能原位成型。cn114874455b采用胶原自组装-光交联，提升凝胶力学与稳定性，多用于体外组织工程，未解决完整皮肤透皮，递送与交联不能时序解耦，不适合透皮场景。cn117180494b为胶原-透明质酸双网络光交联水凝胶，生物相容性及抗瘢痕效果好，但仅限注射给药，为有创方式，递送与交联同步发生，物料未充分渗透即固化，深层修复受限。cn113769089a公开核黄素-蓝光胶原交联，该技术单独使用时仅实现胶原光化学交联，缺少配套经皮促渗体系，无法克服皮肤屏障造成的递送瓶颈，且未涉及与多糖动态共价网络的时序耦合。

6、综上，现有技术相互割裂，尚未出现整合超声无创促渗、低黏度胶原分级递送、透皮后时序原位光交联的一体化方案，难以同时兼顾无创给药、深层渗透、原位成型、稳定修复的需求，因此亟需开发新型超声辅助胶原透皮与时序交联修复技术。本发明因此将“递送”和“交联”在时序上分开：先以低黏度a组分完成第一阶段超声导入，再施用低黏度b组分完成第二阶段超声导入和界面混合；仅在两个递送阶段完成并停止超声后，才使两组分在皮肤组织目标区域形成第一动态网络，最后通过核黄素蓝光反应形成第二增强网络。

技术实现思路

1、一种光响应的胶原-多糖透皮原位交联材料包括储存阶段相互分离的a组分和b组分；所述a组分为递送型胶原前体，至少包含0.3-10 kda短链胶原片段、10-100 kda长链胶原片段以及核黄素或核黄素衍生物，还可包含甲基丙烯酰基和/或丙烯酰基修饰的胶原片段；所述b组分为交联型多糖前体，至少包含醛基化改性多糖，还可包含含可聚合不饱和基团的改性多糖。

2、上述材料的使用方式为：先施用a组分并进行第一阶段超声促渗，再施用b组分并进行第二阶段超声促渗或超声介导的局部传质与界面混合；停止超声后，胶原游离氨基与多糖醛基反应构建动态共价第一网络；最后经420-480 nm蓝光照射，由核黄素或其衍生物介导形成胶原光化学交联的第二增强网络。

3、优选地，所述a组分作为递送型胶原前体，由0.3-10 kda（优选为0.3-5 kda）短链胶原片段、可选的10-100 kda（优选为20-80 kda）长链胶原片段、部分官能化胶原，以及核黄素或核黄素衍生物组成；其中以胶原片段总干重计算，短链胶原片段与长链胶原片段的质量比为(20:80)-(80:20)；所述b组分作为交联型多糖前体，至少包含醛基化多糖，还可进一步包含经甲基丙烯酰化、丙烯酰化修饰或带有其他可聚合不饱和基团的改性多糖。

4、优选地，所述胶原片段选自i型胶原、ⅲ型胶原或二者组合；至少部分长链胶原片段接有甲基丙烯酰基、丙烯酰基中的一种或两种官能团，官能化度为5%-40%，且官能化后剩余游离氨基占初始游离氨基的30%-90%。

5、优选地，所述醛基化改性多糖选自醛基化透明质酸、醛基化硫酸软骨素、醛基化葡聚糖、醛基化普鲁兰多糖中的一种或多种，醛基化度为5%-45%，分子量优选1-80 kda，更优选5-30 kda；所述含可聚合不饱和基团的改性多糖选自甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化硫酸软骨素、丙烯酰化透明质酸、丙烯酰化硫酸软骨素中的一种或多种，官能化度为5%-50%。

6、优选地，a组分、b组分完全接触后体系总固含量为0.5%-15%（w/w），胶原片段与多糖总质量比为1:(0.1-2.0)，体系ph值为6.0-7.8；核黄素或其衍生物终浓度为0.005%-0.20%（w/w）；a组分递送阶段黏度低于a组分、b组分形成第一网络后的体系黏度。

7、优选地，所述a组分、b组分采用双腔容器、双瓶、双筒推注器、双袋或带隔离膜的多腔包装独立分装；所述材料还含有甘油、丙二醇、海藻糖、无机盐、缓冲组分、氨基酸、防腐剂中的一种或多种助剂。

8、优选地，a组分和b组分均在未与另一组分预混的低黏度状态下进行超声促渗。第一阶段超声用于提高角质层通透性并促进胶原片段向目标区域迁移；第二阶段超声用于促进醛基化多糖及可选光反应多糖向同一目标区域迁移，同时增强其与胶原片段的界面接触。两阶段可采用相同或不同频率、强度、占空比、耦合方式和作用时间，并通过停止超声将递送阶段与成网阶段分隔。

9、优选地，完成a组分第一阶段超声递送后，移除或摊薄皮肤表面过量a组分，再在同一区域施加b组分并实施第二阶段超声促渗，使醛基化多糖与a组分中的游离氨基、已进入角质层下方的胶原片段以及皮肤组织界面处可接触的胶原相关反应位点充分接触；停止超声并静置1 min-10 min后，醛基化多糖与胶原游离氨基形成可逆亚胺键/席夫碱型动态共价连接，同时伴随氢键作用与链缠结效应，形成具备局部定位能力的第一网络。

10、优选地，再通过核黄素-蓝光作用形成第二增强网络：在第二阶段超声停止且第一网络形成或开始形成后，采用420-480 nm（优选为440-470 nm）的蓝光进行照射。

11、优选地，a组分、b两组分的制备及改性步骤如下：

12、s1、胶原分级：将i型和/或ⅲ型胶原配制为0.5%-2.0%（w/v）的酸性分散液，在4-20℃条件下，采用胃蛋白酶、胶原酶受控处理或其他限制性水解方式进行断链；反应达到目标黏度或分子量分布后终止反应；采用截留范围为1 kda、3 kda、10 kda、30 kda或100 kda的膜组件组合进行分级，再根据gpc、sds-page或lc-ms结果调整分离区间，最终得到可用于经皮递送的短链胶原组分和用于结构支撑的长链胶原组分。

13、s2、胶原部分官能化：将长链胶原片段溶解于ph 8.0-9.0的缓冲体系，在0-10℃条件下缓慢加入甲基丙烯酸酐或其他可引入不饱和基团的活化试剂，通过控制加料量和反应时间，将官能化度维持在5%-40%，同时保留足够的游离氨基用于第一网络形成；反应结束后经透析、脱盐、冻干处理备用。

14、s3、醛基化多糖：以透明质酸、硫酸软骨素、葡聚糖或普鲁兰多糖为原料，先通过降解或分级获得1-80 kda，进一步优选为5-30 kda的递送/界面反应型多糖组分，再采用高碘酸盐进行受控氧化；反应结束后加入乙二醇或其他适当终止剂终止反应，经透析、超滤纯化后，得到醛基化度为5%-45%的醛基化多糖。

15、s4、光反应多糖：将透明质酸、硫酸软骨素或其他含羟基/氨基的多糖进行甲基丙烯酰化或丙烯酰化修饰，获得官能化度为5%-50%的光反应多糖；该组分可与醛基化多糖分开制备后，共同配制到b组分中。

16、s5、a组分配制：将短链胶原片段、可选的长链胶原片段、可选的官能化胶原片段以及核黄素-5-磷酸钠溶于ph 6.0-7.8的缓冲液中，使a组分在递送阶段保持可涂布、可铺展的低黏度状态。

17、s6、b组分配制：将醛基化多糖和可选的光反应多糖溶于ph 6.0-7.8的缓冲液中。a组分、b组分分别采用适用于高分子材料的除菌和低生物负载工艺处理后，避光分装储存。

18、优选地，在离体皮肤或皮肤等效模型表面施加a组分，并采用20-100 khz低频超声、0.5-3 mhz超声或二者的顺序组合进行第一阶段促渗；通过控制频率、输出强度、占空比、作用时间和耦合层厚度，使至少部分胶原片段获得可检测的角质层以下分布。该阶段的目标是完成胶原前体递送并维持低黏度，而非提前形成高黏度网络。

19、优选地，a组分完成主要递送后，在同一区域施加b组分，并采用20-100 khz低频超声、0.5-3 mhz超声或二者的顺序组合进行第二阶段促渗和局部传质，使醛基化多糖向皮肤组织内部迁移并与胶原游离氨基充分接触。第二阶段结束后停止超声，静置1 min-10 min，使氨基—醛基动态共价网络逐步形成。

20、优选地，在第二阶段超声停止且第一网络形成或开始形成后，采用420-480 nm（优选440-470 nm）的蓝光进行照射，使核黄素介导胶原发生光化学交联；若体系中存在甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化硫酸软骨素等含可聚合不饱和基团的光反应前体，核黄素通过i型反应产生的自由基中间体可引发上述前体发生自由基聚合，进一步形成额外共价连接并构成第二增强网络。

21、有益效果

22、（1）将a组分超声递送、b组分超声递送与交联固化在时间上分开，避免a组分、b组分在递送前提前发生反应，防止体系黏度升高和有效成分扩散受限。

23、（2）通过短链/长链胶原的分子量差异实现功能分工，同时兼顾经皮递送效率和最终网络的结构支撑能力，解决了单一低分子组分成网能力不足、单一高分子组分递送阻力过大的问题。

24、（3）通过第二阶段超声使交联型多糖前体到达与胶原前体相同或相邻的皮肤目标区域，再形成氨基—醛基动态第一网络，提高两类前体的空间匹配、局部定位与初始结构稳定性。

25、（4）在停止超声并形成第一网络后，利用核黄素与420-480 nm蓝光构建第二增强网络，提升复合网络的模量、耐溶胀性、耐酶降解性与结构保持能力。