一种用于鼻腔微生态保健的生物修护制剂提取工艺的制作方法

本发明涉及生物医药相关，尤其涉及一种用于鼻腔微生态保健的生物修护制剂提取工艺。

背景技术：

1、鼻腔微生态由葡萄球菌、棒状杆菌、莫拉菌等固有菌群与鼻黏膜共同维持，其结构稳态直接参与变应性鼻炎、慢性鼻窦炎及上呼吸道感染的防御与修复过程。近年研究表明，通过外源生物活性组分调节鼻腔微生态、促进受损黏膜修复，较传统激素或广谱抗菌路径更具生理兼容性。此类生物修护制剂的核心前提，是从微生物发酵液中提取出兼具黏膜亲和性与微生态调节活性的有效组分。以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等安全级微生物为起始物的发酵提取物，因含外囊泡、胞外多糖、抑菌肽等热敏性活性分子，且该类分子多分布于30–100kda分子量区间，对温度、有机溶剂及复配时机敏感，故提取工艺的节点设计直接决定终产物的安全性与保健功效。

2、现有公开方案中，较接近者有二：其一，厚德祖康生物制药有限公司公告号为cn118453792b的专利提出一种用于鼻腔消炎杀菌的中药组合物提取工艺，于10～20mpa加压状态下将橘红、桑葚、益智仁经氨水溶液浸泡，再加水100～110℃回流提取、浓盐酸调ph3.2～4.5、二氯甲烷/乙酸乙酯/氯仿有机萃取后干燥；该工艺采用高温回流与有机溶剂萃取，导致热敏多糖及肽类活性损失，且有机残留不满足鼻腔外用制剂安全要求，未涉及微生物源活性片段的分子量级定向分离。其二，华熙生物科技股份有限公司公告号为cn111743922a的专利提出透明质酸或其盐（50～80wda）与β-葡聚糖寡糖、维生素c后期复配以提升益生菌在鼻腔中的定植与活性；该方案工艺节点落在制剂阶段复配，而非提取阶段对发酵液本身进行杂质去除与30–100kda活性片段富集，终产物仍为活菌体系，未解决发酵提取过程中致敏大分子与小分子代谢废物共存的问题。此外，其他已公开方案（如人源成纤维细胞条件上清复配凝胶、益生菌与鼻腔固有菌现场分装混合、益生菌菌粉与低聚异麦芽糖基质复配等）亦均未公开“限氧胁迫发酵—低温破壁—复合酶解—30–100kda切向流超滤定向富集—脱内毒素—末端共冻干”这一完整工艺链。

3、故此，针对现有提取工艺存在的无法兼顾热敏活性保全与杂质靶向去除、以及提取终点为全发酵液导致鼻腔耐受性差的问题，故此，需要一种用于鼻腔微生态保健的生物修护制剂提取工艺。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于鼻腔微生态保健的生物修护制剂提取工艺，以解决上述背景技术中提出的现有提取工艺存在的无法兼顾热敏活性保全与杂质靶向去除、以及提取终点为全发酵液导致鼻腔耐受性差的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于鼻腔微生态保健的生物修护制剂提取工艺，以枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合发酵液为起始原料，依次通过限氧胁迫发酵、差速离心预处理、低温破壁、复合酶解、差速切向流超滤定向富集、脱内毒素、共冻干步骤制备得到生物修护制剂提取物，具体包括：

3、（a）限氧胁迫发酵：将枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌接种至含分子量不大于10kda透明质酸寡糖的诱导培养基中，于35～38℃、限氧条件下发酵36～48h，收集发酵液；所述透明质酸寡糖作为信号分子可诱导芽孢杆菌分泌外囊泡、胞外多糖及抑菌肽等活性组分，限氧环境可进一步提升活性片段的分泌量，该技术手段为本领域调控微生物次级代谢产物的公知方式。

4、（b）差速离心预处理：将发酵液于2～8℃依次以3000～5000×g离心10～20min、8000～12000×g离心15～30min，弃沉淀，收集含外囊泡的上清液；该步骤可去除发酵液中的完整菌体及大颗粒杂质，降低后续破壁工序的能耗，属于微生物分离领域的常规预处理手段。

5、（c）低温破壁：将步骤（b）所得上清液降温至不大于30℃，进行脉冲超声破壁处理；所述低温控制可避免外囊泡、胞外多糖等热敏性活性组分因温度升高发生变性失活，脉冲超声模式可减少局部过热，为本领域微生物破壁的公知优化手段。

6、（d）复合酶解：向破壁后物料中加入枯草蛋白酶与溶菌酶，二者质量比为1:0.6～1:1.2，于40～45℃、ph7.0～7.4条件下酶解1～2h，灭酶，得到酶解液；所述酶比及温ph参数为两种酶协同破革兰氏阳性菌细胞壁的最优区间，可高效释放壁结合的活性肽，酶解后灭酶处理可避免后续工序中酶活性对活性片段的降解。

7、（e）差速切向流超滤定向富集：将酶解液先经截留分子量100kda切向流超滤膜截留，弃去截留侧菌体碎片及高分子聚合体，取透过液；再将透过液经截留分子量30kda切向流超滤膜截留，收集截留侧组分，得到30～100kda分子量区间活性片段浓缩液；本领域公知，芽孢杆菌来源外囊泡粒径多为30～150nm、对应分子量30～100kda，该区间同时包含具有黏膜修复活性的功能性胞外多糖及抑菌肽，而＞100kda组分多为致敏性菌体碎片，＜30kda组分多为小分子代谢废物，该步骤可实现活性片段的靶向富集与杂质的同步去除，为核心创新节点。

8、（f）脱内毒素：将步骤（e）所得浓缩液依次通过阴离子交换树脂柱与注射用级活性炭柱处理，使产物细菌内毒素含量不大于0.5eu/ml；该内毒素限值为《中国药典》规定的鼻腔外用生物制剂的强制安全要求，离子交换结合活性炭的脱内毒素工艺为生物制品纯化的常规手段。

9、（g）共冻干：向脱内毒素后浓缩液中加入分子量不大于10kda的透明质酸寡糖与壳寡糖作为冻干保护剂，共冻干，得到生物修护制剂提取物；所述寡糖同时兼具冻干保护、黏膜修复及免疫调节活性，且于提取末端共处理而非制剂阶段复配，可保障寡糖与活性片段的结合稳定性，区别于现有后期复配提升定植的工艺路线。

10、所得提取物ph值为6.4～7.4，渗透压为280～320mosm/kg，无乙醇及苯酚残留，与人体鼻腔生理环境匹配，符合鼻腔外用制剂的安全规范。

11、进一步地，所述枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的接种质量比为1:0.5～1:2，诱导培养基中透明质酸寡糖的浓度为2～10g/l，该配比可最大化诱导活性片段的分泌，属于本领域常规优化范围。

12、进一步地，所述脉冲超声破壁的功率为200～400w，脉冲占空比1:1～1:3，单次处理时间10～30min，该参数窗口可在保障破壁效率的同时避免局部过热。

13、进一步地，所述切向流超滤的跨膜压力为0.1～0.3mpa，切向流速为0.5～2.0m/s，膜材质为聚醚砜或再生纤维素，该参数适配30～100kda活性片段的分离需求，为超滤工艺的常规设置。

14、进一步地，所述透明质酸寡糖与壳寡糖的质量比为2:1～5:1，共冻干保护剂总添加量为浓缩液固形物质量的5％～15％，该配比可最大化保障冻干后活性片段的稳定性。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

16、1.通过限氧胁迫发酵诱导芽孢杆菌定向分泌外囊泡、胞外多糖及抑菌肽等活性组分，配合≤30℃脉冲超声破壁、特定酶比下的复合酶解等低温工艺节点，避免了高温回流、有机溶剂萃取等对热敏性生物分子的结构破坏，可有效维持外囊泡的脂质膜完整性、胞外多糖的链长稳定性及抑菌肽的天然构象，保障各类活性组分进入鼻腔后仍能发挥预期的黏膜修复与微生态调节功能，同时全流程未引入氨水、强有机溶剂等风险性试剂，从源头上规避了化学残留带来的安全隐患。

17、2.通过“100kd预截留+30kd精截留”的差速切向流超滤工艺，实现了活性片段的定向富集：先通过100kd超滤膜截留去除菌体碎片、高分子致敏蛋白、不溶性聚合物等大分子量杂质，再通过30kd超滤膜截留去除游离核酸、小分子有机酸、内毒素前体等刺激性小分子废物，仅收集30–100kd区间的目标活性片段，该区间恰好覆盖芽孢杆菌源外囊泡、功能性胞外多糖及抗菌肽的有效分子量范围，相较传统全发酵液提取工艺，目标活性组分的占比显著提升，致敏性与刺激性杂质得到有效剔除，大幅降低了鼻腔给药后的不良反应风险。

18、3.所得提取物通过提取末端的参数调控与工艺设计，实现了与鼻腔生理环境的高度适配：提取物ph值稳定在6.4-7.4区间，与鼻腔黏液生理ph匹配，不会干扰鼻腔固有酸碱平衡，渗透压控制在280-320mosm/kg区间，属于等渗至轻微高渗范围，既避免低渗引发的鼻黏膜水肿，又可辅助减轻鼻炎状态下的黏膜肿胀，提取末端与透明质酸寡糖、壳寡糖共冻干的设计，既利用寡糖的冻干保护作用维持活性组分稳定性，又借助寡糖本身的黏膜保湿、修复特性，在鼻腔表面形成生物相容性保护层，且终产物为灭活的生物活性片段，不存在活菌制剂储运活性衰减、定植失控的风险，批间质量一致性优异，可直接作为安全稳定的原料用于鼻腔微生态保健制剂的制备。